用于定量小 RNA 的 AQRNA-seq

摘要

绝对定量 RNA 测序 （AQRNA-seq） 是一种用于定量生物混合物中所有小 RNA 景观的技术。在这里，展示了 AQRNA-seq 的文库制备和数据处理步骤，量化了饥饿诱导休眠期间 牛分枝杆菌 BCG 中转移 RNA （tRNA） 库的变化。

摘要

AQRNA-seq 在生物样品中的测序读长计数和小 RNA 拷贝数之间提供直接的线性关系，从而能够准确定量小 RNA 库。此处描述的 AQRNA-seq 文库制备程序涉及使用定制设计的测序接头和减少甲基化 RNA 修饰的步骤，这些修饰会阻断逆转录持续合成能力，从而增加全长 cDNA 的产量。此外，还介绍了随附的生物信息学管道的详细实施。AQRNA-seq 的演示是通过对牛 分枝杆菌 BCG 中的 45 个 tRNA 进行定量分析来进行的，这些 tRNA 是在 20 天的营养剥夺和 6 天的复苏过程中在 5 天的选定时间内收获的。本文还将讨论为提高 AQRNA-seq 的效率和严谨性而做出的持续努力。这包括探索避免凝胶纯化以减轻 PCR 扩增后引物二聚体问题的方法，以及增加全长读长的比例以实现更准确的读长映射。AQRNA-seq 的未来增强功能将侧重于促进该技术的自动化和高通量实施，以量化来自不同生物体的细胞和组织样本中的所有小 RNA。

引言

下一代测序 （NGS），也称为大规模平行测序，是一种 DNA 测序技术，涉及 DNA 片段化、接头寡核苷酸连接、基于聚合酶链反应 （PCR） 的扩增、DNA 测序以及将片段序列重组到基因组中。NGS 对 RNA 测序的适应 （RNA-seq） 是鉴定和定量 RNA 转录本及其变体的有力方法¹。RNA 文库制备工作流程和生物信息学分析管道的创新发展，加上实验室仪器的进步，扩展了 RNA-seq 的应用范围，从外显子组测序发展到高级功能组学，如非编码 RNA 分析²、单细胞分析³、空间转录组学 ^4,5、选择性剪接分析⁶等。这些先进的 RNA-seq 方法通过定量分析正常和患病细胞和组织中的转录组来揭示复杂的 RNA 功能。

尽管 RNA-seq 取得了这些进展，但几个关键技术特征限制了该方法的定量能力。虽然大多数 RNA-seq 方法允许精确定量实验变量（即生物样品和/或生理状态）之间 RNA 水平的变化，但它们无法提供样品中 RNA 分子水平的定量比较。例如，大多数 RNA-seq 方法无法准确量化表达的 tRNA 细胞库中单个 tRNA 同受体分子的相对拷贝数。正如配套出版物⁷ 中所强调的那样，RNA-seq 的这种限制源于 RNA 结构的几个特征和文库制备的生物化学。例如，用于将 3'-和 5'-末端测序接头连接到 RNA 分子的连接酶的活性受 RNA 末端核苷酸和测序接头身份的强烈影响。这导致接头连接效率的巨大变化和测序读长的显著人为增加 ^8,9,10。

第二组限制来自 RNA 分子的固有结构特性。具体来说，表观转录组的数十种转录后 RNA 修饰中的 RNA 二级结构形成和动态变化会导致逆转录过程中聚合酶脱落或突变。这些错误会导致 cDNA 合成不完整或截短或 RNA 序列改变。虽然这两种现象都可用于绘制二级结构或一些修饰，但如果后续文库制备步骤无法捕获截短的 cDNA，或者数据处理丢弃与参考数据集不匹配的突变序列，它们会降低 RNA-seq 的定量准确性^11,12。此外，RNA 转录本的巨大化学、长度和结构多样性，以及缺乏均匀片段化长 RNA 的工具，降低了大多数 RNA-seq 方法对所有 RNA 种类的适用性¹³。

AQRNA-seq（绝对定量 RNA 测序）方法的开发是为了消除限制定量准确性的几个技术和生物学限制⁷。通过在 RNA 测序文库制备过程中最大限度地减少捕获、连接和扩增中的序列依赖性偏差，AQRNA-seq 实现了与其他方法相比的卓越线性，以 2 倍的准确度准确定量了 963 个 miRNA 参考文库的 75%。测序读长计数和 RNA 丰度的这种线性相关性也存在于对可变长度 RNA 寡核苷酸标准品库的分析中，以及参考 Northern 印迹等正交方法。建立测序读长计数和 RNA 丰度之间的线性使 AQRNA-seq 能够对样品中的所有 RNA 种类进行准确、绝对的定量。

