AQRNA-seq для количественного определения малых РНК

Резюме

Абсолютное количественное секвенирование РНК (AQRNA-seq) — это технология, разработанная для количественной оценки ландшафта всех малых РНК в биологических смесях. В данной работе продемонстрированы этапы подготовки библиотеки и обработки данных AQRNA-seq, количественно оценивающие изменения в пуле транспортной РНК (тРНК) в Mycobacterium bovis BCG во время периода покоя, вызванного голоданием.

Аннотация

AQRNA-seq обеспечивает прямую линейную зависимость между количеством прочтений секвенирования и числом малых копий РНК в биологическом образце, что позволяет точно количественно оценить пул малых РНК. Описанная здесь процедура подготовки библиотеки AQRNA-seq включает в себя использование специально разработанных линкеров секвенирования и этап снижения модификаций метилирования РНК, которые блокируют процесс обратной транскрипции, что приводит к увеличению выхода полноразмерных кДНК. Кроме того, подробно описана реализация сопутствующего биоинформатического конвейера. Эта демонстрация AQRNA-seq была проведена путем количественного анализа 45 тРНК в Mycobacterium bovis BCG, собранных в течение 5 выбранных дней в течение 20-дневного курса депривации питательных веществ и 6 дней реанимации. Здесь также будут обсуждаться текущие усилия по повышению эффективности и строгости AQRNA-seq. Это включает в себя изучение методов предотвращения очистки геля для смягчения проблем с димерами праймера после амплификации ПЦР и увеличения доли полноразмерных прочтений для обеспечения более точного картирования считываний. Будущие усовершенствования AQRNA-seq будут сосредоточены на содействии автоматизации и высокопроизводительному внедрению этой технологии для количественного определения всех малых видов РНК в образцах клеток и тканей различных организмов.

Введение

Секвенирование нового поколения (NGS), также известное как массово-параллельное секвенирование, представляет собой технологию секвенирования ДНК, которая включает в себя фрагментацию ДНК, лигирование адапторных олигонуклеотидов, амплификацию на основе полимеразной цепной реакции (ПЦР), секвенирование ДНК и повторную сборку последовательностей фрагментов в геном. Адаптация NGS к секвенированной РНК (РНК-секвенирование) является мощным подходом к идентификации и количественному определению РНК-транскриптов и их вариантов¹. Инновационные разработки в области подготовки библиотек РНК и биоинформатического анализа в сочетании с достижениями в области лабораторного оборудования расширили репертуар приложений РНК-секвенирования, перейдя от секвенирования экзома к передовым функциональным омикам, таким как профилирование некодирующих РНК², анализ одиночных клеток³, пространственная транскриптомика ^4,5, анализ альтернативного сплайсинга⁶, в том числе. Эти передовые методы РНК-секвенирования выявляют сложные функции РНК посредством количественного анализа транскриптома в нормальных и больных клетках и тканях.

Несмотря на эти достижения в области РНК-секвенирования, несколько ключевых технических особенностей ограничивают количественную мощность метода. В то время как большинство методов секвенирования РНК позволяют точно и точно количественно оценить изменения уровней РНК между экспериментальными переменными (т.е. биологическими образцами и/или физиологическими состояниями), они не могут обеспечить количественное сравнение уровней молекул РНК в образце. Например, большинство методов РНК-секвенирования не могут точно количественно определить относительное число копий отдельных молекул изоакцептора тРНК в клеточном пуле экспрессированных тРНК. Как подчеркивается в сопутствующей публикации⁷, это ограничение в отношении РНК-секвенирования обусловлено рядом особенностей структуры РНК и биохимии библиотечного приготовления. Например, активность ферментов лигирования, используемых для присоединения линкеров 3'- и 5'-концевого секвенирования к молекулам РНК, сильно зависит от идентичности концевых нуклеотидов РНК и линкеров секвенирования. Это приводит к значительным вариациям эффективности линкерных лигирования и значительному артефактному увеличению прочтений секвенирования ^8,9,10.

