Imagem de cálcio vivo de monocamadas organoides intestinais humanas infectadas por vírus usando indicadores de cálcio codificados geneticamente

Resumo

Este protocolo descreve uma abordagem para a realização de imagens de cálcio em organoides intestinais humanos infectados por vírus e oferece uma abordagem para análise.

Resumo

A sinalização de cálcio é um regulador integral de quase todos os tecidos. Dentro do epitélio intestinal, o cálcio está envolvido na regulação da atividade secretora, dinâmica da actina, respostas inflamatórias, proliferação de células-tronco e muitas outras funções celulares não caracterizadas. Como tal, o mapeamento da dinâmica de sinalização do cálcio dentro do epitélio intestinal pode fornecer informações sobre os processos celulares homeostáticos e revelar respostas únicas a vários estímulos. Os organoides intestinais humanos (HIOs) são um modelo de alto rendimento, derivado do ser humano, para estudar o epitélio intestinal e, portanto, representam um sistema útil para investigar a dinâmica do cálcio. Este artigo descreve um protocolo para transduzir HIOs de forma estável com indicadores de cálcio codificados geneticamente (GECIs), realizar microscopia de fluorescência ao vivo e analisar dados de imagem para caracterizar significativamente os sinais de cálcio. Como um exemplo representativo, HIOs 3-dimensionais foram transduzidos com lentivírus para expressar de forma estável GCaMP6s, um GECI citosólico baseado em proteína fluorescente verde. Os HIOs projetados foram então dispersos em uma suspensão de célula única e semeados como monocamadas. Após a diferenciação, as monocamadas de HIO foram infectadas com rotavírus e/ou tratadas com drogas conhecidas por estimular uma resposta de cálcio. Um microscópio de epifluorescência equipado com uma câmara de imagem viva umidificada e com temperatura controlada permitiu a obtenção de imagens de longo prazo de monocamadas infectadas ou tratadas com drogas. Após a aquisição de imagem, as imagens adquiridas foram analisadas usando o software de análise disponível gratuitamente, ImageJ. De modo geral, este trabalho estabelece um pipeline adaptável para caracterizar a sinalização celular em HIOs.

Introdução

O cálcio é um segundo mensageiro amplamente conservado que desempenha um papel crítico na regulação da fisiologia celular¹. Dada a sua forte carga, tamanho pequeno e alta solubilidade em condições fisiológicas, o cálcio é um manipulador ideal da conformação proteica. Isso torna o cálcio um meio poderoso para transduzir sinais eletroquímicos em alterações enzimáticas, transcricionais ou pós-transcricionais. Os rígidos gradientes de concentração de cálcio através do retículo endoplasmático (RE) e membranas plasmáticas criam uma alta força motriz que permite mudanças rápidas na concentração citosólica de cálcio. Vários mecanismos, incluindo buffer....

Protocolo

Todos os organoides intestinais humanos (HIOs) utilizados neste protocolo e os experimentos representativos foram derivados de tecido humano obtido e mantido pelo Texas Medical Center Digestive Diseases Enteroid Core. Todas as amostras foram coletadas de acordo com um protocolo aprovado pelo Comitê de Ética em Pesquisa da Baylor College of Medicine.

1. Preparação de materiais e reagentes

1. Para manutenção dos organoides, coletar placas de 24 poços tratadas com cultura celular, matriz de membrana basal (BMM), tubos cônicos de 15 mL e tubos cônicos de 1,5 mL.
   1. Para preparar meios completos sem fatores de crescim....

Discussão

Alterações nos níveis citosólicos de Ca²⁺ podem ser causa e efeito de patologias do epitélio 10,16,17. O aumento do cálcio citosólico pode direcionar diretamente a secreção via ativação do canal de cloreto cálcio-dependente TMEM16A^18,19. A ativação do TMEM16A em resposta ao Ca²⁺ permite o efluxo apical de cloreto, estabelecendo um grad.......

Materiais

Name	Company	Catalog Number	Comments
Advanced DMEM F12	Gibco	12634028
[Leu15]-Gastrin I	Sigma-Aldrich	G9145
0.05% Trypsin EDTA	Gibco	25300054
0.05% Trypsin EDTA	Gibco	25300054
1.5mL microcentrifuge tubes	Fisherbrand	5408137
15mL conical tubes	Thermofisher Scientific	0553859A
16% formaldehyde	Thermofisher Scientific	28906
1M HEPES	Gibco	15630080
1M HEPES	Gibco	15630080
1X PBS	Corning	21-040-CV
25 gauge needle	Thermofisher Scientific	1482113D
A-83-01	Tocris	2939
ADP	Sigma-Aldrich	A2754
Advanced DMEM F12	Gibco	12634028
Antibiotic-antimycocytic	Gibco	15240062
Antibiotic-antimycotic	Gibco	15240062
B27 Supplement	Gibco	17504-044
Bovine serum albumin	FisherScientific	BP1600100
CellView Cell Culture Slide, PS, 75/25 MM, Glass Bottom, 10 compartments	Greiner	543979
Collagen IV	Sigma Aldrich	C5533
DAPI	Thermofisher Scientific	D1306
EDTA	Corning	46-034-CI
Fetal bovine serum	Corning	35010CV
Fetal bovine serum	Corning	35010CV
Fluorobrite	Gibco	A1896701
GlutaMAX	Gibco	35050079
GlutaMAX	Gibco	35050079
Human epidermal growth factor	ProteinTech	HZ-1326
Lentivirus	VectorBuilder	(variable)
Matrigel	BD Biosceicen	356231/CB40230C
N2 Supplement	Gibco	17502-048
N-acetylcysteine	Sigma-Aldrich	A9165-5G
NH4Cl	Sigma-Aldrich	A9434
Nicotinamide	Sigma-Aldrich	N0636
Nunc Cell Culture Treated 24-well Plates	Thermofisher Scientific	142475
Polybrene	MilliporeSigma	TR1003G
SB202190	Sigma-Aldrich	S70767
Triton X-100	Fisher BioReagents	BP151100
TrypLE Express Enzyme, no phenol red	Thermofisher Scientific	12604013
Trypsin	Worthington Biochemical	NC9811754
Y-27632	Tocris	1254