以下是 AQRNA-seq 文库制备工作流程的协议和随附的下游数据分析管道的描述。该方法用于阐明牛分 枝杆菌 卡介苗 （BCG） 结核病模型中饥饿诱导休眠和随后复苏期间 tRNA 丰度的动力学。结果用于测序数据的探索性可视化，以及随后的聚类和差异表达分析，揭示了与各种表型相关的 tRNA 丰度的可识别模式。

研究方案

注意： 图 1 提供了 AQRNA-seq 文库制备所涉及的程序的图形说明。有关程序中使用的试剂、化学品和色谱柱/试剂盒的详细信息，请参阅 材料表。建议使用 （i） 3% 琼脂糖凝胶电泳，（ii） 用于生物分子样品质量控制的自动电泳工具（参见 材料表），以及 （iii） 紫外-可见分光光度法和/或荧光定量法，对输入 RNA 样品的纯度、完整性和数量进行全面评估。除非另有说明，否则所有反应物和预混液都必须放在冰上。将冷藏箱中的试剂（例如酶）运输到 -20 °C 储存和从 -20 °C 储存，以延长其保质期并避免文库中间体的多次冻融循环。

1. RNA 的去磷酸化

注：去除 5'-磷酸盐（P;供体）会阻止与 RNA 的 3'-羟基（OH;受体）自连接。接头不会自连接，因为它们的 3' 末端被修饰为掺入二脱氧胞苷 （Linker 1） 或间隔区 （Linker 2）。接头只能通过将其 5'-P 连接到 RNA 或 cDNA 的 3'-OH 来连接。

1. 在无菌 PCR 管（例如，200 μL 或 500 μL 管）中制备去磷酸化反应，添加多达 2 μL RNA 样品、0.5 μL 40 U/μL RNase 抑制剂、1 μL 0.5 μL 0.5 μL 10x T4 RNA 连接酶反应缓冲液、1 μL 1 U/μL 虾碱性磷酸酶， 以及足够的不含 RNase 的水，使总体积达到 5 μL。
   注：对于典型样品，75 ng RNA（或 80 nt RNA 约为 2 pmol）被认为足以使用此方案定量小 RNA。
2. 在 37 °C 下孵育 30 分钟以使 RNA 去磷酸化，然后在 65 °C 下孵育 5 分钟以灭活酶并使 RNA 变性。将样品在 4 °C 下保存至少 10 分钟以防止复性。

2. 接头 1 与 RNA 的 3' 端连接

1. 在无菌 PCR 管中加入 5 μL 去磷酸化 RNA（步骤 1 中的产物）、0.5 μL 40 U/μL RNase 抑制剂、1 μL 100 μM 接头 1（表 1）、3 μL 10 mM ATP、2.5 μL 10x T4 RNA 连接酶反应缓冲液、15 μL PEG8000（50% 溶液）、 2 μL 30 U/μL T4 RNA 连接酶 1 和 1 μL 不含 RNase 的水。
   注：试剂可以制成预混液，以便于处理样品。不要在预混液中加入 PEG8000 和 T4 RNA 连接酶 1。
2. 在 25 °C 下孵育 2 小时，然后在 16 °C 下孵育 16 小时，以将 Linker 1 连接到 RNA 上。
3. 柱纯化 Linker-1 连接的 RNA。使用试剂盒进行 DNA/RNA 回收和纯化（参见 材料表）。
   注：该色谱柱纯化方案适用于使用同一试剂盒的所有后续色谱柱纯化。使用凝胶过滤技术从测序反应中去除染料终止子的试剂盒（参见 材料表）不能在此处使用，因为PEG8000与此类试剂盒的凝胶过滤器不兼容。建议在纯化后为每个样品保存一份等分试样 （1.2 μL）。必要时，这些等分试样可用于通过运行市售核酸分析仪来检查连接效率。将剩余的纯化样品保存在冰上或 -20 °C 直至进一步的步骤。
   1. 对于< 50 μL 的样品体积，添加不含 RNase 的水，使其达到 50 μL。将 2 体积的寡核苷酸结合缓冲液（试剂盒中提供）添加到 1 体积的样品中。向 1 体积的样品中加入 8 体积的 100% 乙醇。
   2. 将样品（一次最多 750 μL）上样到放置在 2 mL 收集管（试剂盒中提供）内的色谱柱中。要将 RNA 结合到色谱柱上，以 10,000 x g 离心 30 秒，然后弃去流出物（即收集管中的液体）。将色谱柱放回收集管中。
   3. 要洗去色谱柱上的杂质，向色谱柱中加入 750 μL DNA 洗涤缓冲液（试剂盒中提供）。以 10,000 x g 离心 30 秒并丢弃流出物。将色谱柱放回收集管中。
   4. 以最大速度离心（例如，台式微量离心机为 16,000 x g ）再离心 1 分钟，以去除残留的 DNA 洗涤缓冲液。
   5. 要洗脱 RNA，请小心地将色谱柱移至无菌 1.5 mL 试管中，向色谱柱中加入不含 RNase 的水。洗脱 RNA 时使用比所需体积更大的体积，以解决洗脱过程中可能出现的体积损失。例如，如果后续步骤需要 15 μL，则加入 17 μL 不含 RNase 的水进行洗脱。以 10,000 x g 离心 30 秒。