Второй набор ограничений вытекает из присущих молекулам РНК структурных свойств. В частности, формирование вторичной структуры РНК и динамические изменения в десятках посттранскрипционных модификаций РНК эпитранскриптома могут вызывать спад полимеразы или мутацию во время обратной транскрипции. Эти ошибки приводят к неполному или усеченному синтезу кДНК или изменению последовательности РНК. Хотя оба эти явления могут быть использованы для картирования вторичных структур или некоторых модификаций, они снижают количественную точность RNA-seq, если на последующих этапах подготовки библиотеки не удается захватить усеченные кДНК или если обработка данных отбрасывает мутировавшие последовательности, не соответствующие эталонному набору данных^. Кроме того, огромное химическое, длинное и структурное разнообразие РНК-транскриптов, а также отсутствие инструментов для равномерной фрагментации длинных РНК уменьшают применимость большинства методов РНК-секвенирования ко всем видам РНК¹³.

Метод AQRNA-seq (секвенирование РНК в абсолютном количестве) был разработан для устранения некоторых из этих технических и биологических ограничений, ограничивающих количественную точность^. Сводя к минимуму зависящие от последовательности смещения при захвате, лигировании и амплификации во время подготовки библиотеки секвенирования РНК, AQRNA-seq достигает превосходной линейности по сравнению с другими методами, точно количественно определяя 75% референсной библиотеки из 963 микроРНК с 2-кратной точностью. Эта линейная корреляция между количеством прочтений секвенирования и распространенностью РНК также наблюдается при анализе пула стандартов олигонуклеотидов РНК переменной длины и в отношении ортогональных методов, таких как нортерн-блоттинг. Установление линейности между количеством прочтений секвенирования и обилием РНК позволяет AQRNA-seq достичь точной, абсолютной количественной оценки всех видов РНК в образце.

Ниже приведено описание протокола для рабочего процесса подготовки библиотеки AQRNA-seq и сопутствующего нисходящего конвейера анализа данных. Метод был применен для выяснения динамики численности тРНК во время состояния покоя, вызванного голоданием, и последующей реанимации в модели туберкулеза Mycobacterium bovis bacilli de Calmette et Guérin (BCG). Были представлены результаты исследовательской визуализации данных секвенирования, а также последующего кластерного и дифференциального анализа экспрессии, которые выявили различимые закономерности в распространенности тРНК, связанные с различными фенотипами.

протокол

ПРИМЕЧАНИЕ: На рисунке 1 представлена графическая иллюстрация процедур, связанных с подготовкой библиотеки AQRNA-seq. Подробную информацию о реагентах, химикатах и колонках/наборах, используемых в процедуре, можно найти в Таблице материалов. Рекомендуется проводить всестороннюю оценку чистоты, целостности и количества образцов входной РНК с использованием (i) электрофореза в 3% агарозном геле, (ii) автоматизированных инструментов электрофореза для контроля качества биомолекул в образцах (см. Таблицу материалов) и (iii) УФ-видимой спектрофотометрии и/или флуориметрического количества. В обязательном порядке все реакции и мастер-смеси должны быть на льду, если не указано иное. Транспортируйте реагенты (например, ферменты) в холодильных камерах на хранение при температуре -20 °C и обратно, чтобы сохранить их срок годности и избежать многократных циклов замораживания-размораживания библиотечных промежуточных продуктов.

1. Дефосфорилирование РНК

Примечание: Удаление 5'-фосфата (P; донора) предотвращает самолигирование к 3'-гидроксилу (OH; акцептору) РНК. Линкеры не будут самолигировать, так как их 3'-конец модифицирован для включения либо дидезоксицитидина (линкера 1), либо спейсера (линкер 2). Линкеры могут быть лигированы только путем присоединения их 5'-P к 3'-ОН РНК или кДНК.

1. Готовят реакцию дефосфорилирования в стерильной ПЦР-пробирке (например, 200 мкл или 500 мкл) путем добавления до 2 мкл образца РНК, 0,5 мкл 40 ед/мкл ингибитора РНКазы, 1 мкл 0,5 мкл внутреннего стандарта (табл. 1), 0,5 мкл 10-кратного реакционного буфера Т4-лигазы РНК-лигазы, 1 мкл щелочной фосфатазы креветок, и достаточное количество воды, не содержащей РНКазы, для доведения общего объема до 5 мкл.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Для типичных образцов 75 нг РНК (или приблизительно 2 пмоль для 80 нт РНК) считается достаточным для количественного определения малых РНК с использованием этого протокола.
2. Инкубировать при 37 °C в течение 30 мин для дефосфорилирования РНК, а затем при 65 °C в течение 5 мин для инактивации фермента и денатурации РНК. Держите образцы при температуре 4 °C не менее 10 минут, чтобы предотвратить ренатурацию.

