用于定量小 RNA 的 AQRNA-seq

摘要

绝对定量 RNA 测序 （AQRNA-seq） 是一种用于定量生物混合物中所有小 RNA 景观的技术。在这里，展示了 AQRNA-seq 的文库制备和数据处理步骤，量化了饥饿诱导休眠期间 牛分枝杆菌 BCG 中转移 RNA （tRNA） 库的变化。

摘要

AQRNA-seq 在生物样品中的测序读长计数和小 RNA 拷贝数之间提供直接的线性关系，从而能够准确定量小 RNA 库。此处描述的 AQRNA-seq 文库制备程序涉及使用定制设计的测序接头和减少甲基化 RNA 修饰的步骤，这些修饰会阻断逆转录持续合成能力，从而增加全长 cDNA 的产量。此外，还介绍了随附的生物信息学管道的详细实施。AQRNA-seq 的演示是通过对牛 分枝杆菌 BCG 中的 45 个 tRNA 进行定量分析来进行的，这些 tRNA 是在 20 天的营养剥夺和 6 天的复苏过程中在 5 天的选定时间内收获的。本文还将讨论为提高 AQRNA-seq 的效率和严谨性而做出的持续努力。这包括探索避免凝胶纯化以减轻 PCR 扩增后引物二聚体问题的方法，以及增加全长读长的比例以实现更准确的读长映射。AQRNA-seq 的未来增强功能将侧重于促进该技术的自动化和高通量实施，以量化来自不同生物体的细胞和组织样本中的所有小 RNA。

引言

下一代测序 （NGS），也称为大规模平行测序，是一种 DNA 测序技术，涉及 DNA 片段化、接头寡核苷酸连接、基于聚合酶链反应 （PCR） 的扩增、DNA 测序以及将片段序列重组到基因组中。NGS 对 RNA 测序的适应 （RNA-seq） 是鉴定和定量 RNA 转录本及其变体的有力方法¹。RNA 文库制备工作流程和生物信息学分析管道的创新发展，加上实验室仪器的进步，扩展了 RNA-seq 的应用范围，从外显子组测序发展到高级功能组学，如非编码 RNA 分析²、单细胞分析³、空间转录组学 ^4,5、选择性剪接分析⁶等。这些先进的 RNA-seq 方法通过定量分析正常和患病细胞和组织中的转录组来揭示复杂的 RNA 功能。

尽管 RNA-seq 取得了这些进展，但几个关键技术特征限制了该方法的定量能力。虽然大多数 RNA-seq 方法允许精确定量实验变量（即生物样品和/或生理状态）之间 RNA 水平的变化，但它们无法提供样品中 RNA 分子水平的定量比较。例如，大多数 RNA-seq 方法无法准确量化表达的 tRNA 细胞库中单个 tRNA 同受体分子的相对拷贝数。正如配套出....

研究方案

注意： 图 1 提供了 AQRNA-seq 文库制备所涉及的程序的图形说明。有关程序中使用的试剂、化学品和色谱柱/试剂盒的详细信息，请参阅 材料表。建议使用 （i） 3% 琼脂糖凝胶电泳，（ii） 用于生物分子样品质量控制的自动电泳工具（参见 材料表），以及 （iii） 紫外-可见分光光度法和/或荧光定量法，对输入 RNA 样品的纯度、完整性和数量进行全面评估。除非另有说明，否则所有反应物和预混液都必须放在冰上。将冷藏箱中的试剂（例如酶）运输到 -20 °C 储存和从 -20 °C 储存，以延长其保质期并避免文库中间体的多次冻融循环。

1. RNA 的去磷酸化

注：去除 5'-磷酸盐（P;供体）会阻止与 RNA 的 3'-羟基（OH;受体）自连接。接头不会自连接，因为它们的 3' 末端被修饰为掺入二脱氧胞苷 （Linker 1） 或间隔区 （Linker 2）。接头只能通过将其 5'-P 连接到 RNA 或 cDNA 的 3'-OH 来连接。

1. 在无菌 PCR 管（例如，200 μL 或 500 μL 管）中制备去磷酸化反应，添加多达 2 μL RNA 样品、0.5 μL 40 U/μL RNase 抑制剂、1 μL 0.5 μL 0.5 μL....