3. 通过 AlkB 去甲基化酶去除转录后甲基化

注：AlkB 是一种细菌酶，可从 DNA 和 RNA 中的一些（但不是全部）甲基化核苷酸中去除甲基。去除 RNA 中的几种类型的甲基化核糖核苷酸可防止逆转录酶脱落，从而允许更全长的读长和修饰位点的鉴定。此步骤需要在低 pH 值下进行控制，以防止 RNA 意外降解。

1. 通过将 1.4611 g 2-酮戊二酸（146.11 g/M）溶解在 10 mL 不含 RNase 的水中，制备 1 M 2-酮戊二酸的储备溶液。过滤器通过 0.2 μm 注射器过滤器对溶液进行消毒。将储备液分装到 2 mL 无菌管中，并在 -20 °C 下储存。
2. 通过将 0.88 g L-抗坏血酸（176.12 g/M）溶解在 10 mL 不含 RNase 的水中，制备 0.5 M L-抗坏血酸的储备液。过滤器通过 0.2 μm 注射器过滤器对溶液进行消毒。将储备液分装到 2 mL 无菌管中，并在 -20 °C 下储存。
3. 将 0.9835 g 硫酸亚铁六水合物铵（392.14 g/M）溶解在 10 mL 不含 RNase 的水中，制备 0.25 M 硫酸亚铁六水合物储备液。过滤器通过 0.2 μm 注射器过滤器对溶液进行消毒。将储备液分装到 2 mL 无菌管中，并在 -20 °C 下储存。
4. 通过将 2.383 g HEPES（238.30 g/M）溶解在 10 mL 不含 RNase 的水中，制备 1 M HEPES 的储备溶液。使用 NaOH 将溶液的 pH 值调节至 8，并通过 0.2 μm 注射器过滤器对溶液进行过滤消毒。将储备液分装到 2 mL 无菌管中，并在 -20 °C 下储存。
5. 准备 2x AlkB 反应缓冲液。要制备 10 mL 缓冲液，请混合 1.5 μL 1 M 2-酮戊二酸（在步骤 3.1 中制备）、80 μL 0.5 M L-抗坏血酸（在步骤 3.2 中制备）、6 μL 0.25 M 硫酸亚铁铵六水合物（在步骤 3.3 中制备）、100 μL 10 mg/mL BSA、1000 μL 1 M HEPES（在步骤 3.4 中制备;最后添加）， 和 8812.5 μL 不含 RNase 的水。过滤器通过 0.2 μm 注射器过滤器对缓冲液进行灭菌。
   注：由于组分的化学不稳定性，2x AlkB 反应缓冲液必须在每次实验前立即新鲜制备。
6. 通过添加 20 μL 接头-1 连接的 RNA（步骤 2 中的产物）、50 μL 的 2x AlkB 反应缓冲液（在步骤 3.5 中制备）、2 μL AlkB 去甲基化酶、1 μL RNase 抑制剂和 27 μL 不含 RNase 的水，在无菌 PCR 管中制备 AlkB 消化反应。
7. 在室温下孵育 2 小时以从 RNA 中去除转录后甲基化。
8. 要从反应中去除 AlkB，请按照以下步骤操作。
   1. 为了实现清洁相分离，向 AlkB 反应中加入 50 μL 不含 RNase 的水，然后加入 100 μL 苯酚：氯仿：异戊醇 25：24：1 （pH = 5.2）。
   2. 用手摇动 10 秒，然后以 16,000 x g 离心 10 分钟。确保台式离心机的转子与 PCR 管兼容。如果需要，请使用适配器。
   3. 将 RNA（即顶部的水层;约 140 μL）转移到无菌的 1.5 mL 试管中。如果将氯仿（即底层）混合到水层中，请使用相同的设置再次离心。
   4. 向提取的 RNA 中加入 100 μL 氯仿以去除残留的苯酚。用手摇动 10 秒，然后以 16,000 x g 离心 10 分钟。
   5. 将 RNA（即顶部的水层;约 120 μL）转移到无菌的 1.5 mL 试管中。
9. 对提取的 RNA 进行柱纯化。使用试剂盒进行 DNA/RNA 回收和纯化（参见 材料表）。按照步骤 2.3 中详述的方案进行色谱柱纯化。