2. Лигирование линкера 1 к 3'-концу РНК

1. Приготовьте реакцию лигирования Линкера 1 в стерильной ПЦР-пробирке, добавив 5 мкл дефосфорилированных РНК (продукты из стадии 1), 0,5 мкл 40 Ед/мкл ингибитора РНКазы, 1 мкл 100 мкМ Линкера 1 (Таблица 1), 3 мкл 10 мМ АТФ, 2,5 мкл 10x Т4 РНК-лигазы реакционного буфера, 15 мкл PEG8000 (50% раствор), 2 мкл 30 Ед/мкл Т4 РНК-лигазы 1 и 1 мкл воды, не содержащей РНКазы.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Реагенты могут быть превращены в мастер-смесь для облегчения обработки образцов. Не включайте PEG8000 и Т4 РНК-лигазу 1 в мастер-микс.
2. Инкубировать при 25 °C в течение 2 ч, а затем при 16 °C в течение 16 ч для лигирования Linker 1 к РНК.
3. Очистите РНК, лигированные Linker-1, в колонке. Используйте набор для восстановления и очистки ДНК/РНК (см. Таблицу материалов).
   ПРИМЕЧАНИЕ: Этот протокол очистки колонок применяется ко всей последующей очистке колонок с использованием того же комплекта. Наборы, использующие технологию гель-фильтрации для удаления терминаторов красителя из реакций секвенирования (см. Таблицу материалов), здесь использовать нельзя, так как PEG8000 несовместимо с гелевыми фильтрами таких наборов. После очистки рекомендуется сохранять аликвоту (1,2 мкл) каждого образца. При необходимости эти аликвоты могут быть использованы для проверки эффективности лигирования с помощью коммерческого анализатора нуклеиновых кислот. Оставшиеся очищенные образцы храните на льду или при температуре -20 °C до дальнейших действий.
   1. Для объема образца < 50 мкл добавьте воду, не содержащую РНКазы, чтобы довести его до 50 мкл. Добавьте 2 объема олигосвязывающего буфера (входит в комплект) в 1 объем образца. Добавьте 8 объемов 100% этанола к 1 объему образца.
   2. Загрузите образец (до 750 мкл за один раз) в колонку, помещенную внутрь пробирки для сбора объемом 2 мл (входит в комплект). Чтобы связать РНК с колонкой, центрифугируйте при давлении 10 000 x g в течение 30 с и отбросьте проточный поток (т.е. жидкость в сборной пробирке). Поместите колонку обратно в пробирку для сбора.
   3. Чтобы смыть загрязнения с колонки, добавьте в колонку 750 мкл буфера для промывки ДНК (входит в комплект). Центрифугируйте при давлении 10 000 x g в течение 30 с и выбросьте проточный поток. Поместите колонку обратно в пробирку для сбора.
   4. Центрифугируйте на максимальной скорости (например, 16 000 x g для настольной микроцентрифуги) в течение дополнительной 1 минуты для удаления остаточного буфера для промывки ДНК.
   5. Чтобы элюировать РНК, осторожно переместите колонку в стерильную пробирку объемом 1,5 мл, добавьте в колонку воду, не содержащую РНКазы. Используйте больший объем, чем необходимо при элюировании РНК, чтобы учесть потенциальную потерю объема в процессе элюирования. Например, если для следующего этапа требуется 15 μЛ, добавьте 17 μЛ воды, не содержащей РНКазы, для элюирования. Центрифуга при 10 000 x g в течение 30 с.

3. Удаление посттранскрипционного метилирования деметилазой AlkB

Примечание: AlkB — это бактериальный фермент, который удаляет метильные группы из некоторых, но не из всех, метилированных нуклеотидов в ДНК и РНК. Удаление нескольких типов метилированных рибонуклеотидов в РНК предотвращает выпадение обратной транскриптазы, что позволяет проводить более полноценные чтения и идентифицировать сайты модификации. Этот этап необходимо контролировать при низком pH, чтобы предотвратить неожиданную деградацию РНК.

