Визуализация кальция в режиме реального времени инфицированных вирусом монослоев органоидов кишечника человека с использованием генетически кодируемых кальциевых индикаторов

Резюме

Этот протокол описывает подход к выполнению визуализации кальция в инфицированных вирусом органоидах кишечника человека и предлагает подход к анализу.

Аннотация

Кальциевая сигнализация является неотъемлемым регулятором практически каждой ткани. В кишечном эпителии кальций участвует в регуляции секреторной активности, динамики актина, воспалительных реакций, пролиферации стволовых клеток и многих других нехарактерных клеточных функций. Таким образом, картирование динамики передачи сигналов кальция в кишечном эпителии может дать представление о гомеостатических клеточных процессах и выявить уникальные реакции на различные стимулы. Органоиды кишечника человека (HIO) представляют собой высокопроизводительную модель для изучения кишечного эпителия и, таким образом, представляют собой полезную систему для исследования динамики кальция. В данной статье описывается протокол для стабильной трансдукции HIO с генетически кодируемыми кальциевыми индикаторами (GECI), выполнения флуоресцентной микроскопии в реальном времени и анализа данных визуализации для осмысленной характеристики сигналов кальция. В качестве репрезентативного примера можно привести 3-мерные HIO, трансдуцированные лентивирусом для стабильной экспрессии GCaMP6s, цитозольного GECI на основе зеленого флуоресцентного белка. Затем сконструированные HIO были диспергированы в одноклеточную суспензию и высеяны в виде монослоев. После дифференцировки монослои HIO инфицировали ротавирусом и/или лечили препаратами, которые, как известно, стимулируют кальциевый ответ. Эпифлуоресцентный микроскоп, оснащенный камерой для визуализации в реальном времени с регулируемой температурой, позволил получить долгосрочную визуализацию инфицированных или обработанных лекарственными препаратами монослоев. После получения изображений полученные изображения были проанализированы с помощью свободно доступного аналитического программного обеспечения ImageJ. В целом, эта работа создает адаптируемый конвейер для характеристики клеточной сигнализации в HIO.

Введение

Кальций является широко консервативным вторичным мессенджером, который играет важнейшую роль в регуляции клеточной физиологии¹. Учитывая его сильный заряд, небольшой размер и высокую растворимость в физиологических условиях, кальций является идеальным манипулятором конформации белка. Это делает кальций мощным средством для преобразования электрохимических сигналов в ферментативные, транскрипционные или посттранскрипционные изменения. Строгие градиенты концентрации кальция в эндоплазматическом ретикулуме (ER) и плазматических мембранах создают высокую движущую силу, которая позволяет быстро изменять концентрацию цитозольного кальция. Многочислен....

протокол

Все органоиды кишечника человека (HIO), использованные в этом протоколе и репрезентативных экспериментах, были получены из тканей человека, полученных и поддерживаемых Техасским медицинским центром по заболеваниям пищеварительной системы. Все образцы были собраны в соответствии с протоколом, утвержденным Институциональным наблюдательным советом Медицинского колледжа Бэйлора.

1. Подготовка материалов и реагентов

1. Для поддержания органоидов соберите обработанные клеточной культурой 24-луночные планшеты, матрицу базальной мембраны (BMM), конические пробирки объемом 15 мл и конические пробирки объемом 1,5 мл.
   1. Дл....

Результаты

На рисунке 1А показан купол BMM, содержащий 3-мерные органоиды кишечника человека, которые были трансдуцированы для стабильной экспрессии GCaMP6. На рисунке 1B показана та же линия органоида, покрытая в виде монослоя через 24, 48 и 72 ч после посева. Для валидации ф.......

Обсуждение

Изменения цитозольного уровня^Ca2+ могут быть как причиной, так и следствием патологий в эпителии 10,16,17. Увеличение цитозольного кальция может напрямую стимулировать секрецию через активацию кальций-зависимого хлоридного канала TM.......

Материалы

Name	Company	Catalog Number	Comments
Advanced DMEM F12	Gibco	12634028
[Leu15]-Gastrin I	Sigma-Aldrich	G9145
0.05% Trypsin EDTA	Gibco	25300054
0.05% Trypsin EDTA	Gibco	25300054
1.5mL microcentrifuge tubes	Fisherbrand	5408137
15mL conical tubes	Thermofisher Scientific	0553859A
16% formaldehyde	Thermofisher Scientific	28906
1M HEPES	Gibco	15630080
1M HEPES	Gibco	15630080
1X PBS	Corning	21-040-CV
25 gauge needle	Thermofisher Scientific	1482113D
A-83-01	Tocris	2939
ADP	Sigma-Aldrich	A2754
Advanced DMEM F12	Gibco	12634028
Antibiotic-antimycocytic	Gibco	15240062
Antibiotic-antimycotic	Gibco	15240062
B27 Supplement	Gibco	17504-044
Bovine serum albumin	FisherScientific	BP1600100
CellView Cell Culture Slide, PS, 75/25 MM, Glass Bottom, 10 compartments	Greiner	543979
Collagen IV	Sigma Aldrich	C5533
DAPI	Thermofisher Scientific	D1306
EDTA	Corning	46-034-CI
Fetal bovine serum	Corning	35010CV
Fetal bovine serum	Corning	35010CV
Fluorobrite	Gibco	A1896701
GlutaMAX	Gibco	35050079
GlutaMAX	Gibco	35050079
Human epidermal growth factor	ProteinTech	HZ-1326
Lentivirus	VectorBuilder	(variable)
Matrigel	BD Biosceicen	356231/CB40230C
N2 Supplement	Gibco	17502-048
N-acetylcysteine	Sigma-Aldrich	A9165-5G
NH4Cl	Sigma-Aldrich	A9434
Nicotinamide	Sigma-Aldrich	N0636
Nunc Cell Culture Treated 24-well Plates	Thermofisher Scientific	142475
Polybrene	MilliporeSigma	TR1003G
SB202190	Sigma-Aldrich	S70767
Triton X-100	Fisher BioReagents	BP151100
TrypLE Express Enzyme, no phenol red	Thermofisher Scientific	12604013
Trypsin	Worthington Biochemical	NC9811754
Y-27632	Tocris	1254