4. 去除多余的 Linker 1

注：建议在纯化后为每个样品保存一份等分试样 （1.2 μL）。必要时，这些等分试样可用于通过运行市售核酸分析仪来检查 RecJf 酶解的效率。立即对纯化的样品进行逆转录。

1. 通过添加 15 μL Linker-1 连接的 RNA（步骤 3 中的产物）、1 μL 40 U/μL RNase 抑制剂、2 μL 10x 试剂盒缓冲液 2（参见 材料表）和 2 μL 50 U/μL 5'-脱基酶，在无菌 PCR 管中制备脱腺苷化反应。
2. 在 30 °C 下孵育 1 小时以去除接头 1 5' 末端的腺嘌呤。向脱腺苷化反应中加入 2 μL 30 U/μL RecJf。
3. 在 37 °C 下孵育 30 分钟以消化过量的 Linker 1。向反应中再加入 2 μL 30 U/μL RecJf。
4. 在 37 °C 下孵育 30 分钟以继续消化过量的接头 1，然后在 65 °C 下孵育 20 分钟以使酶变性。
5. 柱纯化 Linker-1 连接的 RNA。使用使用凝胶过滤技术的试剂盒从测序反应中去除染料终止子（参见 材料表），因为它可以有效去除短残基（例如，长度为 2 至 10 bp 的寡核苷酸）。请按照下面描述的步骤进行纯化。
   1. 根据制造商的方案准备凝胶过滤柱。将色谱柱放入无菌 1.5 mL 试管中，并在色谱柱中加入 24 μL 样品。
   2. 要纯化 RNA，请以 800 x g 离心 3 分钟，然后弃去色谱柱。纯化的 RNA 位于洗脱液中。

5. 逆转录 （RT） 反应

注：以下 RT（参见 材料表）反应设置遵循制造商的方案，稍作修改以允许 AQRNA-seq 兼容性。

1. 通过添加 24 μL 模板 RNA（步骤 4 中的产物）、1 μL 2 μM RT 引物（表 1）和 1 μL dNTP（每种核苷酸 10 mM），在无菌 PCR 管中制备 RT 引物退火反应。
2. 在 80 °C 下孵育 2 分钟，使 RT 引物与模板 RNA 退火，然后立即在冰上冷却 2 分钟。
3. 通过向退火反应管中加入 6 μL 5x RT 反应缓冲液、1 μL 40 U/μL RNase 抑制剂和 1 μL 逆转录酶来制备 RT 反应。
4. 在 50 °C 下孵育 2 小时以逆转录 RNA 模板，然后在 70 °C 下孵育 15 分钟以灭活酶。RT 产物（即 RNA-cDNA 杂交体）可以在 4 °C 或 -20 °C 下储存过夜。

6. RNA 水解

1. 将 1 μL 的 5 M NaOH 添加到 RNA-cDNA 杂交体中（步骤 5 中的产物）。在 93 °C 下孵育 3 分钟以水解 RNA-cDNA 杂交体的 RNA 链。
2. 加入 0.77 μL 5 M HCl 以中和反应。加入 HCl 后，轻弹混合，然后向下旋转试管。中和是瞬间的。
   注：建议在缓冲条件下测试中和 1 μL NaOH（例如，使用 pH 试纸条）所需的 5 M HCl 的精确量。
3. 对单链 cDNA 进行柱纯化。使用试剂盒进行 DNA/RNA 回收和纯化（参见 材料表）。按照步骤 2.3 中详述的方案进行色谱柱纯化。
   注：由于前面步骤中的 pH 值变化，使用凝胶过滤技术从测序反应中去除染料终止子的试剂盒（参见 材料表）不能在此处使用。
4. 将纯化的 cDNA 快速真空至 <5 μL，然后加入不含 RNase 的水，使体积恢复到 5 μL。小心不要快速真空 cDNA 以完全干燥。
5. 将纯化的 cDNA 转移到无菌 PCR 管中。纯化的 cDNA 可在 -20 °C 下储存长达 1 周。

7. 连接子 2 连接到 cDNA 的 3' 端

1. 通过添加 5 μL cDNA（步骤 6 中的产物）、1 μL 50 μM Linker 2（表 1）、2 μL 10x T4 DNA 连接酶反应缓冲液、1 μL 10 mM ATP、9 μL PEG8000（50% 溶液）和 2 μL 400 U/μL T4 DNA 连接酶，在无菌 PCR 管中制备 Linker 2 连接反应。
   注：试剂可以制成预混液，以促进样品的处理。不要在预混液中加入 PEG8000 DNA 和 T4 DNA 连接酶。
2. 在 16 °C 下孵育 16 小时，以将 Linker 2 连接到 cDNA 上。
3. 柱纯化 Linker-2 连接的 cDNA。使用试剂盒进行 DNA/RNA 回收和纯化（参见 材料表）。按照步骤 2.3 中详述的方案进行色谱柱纯化。