1. Приготовьте исходный раствор 1 М 2-кетоглутарата, растворив 1,4611 г 2-кетоглутарата (146,11 г на М) в 10 мл воды, не содержащей РНКазы. Фильтр стерилизуют раствор через шприц-фильтр 0,2 мкм. Разложите исходный раствор по 2 мл стерильных пробирок и храните при температуре -20 °C.
2. Приготовьте стоковый раствор 0,5 М L-аскорбиновой кислоты, растворив 0,88 г L-аскорбиновой кислоты (176,12 г/М) в 10 мл воды, не содержащей РНКазы. Фильтр стерилизуют раствор через шприц-фильтр 0,2 мкм. Разложите исходный раствор по 2 мл стерильных пробирок и храните при температуре -20 °C.
3. Приготовьте стоковый раствор 0,25 М гексагидрата сульфата железа аммония путем растворения 0,9835 г гексагидрата сульфата железа аммония (392,14 г/М) в 10 мл воды, не содержащей РНКазы. Фильтр стерилизуют раствор через шприц-фильтр 0,2 мкм. Разложите исходный раствор по 2 мл стерильных пробирок и храните при температуре -20 °C.
4. Приготовьте исходный раствор 1 М ГЕПЕС, растворив 2,383 г ГЕПЕС (238,30 г на М) в 10 мл воды, не содержащей РНКазы. Отрегулируйте pH раствора до 8 с помощью NaOH и простерилизуйте раствор фильтром через шприцевой фильтр 0,2 мкм. Разложите исходный раствор по 2 мл стерильных пробирок и храните при температуре -20 °C.
5. Приготовьте реакционный буфер 2x AlkB. Чтобы сделать 10 мл буфера, соедините 1,5 мкл 1 М 2-кетоглутарата (получено на этапе 3.1), 80 μЛ 0,5 М L-аскорбиновой кислоты (получено на этапе 3.2), 6 μЛ 0,25 М гексагидрата сульфата железа аммония (получено на этапе 3.3), 100 μЛ 10 мг/мл BSA, 1000 μЛ 1 M HEPES (получено на шаге 3.4; добавить последнее), и 8812,5 мкл воды, не содержащей РНКазы. Фильтр стерилизует буфер через шприцевой фильтр 0,2 мкм.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Реакционный буфер 2x AlkB должен быть приготовлен свежим непосредственно перед каждым экспериментом из-за химической лабильности компонентов.
6. Приготовьте реакцию расщепления AlkB в стерильной ПЦР-пробирке, добавив 20 мкл лигированных РНК Linker-1 (продукты из стадии 2), 50 мкл 2x реакционного буфера AlkB (полученного на стадии 3.5), 2 мкл деметилазы AlkB, 1 мкл ингибитора РНКазы и 27 мкл воды, не содержащей РНКазы.
7. Инкубировать при комнатной температуре в течение 2 ч для удаления посттранскрипционного метилирования из РНК.
8. Чтобы удалить AlkB из реакции, выполните действия, описанные ниже.
   1. Для разделения чистых фаз добавьте 50 μL воды, не содержащей РНКазы, в реакцию AlkB, а затем добавьте 100 μL фенола: хлороформ: изоамиловый спирт 25:24:1 (pH = 5,2).
   2. Встряхните вручную в течение 10 с, а затем центрифугируйте при 16 000 x g в течение 10 минут. Убедитесь, что ротор настольной центрифуги совместим с ПЦР-пробирками. При необходимости используйте адаптеры.
   3. Перенесите РНК (т.е. водный слой сверху; примерно 140 мкл) в стерильную пробирку объемом 1,5 мкл. Если хлороформ (т.е. нижний слой) подмешан к водному слою, то снова центрифугируйте с теми же настройками.
   4. Добавьте 100 мкл хлороформа к экстрагированным РНК для удаления остаточного фенола. Встряхните вручную в течение 10 с, а затем центрифугируйте при 16 000 x g в течение 10 минут.
   5. Перенесите РНК (т.е. водный слой сверху; примерно 120 мкл) в стерильную пробирку объемом 1,5 мкл.
9. Очистите выделенные РНК в колонке. Используйте набор для восстановления и очистки ДНК/РНК (см. Таблицу материалов). Следуйте протоколу, описанному в шаге 2.3, чтобы выполнить очистку колонки.

