Live-Kalzium-Bildgebung von virusinfizierten humanen Darm-Organoid-Monolayern unter Verwendung genetisch kodierter Kalziumindikatoren

Zusammenfassung

Dieses Protokoll beschreibt einen Ansatz zur Durchführung von Kalzium-Bildgebung in virusinfizierten menschlichen Darmorganoiden und bietet einen Ansatz für die Analyse.

Zusammenfassung

Die Kalziumsignalisierung ist ein integraler Regulator fast jedes Gewebes. Im Darmepithel ist Kalzium an der Regulierung der sekretorischen Aktivität, der Aktindynamik, der Entzündungsreaktionen, der Stammzellproliferation und vieler anderer nicht charakterisierter zellulärer Funktionen beteiligt. Daher kann die Kartierung der Kalzium-Signaldynamik im Darmepithel Einblicke in homöostatische zelluläre Prozesse geben und einzigartige Reaktionen auf verschiedene Reize aufdecken. Humane intestinale Organoide (HIOs) sind ein vom Menschen abgeleitetes Hochdurchsatzmodell zur Untersuchung des Darmepithels und stellen somit ein nützliches System zur Untersuchung der Kalziumdynamik dar. In diesem Artikel wird ein Protokoll beschrieben, um HIOs mit genetisch kodierten Kalziumindikatoren (GECIs) stabil zu transduzieren, Live-Fluoreszenzmikroskopie durchzuführen und Bilddaten zu analysieren, um Kalziumsignale aussagekräftig zu charakterisieren. Als repräsentatives Beispiel wurden 3-dimensionale HIOs mit Lentivirus transduziert, um GCaMP6s, eine grün fluoreszierende Protein-basierte zytosolische GECI, stabil zu exprimieren. Die entwickelten HIOs wurden dann in einer einzelligen Suspension dispergiert und als Monolagen ausgesät. Nach der Differenzierung wurden die HIO-Monolayer mit Rotaviren infiziert und/oder mit Medikamenten behandelt, von denen bekannt ist, dass sie eine Kalziumreaktion stimulieren. Ein Epifluoreszenzmikroskop, das mit einer temperaturkontrollierten, befeuchteten Live-Imaging-Kammer ausgestattet war, ermöglichte die Langzeitbildgebung von infizierten oder medikamentös behandelten Monoschichten. Im Anschluss an die Bildgebung wurden die aufgenommenen Bilder mit der frei verfügbaren Analysesoftware ImageJ analysiert. Insgesamt etabliert diese Arbeit eine anpassungsfähige Pipeline zur Charakterisierung zellulärer Signaltransduktion in HIOs.

Einleitung

Kalzium ist ein weit verbreiteter sekundärer Botenstoff, der eine entscheidende Rolle bei der Regulierung der Zellphysiologie spielt¹. Aufgrund seiner starken Ladung, seiner geringen Größe und seiner hohen Löslichkeit unter physiologischen Bedingungen ist Kalzium ein idealer Manipulator der Proteinkonformation. Dies macht Kalzium zu einem leistungsstarken Mittel, um elektrochemische Signale in enzymatische, transkriptionelle oder posttranskriptionelle Veränderungen umzuwandeln. Die strengen Kalziumkonzentrationsgradienten über das endoplasmatische Retikulum (ER) und die Plasmamembranen erzeugen eine hohe Antriebskraft, die schnelle Änderungen d....

Protokoll

Alle menschlichen Darmorganoide (HIOs), die in diesem Protokoll und den repräsentativen Experimenten verwendet wurden, wurden aus menschlichem Gewebe gewonnen, das vom Texas Medical Center Digestive Diseases Enteroid Core gewonnen und gepflegt wurde. Alle Proben wurden in Übereinstimmung mit einem Protokoll entnommen, das vom Institutional Review Board am Baylor College of Medicine genehmigt wurde.

1. Vorbereitung von Materialien und Reagenzien

1. Für die Organoid-Wartung entnehmen Sie mit Zellkulturen behandelte 24-Well-Platten, Basalmembranmatrix (BMM), konische 15-ml-Röhrchen und 1,5-ml-konische Röhrchen.
   1. U....

Diskussion

Veränderungen des zytosolischen^Ca2+-Spiegels können sowohl Ursache als auch Wirkung von Pathologien innerhalb des Epithels sein 10,16,17. Ein Anstieg des zytosolischen Kalziums kann die Sekretion über die Aktivierung des kalziumabhängigen Chloridkanals direkt antreiben TMEM16A^18,19. Die Aktivierung von TMEM16A als Reaktion auf Ca²⁺ ermöglicht d.......

Materialien

Name	Company	Catalog Number	Comments
Advanced DMEM F12	Gibco	12634028
[Leu15]-Gastrin I	Sigma-Aldrich	G9145
0.05% Trypsin EDTA	Gibco	25300054
0.05% Trypsin EDTA	Gibco	25300054
1.5mL microcentrifuge tubes	Fisherbrand	5408137
15mL conical tubes	Thermofisher Scientific	0553859A
16% formaldehyde	Thermofisher Scientific	28906
1M HEPES	Gibco	15630080
1M HEPES	Gibco	15630080
1X PBS	Corning	21-040-CV
25 gauge needle	Thermofisher Scientific	1482113D
A-83-01	Tocris	2939
ADP	Sigma-Aldrich	A2754
Advanced DMEM F12	Gibco	12634028
Antibiotic-antimycocytic	Gibco	15240062
Antibiotic-antimycotic	Gibco	15240062
B27 Supplement	Gibco	17504-044
Bovine serum albumin	FisherScientific	BP1600100
CellView Cell Culture Slide, PS, 75/25 MM, Glass Bottom, 10 compartments	Greiner	543979
Collagen IV	Sigma Aldrich	C5533
DAPI	Thermofisher Scientific	D1306
EDTA	Corning	46-034-CI
Fetal bovine serum	Corning	35010CV
Fetal bovine serum	Corning	35010CV
Fluorobrite	Gibco	A1896701
GlutaMAX	Gibco	35050079
GlutaMAX	Gibco	35050079
Human epidermal growth factor	ProteinTech	HZ-1326
Lentivirus	VectorBuilder	(variable)
Matrigel	BD Biosceicen	356231/CB40230C
N2 Supplement	Gibco	17502-048
N-acetylcysteine	Sigma-Aldrich	A9165-5G
NH4Cl	Sigma-Aldrich	A9434
Nicotinamide	Sigma-Aldrich	N0636
Nunc Cell Culture Treated 24-well Plates	Thermofisher Scientific	142475
Polybrene	MilliporeSigma	TR1003G
SB202190	Sigma-Aldrich	S70767
Triton X-100	Fisher BioReagents	BP151100
TrypLE Express Enzyme, no phenol red	Thermofisher Scientific	12604013
Trypsin	Worthington Biochemical	NC9811754
Y-27632	Tocris	1254