8. 去除多余的 Linker 2

1. 通过添加 16 μL Linker-2 连接的 cDNA、2 μL 10x 试剂盒缓冲液 2 和 2 μL 50 U/μL 5'-脱腺苷酶，在无菌 PCR 管中制备脱腺苷化反应。在 30 °C 下孵育 1 小时以去除接头 2 5' 末端的腺嘌呤。
2. 向脱腺苷化反应中加入 2 μL 30 U/μL RecJf。在 37 °C 下孵育 30 分钟以消化过量的 Linker 2。向反应中再加入 2 μL 30 U/μL RecJf。
3. 在 37 °C 下孵育 30 分钟以继续消化过量的 Linker 2，然后在 65 °C 下孵育 20 分钟以使酶变性。

9. 使用测序引物对 cDNA 进行 PCR 扩增

1. 将 PCR 引物分配给样品。每个样品都需要正向和反向引物的独特组合（表 1）才能进行有效的多重检测。
2. 加入不含 RNase 的水，使样品体积达到 25 μL。将每个样品的 5 μL 保存到无菌 PCR 管中，以备不时之需。
3. 通过添加 20 μL cDNA（步骤 8 中的产物）、1 μL 2.5 μM 正向引物、1 μL 2.5 μM 反向引物、25 μL 2x DNA 聚合酶缓冲液、2 μL 不含 RNase 的水和 1 μL DNA 聚合酶来制备 PCR 反应（参见 PCR 试剂盒 材料表 ）。
   注：试剂可以制成预混液，以促进样品的处理。不要将 DNA 聚合酶添加到预混液中。
4. 进行 PCR，在 94 °C 下初始变性 1 分钟，然后在 98 °C 下进行 18 个变性循环 20 秒 - 在 58 °C 下退火 20 秒 - 在 68 °C 下延伸 1 分钟。
   注：请勿在线性范围之外进行 PCR 扩增。对于大多数实验来说，总共 18 个循环是最佳的，但这可能取决于上下文。
5. 将 PCR 产物快速真空至 25 μL 以下，然后加入不含 RNase 的水，使体积恢复到 25 μL。将 5 μL PCR 产物转移到无菌的 0.5 mL 试管中，以检查尺寸分布（参见步骤 9.6）。将剩余的 20 μL PCR 产物储存在 -20 °C 直至进一步的步骤。
6. 如下所述检查 PCR 产物的大小分布。
   1. 在 TAE 缓冲液中制备 3% 琼脂糖凝胶。
      注意：在本方案中，溴化乙锭 （EtBr） 用于电泳后凝胶染色（参见步骤 9.6.5）。在此步骤中，可以将适当的 DNA 染料添加到凝胶溶液中，或稍后用于凝胶染色。
   2. 将 1 μL 的 6x 上样染料混合到 5 μL 的 PCR 产物中（来自步骤 9.5），并将混合物加载到凝胶中。
   3. 将 5 μL DNA 分子量标准加载到第一个样品之前和最后一个样品之后的孔中。使用 50 bp 或 100 bp DNA 分子量标准可以提高 150 bp 和 300 bp 之间 PCR 产物的大小鉴别能力。
   4. 运行凝胶电泳以定位 PCR 产物。适当的运行条件可能取决于上下文。在这里，在 120 V、400 mA 下运行 75 分钟，以获得 17.78 cm（宽）x 10.16 cm（高）x 1 cm（厚）凝胶板。
   5. 将凝胶放入盒子中，并在盒子中加入去离子 （DI） 水，直到凝胶完全浸没。将 10 μL EtBr 加入去离子水中，浸泡凝胶。用箔纸包住盒子，然后将其放在摇摇器上。摇动时对凝胶染色 30 分钟。
   6. 将含有 EtBr 的废物丢弃到放置在通风橱中的废液瓶中。用去离子水冲洗凝胶一次，然后将含有 EtBr 的水倒入废液瓶中。
   7. 用去离子水填充盒子，直到凝胶完全浸入。用箔纸包住盒子，然后将其放在摇摇器上。摇动时洗涤凝胶 10 分钟。
   8. 将含 EtBr 的水倒入通风橱中的废液瓶中。使用凝胶成像仪可视化条带。获取凝胶的高分辨率图像。