4. Удаление лишнего Линкера 1

ПРИМЕЧАНИЕ: Рекомендуется сохранять аликвоту (1,2 мкл) каждого образца после очистки. При необходимости эти аликвоты могут быть использованы для проверки эффективности разложения RecJf с помощью коммерческого анализатора нуклеиновых кислот. Приступайте к очищенным образцам сразу же для обратной транскрипции.

1. Приготовьте реакцию деденилирования в стерильной ПЦР-пробирке, добавив 15 мкл линкер-1-лигированных РНК (продукты из стадии 3), 1 мкл 40 Ед/мкл ингибитора РНКазы, 2 мкл 10x набора буфера 2 (см. Таблицу материалов) и 2 мкл 50 Ед/мкл 5'-деденилазы.
2. Инкубировать при 30 °C в течение 1 ч, чтобы удалить аденин на 5'-конце линкера 1. Добавьте 2 мкл 30 U/μL RecJf в реакцию омертвения.
3. Выдерживать при 37 °C в течение 30 минут, чтобы переварить излишки Линкера 1. Добавьте в реакцию еще 2 мкл 30 ед/мкл RecJf.
4. Инкубировать при 37 °C в течение 30 минут, чтобы продолжить переваривание избытка Линкера 1, а затем при 65 °C в течение 20 минут, чтобы денатурировать фермент.
5. Очистите РНК, лигированные Linker-1, в колонке. Используйте набор, в котором используется технология гель-фильтрации для удаления терминаторов красителя из реакций секвенирования (см. Таблицу материалов), так как он эффективен при удалении коротких остатков (например, олигонуклеотидов длиной от 2 до 10.о.). Выполните описанные ниже шаги для очищения.
   1. Подготовьте колонки гель-фильтра в соответствии с протоколом производителя. Поместите колонку в стерильную пробирку объемом 1,5 мл и загрузите в колонку 24 мкл образца.
   2. Чтобы очистить РНК, центрифугируйте при давлении 800 x g в течение 3 мин и выбросьте колонку. Очищенные РНК находятся в элюанте.

5. Реакция обратной транскрипции (ОТ)

ПРИМЕЧАНИЕ: Следующая настройка реакции RT (см. Таблицу материалов) соответствует протоколу производителя с незначительными изменениями, обеспечивающими совместимость с AQRNA-seq.

1. Приготовьте реакцию отжига ОТ-праймера в стерильной ПЦР-пробирке, добавив 24 мкл матричных РНК (продукты из стадии 4), 1 мкл 2 мкМ праймера ОТ (табл. 1) и 1 мкл dNTP (по 10 мМ каждого типа нуклеотидов).
2. Инкубировать при 80 °C в течение 2 мин до отжига праймеров RT до матричных РНК, а затем немедленно охладить на льду в течение 2 мин.
3. Приготовьте реакцию RT, добавив в реакционную пробирку для отжига 6 мкл 5-кратного реакционного буфера, 1 мкл ингибитора РНКазы 40 Ед/мкл и 1 мкл обратной транскриптазы.
4. Инкубировать при 50 °C в течение 2 ч для обратной транскрибации РНК-матриц, а затем при 70 °C в течение 15 мин для инактивации фермента. Продукты ОТ (т.е. гибриды РНК-кДНК) могут храниться при температуре 4 °C или -20 °C в течение ночи.

6. Гидролиз РНК

1. Добавьте 1 мкл 5 М NaOH в гибрид РНК-кДНК (продукты из этапа 5). Инкубировать при температуре 93 °C в течение 3 мин для гидролиза нити РНК гибрида РНК-кДНК.
2. Добавьте 0,77 мкл 5 М HCl для нейтрализации реакции. После добавления HCl перемешайте и поверните вниз по трубке. Нейтрализация происходит мгновенно.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Рекомендуется проверить точное количество 5 М HCl, необходимое для нейтрализации 1 мкл NaOH (например, с помощью pH-полосок) в буферных условиях.
3. Очистите одноцепочечные кДНК с помощью колонки. Используйте набор для восстановления и очистки ДНК/РНК (см. Таблицу материалов). Следуйте протоколу, описанному в шаге 2.3, чтобы выполнить очистку колонки.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Комплекты, использующие технологию гелевой фильтрации для удаления концеваторов красителей из реакций секвенирования (см. Таблицу материалов), не могут быть использованы здесь из-за изменения pH на предыдущих этапах.
4. Скоростной вакуум очищенной кДНК до < 5 μл, а затем добавьте воду, не содержащую РНКазы, чтобы довести объем до 5 μл. Будьте осторожны, чтобы не отсосить кДНК до полной сухости.
5. Перенесите очищенные кДНК в стерильную ПЦР-пробирку. Очищенные кДНК могут храниться при температуре -20 °C до 1 недели.