讨论

AQRNA-seq 文库制备工作流程旨在最大限度地捕获样品中的 RNA，并最大限度地减少逆转录过程中聚合酶的流失⁷。通过两步接头连接，新型 DNA 寡核苷酸（接头 1 和接头 2）被过量连接，以完全互补样品中的 RNA。RecJf 是一种对单链 DNA 具有特异性的 5' 至 3' 核酸外切酶，可有效去除多余的接头，同时保持连接的产物完好无损。此外，AlkB 处理减少了 RNA¹⁸ 上的甲基修饰?.......

材料

Name	Company	Catalog Number	Comments
2-ketoglutarate	Sigma-Aldrich	75890	Prepare a working solution (1 M) and store it at -20ºC
2100 Bioanalyzer Instrument	Agilent	G2938C
5'-deadenylase (50 U/μL)	New England Biolabs	M0331S (component #: M0331SVIAL)	Store at -20 °C
Adenosine 5'-Triphosphate (ATP)	New England Biolabs	M0437M (component #: N0437AVIAL)	NEB M0437M contains T4 RNA Ligase 1 (30 U/μL), T4 RNA Ligase Reaction Buffer (10X), PEG 8000 (1X), and ATP (100 mM); prepare a working solution (10 mM) and store it at -20ºC
AGAROSE GPG/LE	AmericanBio	AB00972-00500	Store at ambient temperature
Ammonium iron(II) sulfate hexahydrate	Sigma-Aldrich	F2262	Prepare a working solution (0.25 M) and store it at -20 °C
Bioanalyzer Small RNA Analysis	Agilent	5067-1548	The Small RNA Analysis is used for checking the quality of input RNAs and the efficiency of enzymatic reactions (e.g., Linker 1 ligation)
Bovine Serum Albumin (BSA; 10 mg/mL)	New England Biolabs	B9000	This product was discontinued on 12/15/2022 and is replaced with Recombinant Albumin, Molecular Biology Grade (NEB B9200).
Chloroform	Macron Fine Chemicals	4441-10
Demethylase	ArrayStar	AS-FS-004	Demethylase comes with the rtStar tRNA Pretreatment & First-Strand cDNA Synthesis Kit (AS-FS-004)
Deoxynucleotide (dNTP) Solution Mix	New England Biolabs	N0447L (component #: N0447LVIAL)	This dNTP Solution Mix contains equimolar concentrations of dATP, dCTP, dGTP and dTTP (10 mM each)
Digital Dual Heat Block	VWR Scientific Products	13259-052	Heating block is used with the QIAquick Gel Extraction Kit
DyeEx 2.0 Spin Kit	Qiagen	63204	Effective at removing short remnants (e.g., oligos less than 10 bp in length)
Electrophoresis Power Supply	Bio-Rad Labrotories	PowerPac 300
Eppendorf PCR Tubes (0.5 mL)	Eppendorf	0030124537
Eppendorf Safe-Lock Tubes (0.5 mL)	Eppendorf	022363611
Eppendorf Safe-Lock Tubes (1.5 mL)	Eppendorf	022363204
Eppendorf Safe-Lock Tubes (2 mL)	Eppendorf	022363352
Ethyl alcohol (Ethanol), Pure	Sigma-Aldrich	E7023	The pure ethanol is used with the Oligo Clean and Concentrator Kit from Zymo Research
Gel Imaging System	Alpha Innotech	FluorChem 8900
Gel Loading Dye, Purple (6X), no SDS	New England Biolabs	N0556S (component #: B7025SVIAL)	NEB N0556S contains Quick-Load Purple 50 bp DNA Ladder and Gel Loading Dye, Purple (6X), no SDS
GENESYS 180 UV-Vis Spectrophotometer	Thermo Fisher Scientific	840-309000	The spectrophotometer is used for measuring the oligo concentrations using the Beer's law
HEPES	Sigma-Aldrich	H4034	Prepare a working solution (1 M; pH = 8 with NaOH) and store it at -20 °C
Hydrochloric acid (HCl)	VWR Scientific Products	BDH3028	Prepare a working solution (5 M) and store it at ambient temperature