10. 凝胶纯化

1. 在 TAE 缓冲液中制备 3% 琼脂糖凝胶。用宽梳子（1 mm 厚;5 mm 宽;15 mm 深）制备 1 cm 厚的凝胶，使每个孔至少可包含 25 μL 的样品加载染料混合物。
2. 将 4 μL 的 6x 上样染料与 20 μL 的 PCR 产物（来自步骤 9.5）混合，并将混合物加载到凝胶中。在样品之间留出空泳道，以尽量减少凝胶切除过程中的交叉污染。
3. 加载 DNA 分子量标准，运行凝胶电泳，染色和洗涤凝胶，并按照步骤 9.6 中的说明拍摄凝胶图像。
4. 切除含有目标大小范围内的 PCR 产物的凝胶块。为了尽量减少引物二聚体（175 bp 接头，无插入片段）的污染，提取大小超过 195 bp 的 PCR 产物（175 bp 接头 + 20 bp miRNA）。
5. 使用凝胶提取纯化 PCR 产物。使用凝胶提取试剂盒（参见 材料表）。纯化方案基于制造商的方案，对 AQRNA-seq 兼容性进行了细微修改。除非另有说明，否则所有离心步骤应在室温下使用台式离心机以 17,900 x g 的速度进行 1 分钟。请按照以下步骤操作。
   1. 测量管内凝胶块的重量。将 6 体积的缓冲液 QG（试剂盒中提供）添加到 1 体积的凝胶块中（1 mg 凝胶约为 1 μL）。
   2. 在 50 °C 下孵育 10 分钟或直到凝胶块完全溶解。每 2 分钟涡旋试管以促进凝胶溶解。溶解凝胶后，混合物应类似于没有溶解凝胶的缓冲液 QG 的颜色。如果颜色为橙色或紫色，则加入 10 μL 3 M 乙酸钠 （pH = 5.0） 并充分混合。
   3. 向混合物中加入 1 凝胶体积的异丙醇并充分混合。将离心柱放入 2 mL 收集管（试剂盒中提供）中。
   4. 要结合 DNA，请将样品（每次最多 750 μL）上样到色谱柱上并离心。弃去流通液，将色谱柱放回同一收集管中。每个离心柱的最大凝胶量为 400 mg。
   5. 向色谱柱中加入 500 μL 缓冲液 QG 并离心。弃去流通液，将色谱柱放回同一收集管中。
   6. 要洗涤杂质，向色谱柱中加入 750 μL 缓冲液 PE（试剂盒中提供），让色谱柱静置 5 分钟，然后离心。弃去流通液，将色谱柱放回同一收集管中。再次离心以去除残留的洗涤缓冲液。
   7. 将色谱柱放入无菌 1.5 mL 试管中。要洗脱 DNA，在柱膜中心加入 30 μL 缓冲液 EB（试剂盒中提供），让柱静置 4 分钟，然后离心。
   8. Speed-vac 并将凝胶纯化的 PCR 产物重悬于 12 μL 缓冲液 EB 中。
6. 通过 UV-可见分光光度法和/或荧光定量法测量构建的文库的浓度。

11. 文库测序

1. 将构建的文库提交给外部测序中心进行质量评估和 Illumina 测序。为确保小 RNA 景观定量映射的足够灵敏度，选择从每个方向（即 PE75）具有 75 bp 读数的双端测序，目标是每个样品在每个方向上至少有 1.5 M 原始序列读数。使用定制引物（表 1）进行 NextSeq 测序，但对于 MiSeq 测序，这是可选的。
   注：可以使用 MiSeq 或 NextSeq500 平台进行测序。平台的选择可能取决于样品的性质和总样品计数。

12. 数据分析管道

注意： 图 2 提供了数据分析管道中涉及的简化程序的图形说明，该流程以原始序列读数（FASTQ 格式）作为输入并生成一个丰度矩阵，其中行代表感兴趣的小 RNA 物种的成员，列代表样品。对于双端测序，每个样本对应于两个 FASTQ 文件，一个用于正向读取，另一个用于反向读取。GitHub （https://github.com/Chenrx9293/AQRNA-seq-JoVE.git） 上提供了完整的数据分析管道，其中包含所有相关脚本和带有每个步骤大量注释的手册。