7. Лигирование линкера 2 к 3'-концу кДНК

1. Приготовьте реакцию лигирования Linker 2 в стерильной ПЦР-пробирке, добавив 5 мкл кДНК (продукты из стадии 6), 1 л 50 мкМ Линкера 2 (Таблица 1), 2 мкл 10x T4 реакционного буфера ДНК-лигазы, 1 мкл 10 мМ АТФ, 9 мкл PEG8000 (50% раствор) и 2 мкл 400 ед/мкл ДНК-лигазы T4.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Реагенты могут быть превращены в мастер-смесь для облегчения обработки образцов. Не включайте PEG8000 и Т4 ДНК-лигазу в мастер-микс.
2. Инкубировать при 16 °C в течение 16 ч для лигирования Linker 2 к кДНК.
3. Очистите кДНК с помощью Linker-2-лигирования. Используйте набор для восстановления и очистки ДНК/РНК (см. Таблицу материалов). Следуйте протоколу, описанному в шаге 2.3, чтобы выполнить очистку колонки.

8. Удаление лишнего Линкера 2

1. Приготовьте реакцию деденилирования в стерильной ПЦР-пробирке, добавив 16 мкл кДНК, лигированных линкер-2, 2 мкл 10-кратного буфера 2 набора и 2 мкл 50 ед/мкл 5'-деденилазы. Инкубировать при 30 °C в течение 1 ч, чтобы удалить аденин на 5'-конце линкера 2.
2. Добавьте 2 мкл 30 U/μL RecJf в реакцию омертвения. Инкубировать при 37 °C в течение 30 минут, чтобы переварить избыток Linker 2. Добавьте в реакцию еще 2 мкл 30 ед/мкл RecJf.
3. Инкубировать при 37 °C в течение 30 минут, чтобы продолжить переваривание избытка Линкера 2, а затем при 65 °C в течение 20 минут, чтобы денатурировать фермент.

9. ПЦР-амплификация кДНК с помощью секвенирующих праймеров

1. Назначьте образцам праймеры для ПЦР. Для эффективного мультиплексирования каждый образец нуждается в уникальной комбинации прямых и обратных праймеров (Таблица 1).
2. Добавьте воду, не содержащую РНКазы, чтобы довести объем образца до 25 мкл. Сохраните 5 мкл каждого образца в стерильной ПЦР-пробирке в качестве резерва на случай, если потребуется повторить ПЦР.
3. Приготовьте реакцию ПЦР (см. Таблицу материалов для набора для ПЦР), добавив 20 мкл кДНК (продукты из стадии 8), 1 мкл прямого праймера 2,5 мкм, 1 мкл обратного праймера 2,5 мкм, 25 мкл 2x буфера ДНК-полимеразы, 2 мкл воды, не содержащей РНКазы, и 1 мкл ДНК-полимеразы.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Реагенты могут быть превращены в мастер-смесь для облегчения обработки образцов. Не добавляйте ДНК-полимеразу в мастер-смесь.
4. Проводят ПЦР с начальной денатурацией при 94 °С в течение 1 мин с последующим проведением 18 циклов денатурации при 98 °С в течение 20 с - отжиг при 58 °С в течение 20 с - удлинение при 68 °С в течение 1 мин.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Не амплифицируйте ПЦР за пределами линейного диапазона. В общей сложности 18 циклов будут оптимальными для большинства экспериментов, но это может зависеть от контекста.
5. Скоростно вакуумируйте ПЦР-продукты до менее чем 25 μл, а затем добавьте воду, не содержащую РНКазы, чтобы довести объем до 25 μл. Переложите 5 μЛ ПЦР-продуктов в стерильную пробирку объемом 0,5 мл для проверки распределения по размерам (см. шаг 9.6). Храните оставшиеся 20 мкл продуктов ПЦР при температуре -20 °C до дальнейших действий.
6. Проверьте распределение продуктов ПЦР по размерам, как описано ниже.
   1. Приготовьте 3% агарозный гель в буфере TAE.
      ПРИМЕЧАНИЕ: В этом протоколе бромид этидия (EtBr) используется для окрашивания гелем после электрофореза (см. шаг 9.6.5). Соответствующие красители ДНК могут быть добавлены в раствор геля на этом этапе или использованы для окрашивания гелем позже.
   2. Смешайте 1 мкл 6-кратного загрузочного красителя с 5 мкл продуктов ПЦР (начиная с шага 9.5) и загрузите гель со смесью.
   3. Загрузите 5 мкл ДНК-трапов в лунку перед первым образцом и в лунку после последнего образца. Используйте лестницы ДНК 50.о. или 100.о., чтобы обеспечить улучшенную дискриминацию по размеру продуктов ПЦР в диапазоне от 150 до 300.о.
   4. Запустите гель-электрофорез для определения местоположения продуктов ПЦР. Соответствующее условие выполнения может зависеть от контекста. Здесь работайте при напряжении 120 В, 400 мА в течение 75 минут для гелевой плиты размером 17,78 см (ширина) x 10,16 см (высота) x 1 см (толщина).
   5. Поместите гель в коробку и заполните коробку деионизированной (DI) водой до полного погружения геля. Добавьте 10 μL EtBr в деионизированную воду, пропитанную гелем. Оберните коробку фольгой и поставьте ее на шейкер. Окрашивайте гель в течение 30 минут, встряхивая.
   6. Выбросьте отходы, содержащие EtBr, в бутылку для отходов, помещенную в вытяжной шкаф. Промойте гель деионизированной водой один раз и слейте воду, содержащую EtBr, в бутылку для отходов.
   7. Заполните коробку водой DI до полного погружения геля. Оберните коробку фольгой и поставьте ее на шейкер. Смойте гель в течение 10 минут, встряхивая.
   8. Слейте воду, содержащую EtBr, в бутылку для отходов в вытяжном шкафу. Используйте гелевый тепловизор для визуализации полос. Получите изображение геля с высоким разрешением.