Isopropyl Alcohol (Isopropanol), Pure	Macron Fine Chemicals	3032-16	Isopropanol is used with the QIAquick Gel Extraction Kit
L-Ascorbic acid	Sigma-Aldrich	A5960	Prepare a working solution (0.5 M) and store it at -20ºC
Microcentrifuge	Eppendorf	5415D
NanoDrop 2000 Spectrophotometer	Thermo Fisher Scientific	ND-2000
NEBuffer 2 (10X)	New England Biolabs	M0264L (component #: B7002SVIAL)	NEB M0264L contains RecJf (30 U/μL) and NEBuffer 2 (10X); store at -20 °C
Nuclease-Free Water (not DEPC-Treated)	Thermo Fisher Scientific	AM9938
Oligo Clean & Concentrator Kit	Zymo Research	D4061	Store at ambient temperature
PEG 8000 (50% solution)	New England Biolabs	M0437M (component #: B1004SVIAL)	NEB M0437M contains T4 RNA Ligase 1 (30 U/μL), T4 RNA Ligase Reaction Buffer (10X), PEG 8000 (1X), and ATP (100 mM); prepare a working solution (10 mM) and store it at -20ºC
Peltier Thermal Cycler	MJ Research	PTC-200
Phenol:choloroform:isoamyl alcohol 25:24:1 pH = 5.2	Thermo Fisher Scientific	J62336
PrimeScript Buffer (5X)	TaKaRa	2680A
PrimeScript Reverse Transcriptase	TaKaRa	2680A
QIAquick Gel Extraction Kit	Qiagen	28704	This kit requires a heating block and isopropanol to work with
Quick-Load Purple 100 bp DNA Ladder	New England Biolabs	N0551S (component #: N0551SVIAL)
Quick-Load Purple 50 bp DNA Ladder	New England Biolabs	N0556S (component #: N0556SVIAL)	NEB N0556S contains Quick-Load Purple 50 bp DNA Ladder and Gel Loading Dye, Purple (6X), no SDS
RecJf (30 U/μL)	New England Biolabs	M0264L (component #: M0264LVIAL)	NEB M0264L contains RecJf (30 U/μL) and NEBuffer 2 (10X); store at -20 °C
RNase Inhibitor (murine; 40 U/μL)	New England Biolabs	M0314L (component #: M0314LVIAL)	Store at -20 °C
SeqAMP DNA Polymerase	TaKaRa	638509	TaKaRa 638509 contains SeqAMP DNA Polymerase and SeqAMP PCR Buffer (2X)
SeqAMP PCR Buffer (2X)	TaKaRa	638509	TaKaRa 638509 contains SeqAMP DNA Polymerase and SeqAMP PCR Buffer (2X)
Shrimp Alkaline Phosphatase (1 U/μL)	New England Biolabs	M0371L (component #: M0371LVIAL)
Sodium hydroxide (NaOH)	Sigma-Aldrich	S5881	Prepare a working solution (5 M) and store it at ambient temperature
T4 DNA Ligase (400 U/μL)	New England Biolabs	M0202L (component #: M0202LVIAL)	NEB M0202L contains T4 DNA Ligase (400 U/μL) and T4 DNA Ligase Reaction Buffer (10X)
T4 DNA Ligase Reaction Buffer (10X)	New England Biolabs	M0202L (component #: B0202SVIAL)	NEB M0202L contains T4 DNA Ligase (400 U/μL) and T4 DNA Ligase Reaction Buffer (10X)
T4 RNA Ligase 1 (30 U/μL)	New England Biolabs	M0437M (component #: M0437MVIAL)	NEB M0437M contains T4 RNA Ligase 1 (30 U/μL), T4 RNA Ligase Reaction Buffer (10X), PEG 8000 (1X), and ATP (100 mM)
T4 RNA Ligase Reaction Buffer (10X)	New England Biolabs	M0437M (component #: B0216SVIAL)	NEB M0437M contains T4 RNA Ligase 1 (30 U/μL), T4 RNA Ligase Reaction Buffer (10X), PEG 8000 (1X), and ATP (100 mM)