1. 从外部测序中心检索原始序列读数，并使用 FastQC¹⁴ 或 fastp¹⁵ 等开源程序评估测序质量。
2. 以 FASTA 格式创建参考序列库。
   注：该管道对各种小 RNA 类别适应性的关键是合适的参考序列库。为了实现特定目标 RNA 类别（例如 miRNA）成员的准确丰度估计，用户需要精心策划一个用于管道的参考序列库。用于管道执行的所有其他指令在不同的小 RNA 类别中保持一致。
3. 创建一个名为 AQRNA-seq 的目录，用于实施数据分析管道，并将所有脚本、质量过滤序列读取和参考序列库放入此目录中。按照 GitHub （https://github.com/Chenrx9293/AQRNA-seq-JoVE.git） 上的详细说明准备子目录并对文件进行必要的修改，以靶向不同的生物体和/或小 RNA 物种，以及操作系统和/或作业调度程序的兼容性。
4. 按照 GitHub 上的手册 （https://github.com/Chenrx9293/AQRNA-seq-JoVE.git） 中概述的步骤实施数据分析管道，该手册包含每个步骤的描述、输入和输出文件以及命令行。总之，该流程包括 （i） 从读数中修剪接头序列和随机核苷酸，（ii） 根据其长度过滤读数，（iii） 将读数映射到参考序列，（iv） 解析模糊映射，以及 （v） 生成丰度矩阵。

结果

牛分枝杆菌 经历指数增长的 BCG（卡介苗和盖兰杆菌）菌株 1173P2 受到营养饥饿的时间序列（0、4、10 和 20 天）的影响，然后在营养丰富的培养基中进行 6 天的复苏，如之前在 胡 等人所述⁷。从细菌培养物中分离出小 RNA，在 5 个指定时间点中的每一个时间点进行 3 次生物学重复。使用上述 AQRNA-seq 文库制备工作流程构建 Illumina 文库（图 1），然后在麻...

讨论

AQRNA-seq 文库制备工作流程旨在最大限度地捕获样品中的 RNA，并最大限度地减少逆转录过程中聚合酶的流失⁷。通过两步接头连接，新型 DNA 寡核苷酸（接头 1 和接头 2）被过量连接，以完全互补样品中的 RNA。RecJf 是一种对单链 DNA 具有特异性的 5' 至 3' 核酸外切酶，可有效去除多余的接头，同时保持连接的产物完好无损。此外，AlkB 处理减少了 RNA¹⁸ 上的甲基修饰?...