10. Очищение гелем

1. Приготовьте 3% агарозный гель в буфере TAE. Приготовьте гель толщиной 1 см с помощью широких гребней (толщина 1 мм; ширина 5 мм; глубина 15 мм) таким образом, чтобы каждая лунка могла содержать не менее 25 μл смеси красителей для загрузки образцов.
2. Смешайте 4 мкл 6-кратного загрузочного красителя с 20 мкл продуктов ПЦР (начиная с шага 9.5) и загрузите смесь в гель. Оставляйте пустые полосы между образцами, чтобы свести к минимуму перекрестное загрязнение во время иссечения геля.
3. Загрузите лестницы ДНК, запустите гель-электрофорез, покрасьте и промойте гель, а также сделайте изображения геля, как описано в шаге 9.6.
4. Удалите гелевые блоки, содержащие продукты ПЦР в пределах целевого диапазона размеров. Для минимизации контаминации димерами праймеров (линкеры 175.о. без вставок) экстрагируют продукты ПЦР размером более 195.о. (175.о. линкеров + 20.н. микроРНК).
5. Очистите продукты ПЦР с помощью экстракции гелем. Используйте набор для экстракции геля (см. Таблицу материалов). Протокол очистки основан на протоколе производителя с незначительными изменениями для совместимости с AQRNA-seq. Все этапы центрифугирования следует проводить при 17 900 x g в течение 1 мин с использованием настольной центрифуги при комнатной температуре, если не указано иное. Выполните действия, описанные ниже.
   1. Измерьте вес гелевых блоков внутри пробирок. Добавьте 6 объемов Buffer QG (входит в комплект) в 1 объем гелевого блока (1 мг геля составляет примерно 1 μл).
   2. Выдерживать при температуре 50 °C в течение 10 мин или до полного растворения гелевых блоков. Делайте вихревые трубки каждые 2 минуты для облегчения растворения геля. После растворения геля смесь должна напоминать цвет Buffer QG без растворенного геля. Если цвет оранжевый или фиолетовый, добавьте 10 мкл 3 М ацетата натрия (pH = 5,0) и тщательно перемешайте.
   3. Добавьте в смесь 1 гель объема изопропанола и тщательно перемешайте. Поместите спиновую колонку в сборную пробирку объемом 2 мл (входит в комплект).
   4. Чтобы связать ДНК, нанесите образец (до 750 мкл каждый раз) на колонку и центрифугу. Выбросьте проточный поток и поместите колонну обратно в ту же сборную трубу. Максимальное количество геля на спин-колонку составляет 400 мг.
   5. Добавьте 500 μL Buffer QG в колонку и центрифугу. Выбросьте проточный поток и поместите колонну обратно в ту же сборную трубу.
   6. Чтобы смыть загрязнения, добавьте в колонку 750 μL Buffer PE (входит в комплект) в колонку, дайте колонке постоять 5 минут и центрифугируйте. Выбросьте проточный поток и поместите колонну обратно в ту же сборную трубу. Еще раз центрифугируйте для удаления остатков промывочного буфера.
   7. Поместите колонку в стерильную пробирку объемом 1,5 мл. Чтобы элюировать ДНК, добавьте 30 μL Buffer EB (входит в комплект) в центр мембраны колонки, дайте колонке постоять 4 минуты и центрифугируйте.
   8. Speed-vac и ресуспендирование очищенных гелем продуктов ПЦР в 12 мкл Buffer EB.
6. Измерьте концентрацию сконструированных библиотек с помощью УФ-видимой спектрофотометрии и/или флуориметрического количественного анализа.

