使用基因编码的钙指示剂对病毒感染的人肠道类器官单层进行活体钙成像

摘要

该协议描述了一种在病毒感染的人肠道类器官中进行钙成像的方法，并提供了一种分析方法。

摘要

钙信号传导是几乎每个组织不可或缺的调节剂。在肠上皮细胞内，钙参与分泌活性、肌动蛋白动力学、炎症反应、干细胞增殖和许多其他未表征的细胞功能的调节。因此，绘制肠上皮内的钙信号动力学可以深入了解稳态细胞过程，并揭示对各种刺激的独特反应。人肠道类器官 （HIO） 是一种用于研究肠上皮的高通量人源模型，因此代表了研究钙动力学的有用系统。本文描述了一种使用基因编码钙指示剂 （GECI） 稳定转导 HIO 的方案，进行实时荧光显微镜检查，并分析成像数据以有意义地表征钙信号。作为代表性示例，用慢病毒转导三维 HIO 以稳定表达 GCaMP6s，这是一种基于绿色荧光蛋白的胞质 GECI。然后将工程化的HIO分散到单细胞悬浮液中，并作为单层接种。分化后，HIO单层感染轮状病毒和/或用已知刺激钙反应的药物治疗。装有温控加湿活体成像室的落射荧光显微镜可以对受感染或药物治疗的单层进行长期成像。成像后，使用免费提供的分析软件ImageJ分析采集的图像。总体而言，这项工作建立了一个适应性强的管道，用于表征HIO中的细胞信号转导。

引言

钙是一种广泛保守的第二信使，在调节细胞生理学中起着关键作用¹。鉴于其电荷强、体积小、在生理条件下溶解度高，钙是蛋白质构象的理想操纵剂。这使得钙成为将电化学信号转导为酶促、转录或转录后改变的有力手段。内质网 （ER） 和质膜上严格的钙浓度梯度产生了高驱动力，允许胞质钙浓度快速变化。多种机制，包括缓冲和主动运输，都紧紧地维持了这种梯度。虽然这种维持对于正常的细胞功能是必要的，但这种维持在能量上是昂贵的，使其在压力状态下特别容易受到 ^{影响 2}.

因此，胞质溶胶内钙的失调是多种细胞应激的近乎普遍的信号。代谢紊乱、毒素、病原体、机械损伤和遗传扰动都会破坏钙信号传导。无论刺激如何，在全细胞水平上，胞质钙的持续、不受控制的升高都会促进细胞凋亡并最终导致坏死 ^3,4。然而，较低振幅或较高频率的胞质钙水平的改变具有不同的影响²。同样，钙波动的结果可能因发生钙波动的空间微域而异⁵.因此，监测钙水平可以深入了解动态信号转导过程，但这需要具有相对较高的时间和空间分辨率的采样。

基因编码钙指示剂 （GECI） 是在活细胞系统中连续采样的有力工....

研究方案

本方案和代表性实验中使用的所有人类肠道类器官（HIO）均来源于德克萨斯医学中心消化疾病类肠核心获得和维护的人体组织。所有样本均根据贝勒医学院机构审查委员会批准的方案收集。

1.材料和试剂的制备

1. 对于类器官维持，收集细胞培养处理的 24 孔板、基底膜基质 （BMM）、15 mL 锥形管和 1.5 mL 锥形管。
   1. 为了制备不含生长因子 （CMGF-） 的完整培养基，向 500 mL 高级 DMEM F12 中加入 5 mL 1M HEPES、5 mL 100x 抗生素-抗真菌剂、5 mL 100x 谷氨酰胺补充剂。
   2. 要制备含 Wnt、R-spondin 和 Noggin 的 （WRNE） 培养基，混合等量的 CMGF 和 Wnt 条件培养基，加入 Noggin 条件培养基（按体积计 10%）、R-spondin 条件培养基（按体积计 20%）、50 ng/mL 人表皮生长因子、10 mM 烟酰胺、10 nM [Leu15]-胃泌素 I、500 nM A-83-01、10 μM SB202190、1x B27 添加剂、1x N2 添加剂和 1 mM N-乙酰半胱氨酸。
2. 对于慢病毒转导，制备胎牛血清 （FBS）、0.05% 胰蛋白酶-EDTA 在 1x 磷酸盐缓冲盐水 （PBS） 中、CMGF-和 10% FBS、无菌 1x PBS、聚布苯乙烯、10 ....

讨论

胞质 Ca²⁺ 水平的改变可能是上皮内病理的原因和结果 10,16,17。胞质钙的增加可以通过激活钙依赖性氯离子通道直接驱动分泌TMEM16A^18,19。响应于 Ca²⁺ 的 TMEM16A 激活允许氯化物的顶端流出，建立促进液体分泌的渗透梯度^20,21。?.......

材料

Name	Company	Catalog Number	Comments
Advanced DMEM F12	Gibco	12634028
[Leu15]-Gastrin I	Sigma-Aldrich	G9145
0.05% Trypsin EDTA	Gibco	25300054
0.05% Trypsin EDTA	Gibco	25300054
1.5mL microcentrifuge tubes	Fisherbrand	5408137
15mL conical tubes	Thermofisher Scientific	0553859A
16% formaldehyde	Thermofisher Scientific	28906
1M HEPES	Gibco	15630080
1M HEPES	Gibco	15630080
1X PBS	Corning	21-040-CV
25 gauge needle	Thermofisher Scientific	1482113D
A-83-01	Tocris	2939
ADP	Sigma-Aldrich	A2754
Advanced DMEM F12	Gibco	12634028
Antibiotic-antimycocytic	Gibco	15240062
Antibiotic-antimycotic	Gibco	15240062
B27 Supplement	Gibco	17504-044
Bovine serum albumin	FisherScientific	BP1600100
CellView Cell Culture Slide, PS, 75/25 MM, Glass Bottom, 10 compartments	Greiner	543979
Collagen IV	Sigma Aldrich	C5533
DAPI	Thermofisher Scientific	D1306
EDTA	Corning	46-034-CI
Fetal bovine serum	Corning	35010CV
Fetal bovine serum	Corning	35010CV
Fluorobrite	Gibco	A1896701
GlutaMAX	Gibco	35050079
GlutaMAX	Gibco	35050079
Human epidermal growth factor	ProteinTech	HZ-1326
Lentivirus	VectorBuilder	(variable)
Matrigel	BD Biosceicen	356231/CB40230C
N2 Supplement	Gibco	17502-048
N-acetylcysteine	Sigma-Aldrich	A9165-5G
NH4Cl	Sigma-Aldrich	A9434
Nicotinamide	Sigma-Aldrich	N0636
Nunc Cell Culture Treated 24-well Plates	Thermofisher Scientific	142475
Polybrene	MilliporeSigma	TR1003G
SB202190	Sigma-Aldrich	S70767
Triton X-100	Fisher BioReagents	BP151100
TrypLE Express Enzyme, no phenol red	Thermofisher Scientific	12604013
Trypsin	Worthington Biochemical	NC9811754
Y-27632	Tocris	1254