材料

Name	Company	Catalog Number	Comments
2-ketoglutarate	Sigma-Aldrich	75890	Prepare a working solution (1 M) and store it at -20ºC
2100 Bioanalyzer Instrument	Agilent	G2938C
5'-deadenylase (50 U/μL)	New England Biolabs	M0331S (component #: M0331SVIAL)	Store at -20 °C
Adenosine 5'-Triphosphate (ATP)	New England Biolabs	M0437M (component #: N0437AVIAL)	NEB M0437M contains T4 RNA Ligase 1 (30 U/μL), T4 RNA Ligase Reaction Buffer (10X), PEG 8000 (1X), and ATP (100 mM); prepare a working solution (10 mM) and store it at -20ºC
AGAROSE GPG/LE	AmericanBio	AB00972-00500	Store at ambient temperature
Ammonium iron(II) sulfate hexahydrate	Sigma-Aldrich	F2262	Prepare a working solution (0.25 M) and store it at -20 °C
Bioanalyzer Small RNA Analysis	Agilent	5067-1548	The Small RNA Analysis is used for checking the quality of input RNAs and the efficiency of enzymatic reactions (e.g., Linker 1 ligation)
Bovine Serum Albumin (BSA; 10 mg/mL)	New England Biolabs	B9000	This product was discontinued on 12/15/2022 and is replaced with Recombinant Albumin, Molecular Biology Grade (NEB B9200).
Chloroform	Macron Fine Chemicals	4441-10
Demethylase	ArrayStar	AS-FS-004	Demethylase comes with the rtStar tRNA Pretreatment & First-Strand cDNA Synthesis Kit (AS-FS-004)
Deoxynucleotide (dNTP) Solution Mix	New England Biolabs	N0447L (component #: N0447LVIAL)	This dNTP Solution Mix contains equimolar concentrations of dATP, dCTP, dGTP and dTTP (10 mM each)
Digital Dual Heat Block	VWR Scientific Products	13259-052	Heating block is used with the QIAquick Gel Extraction Kit
DyeEx 2.0 Spin Kit	Qiagen	63204	Effective at removing short remnants (e.g., oligos less than 10 bp in length)
Electrophoresis Power Supply	Bio-Rad Labrotories	PowerPac 300
Eppendorf PCR Tubes (0.5 mL)	Eppendorf	0030124537
Eppendorf Safe-Lock Tubes (0.5 mL)	Eppendorf	022363611
Eppendorf Safe-Lock Tubes (1.5 mL)	Eppendorf	022363204
Eppendorf Safe-Lock Tubes (2 mL)	Eppendorf	022363352
Ethyl alcohol (Ethanol), Pure	Sigma-Aldrich	E7023	The pure ethanol is used with the Oligo Clean and Concentrator Kit from Zymo Research
Gel Imaging System	Alpha Innotech	FluorChem 8900
Gel Loading Dye, Purple (6X), no SDS	New England Biolabs	N0556S (component #: B7025SVIAL)	NEB N0556S contains Quick-Load Purple 50 bp DNA Ladder and Gel Loading Dye, Purple (6X), no SDS
GENESYS 180 UV-Vis Spectrophotometer	Thermo Fisher Scientific	840-309000	The spectrophotometer is used for measuring the oligo concentrations using the Beer's law
HEPES	Sigma-Aldrich	H4034	Prepare a working solution (1 M; pH = 8 with NaOH) and store it at -20 °C
Hydrochloric acid (HCl)	VWR Scientific Products	BDH3028	Prepare a working solution (5 M) and store it at ambient temperature
Isopropyl Alcohol (Isopropanol), Pure	Macron Fine Chemicals	3032-16	Isopropanol is used with the QIAquick Gel Extraction Kit
L-Ascorbic acid	Sigma-Aldrich	A5960	Prepare a working solution (0.5 M) and store it at -20ºC
Microcentrifuge	Eppendorf	5415D
NanoDrop 2000 Spectrophotometer	Thermo Fisher Scientific	ND-2000
NEBuffer 2 (10X)	New England Biolabs	M0264L (component #: B7002SVIAL)	NEB M0264L contains RecJf (30 U/μL) and NEBuffer 2 (10X); store at -20 °C
Nuclease-Free Water (not DEPC-Treated)	Thermo Fisher Scientific	AM9938
Oligo Clean & Concentrator Kit	Zymo Research	D4061	Store at ambient temperature
PEG 8000 (50% solution)	New England Biolabs	M0437M (component #: B1004SVIAL)	NEB M0437M contains T4 RNA Ligase 1 (30 U/μL), T4 RNA Ligase Reaction Buffer (10X), PEG 8000 (1X), and ATP (100 mM); prepare a working solution (10 mM) and store it at -20ºC
Peltier Thermal Cycler	MJ Research	PTC-200
Phenol:choloroform:isoamyl alcohol 25:24:1 pH = 5.2	Thermo Fisher Scientific	J62336
PrimeScript Buffer (5X)	TaKaRa	2680A
PrimeScript Reverse Transcriptase	TaKaRa	2680A
QIAquick Gel Extraction Kit	Qiagen	28704	This kit requires a heating block and isopropanol to work with
Quick-Load Purple 100 bp DNA Ladder	New England Biolabs	N0551S (component #: N0551SVIAL)
Quick-Load Purple 50 bp DNA Ladder	New England Biolabs	N0556S (component #: N0556SVIAL)	NEB N0556S contains Quick-Load Purple 50 bp DNA Ladder and Gel Loading Dye, Purple (6X), no SDS
RecJf (30 U/μL)	New England Biolabs	M0264L (component #: M0264LVIAL)	NEB M0264L contains RecJf (30 U/μL) and NEBuffer 2 (10X); store at -20 °C
RNase Inhibitor (murine; 40 U/μL)	New England Biolabs	M0314L (component #: M0314LVIAL)	Store at -20 °C
SeqAMP DNA Polymerase	TaKaRa	638509	TaKaRa 638509 contains SeqAMP DNA Polymerase and SeqAMP PCR Buffer (2X)
SeqAMP PCR Buffer (2X)	TaKaRa	638509	TaKaRa 638509 contains SeqAMP DNA Polymerase and SeqAMP PCR Buffer (2X)
Shrimp Alkaline Phosphatase (1 U/μL)	New England Biolabs	M0371L (component #: M0371LVIAL)
Sodium hydroxide (NaOH)	Sigma-Aldrich	S5881	Prepare a working solution (5 M) and store it at ambient temperature
T4 DNA Ligase (400 U/μL)	New England Biolabs	M0202L (component #: M0202LVIAL)	NEB M0202L contains T4 DNA Ligase (400 U/μL) and T4 DNA Ligase Reaction Buffer (10X)
T4 DNA Ligase Reaction Buffer (10X)	New England Biolabs	M0202L (component #: B0202SVIAL)	NEB M0202L contains T4 DNA Ligase (400 U/μL) and T4 DNA Ligase Reaction Buffer (10X)
T4 RNA Ligase 1 (30 U/μL)	New England Biolabs	M0437M (component #: M0437MVIAL)	NEB M0437M contains T4 RNA Ligase 1 (30 U/μL), T4 RNA Ligase Reaction Buffer (10X), PEG 8000 (1X), and ATP (100 mM)
T4 RNA Ligase Reaction Buffer (10X)	New England Biolabs	M0437M (component #: B0216SVIAL)	NEB M0437M contains T4 RNA Ligase 1 (30 U/μL), T4 RNA Ligase Reaction Buffer (10X), PEG 8000 (1X), and ATP (100 mM)