11. Библиотечное секвенирование

1. Отправьте созданные библиотеки во внешний центр секвенирования для оценки качества и секвенирования Illumina. Чтобы обеспечить достаточную чувствительность при количественном картировании малых РНК-ландшафтов, выбирайте парное секвенирование с чтением 75.о. с каждого направления (т.е. PE75), стремясь получить не менее 1,5 млн прочтений необработанной последовательности в каждом направлении для каждого образца. Используйте пользовательские праймеры (Таблица 1) для секвенирования NextSeq, но это необязательно для секвенирования в MiSeq.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Секвенирование может быть выполнено с помощью платформ MiSeq или NextSeq500. Выбор платформы может зависеть от характера образцов и общего количества образцов.

12. Конвейер анализа данных

ПРИМЕЧАНИЕ: На рисунке 2 представлена графическая иллюстрация упрощенных процедур, задействованных в конвейере анализа данных, который принимает в качестве входных данных необработанные последовательности (в формате FASTQ) и генерирует матрицу распространенности со строками, представляющими члены малых видов РНК, представляющими интерес, и столбцами, представляющими образцы. Для парного секвенирования каждый образец соответствует двум файлам FASTQ, один для прямого чтения, а другой для обратного чтения. Полный конвейер анализа данных со всеми связанными скриптами и руководством с подробными аннотациями для каждого шага доступен на GitHub (https://github.com/Chenrx9293/AQRNA-seq-JoVE.git).

1. Извлекайте необработанные чтения последовательностей из внешнего центра секвенирования и оценивайте качество секвенирования с помощью программ с открытым исходным кодом, таких как FastQC¹⁴ или fastp¹⁵.
2. Создание библиотеки опорных последовательностей в формате FASTA.
   Примечание: Ключом к адаптивности конвейера к различным классам малых РНК является подходящая библиотека референсных последовательностей. Для получения точных оценок численности членов конкретных классов РНК, представляющих интерес (например, микроРНК), ожидается, что пользователи будут тщательно курировать библиотеку референсных последовательностей для использования с конвейером. Все остальные инструкции для выполнения конвейера остаются согласованными для разных классов малых РНК.
3. Создайте каталог с именем AQRNA-seq для реализации конвейера анализа данных и поместите в него все скрипты, отфильтрованные по качеству чтения последовательностей и библиотеку ссылочных последовательностей. Следуйте подробным инструкциям на GitHub (https://github.com/Chenrx9293/AQRNA-seq-JoVE.git) для подготовки подкаталогов и внесения существенных изменений в файлы для нацеливания на различные организмы и/или малые виды РНК, а также для совместимости операционной системы и/или планировщика заданий.
4. Реализуйте конвейер анализа данных, следуя инструкциям, описанным в руководстве на GitHub (https://github.com/Chenrx9293/AQRNA-seq-JoVE.git), которое содержит описания, входные и выходные файлы, а также командные строки для каждого шага. Таким образом, конвейер включает в себя (i) обрезку линкерных последовательностей и случайных нуклеотидов из прочтений, (ii) фильтрацию прочтений на основе их длины, (iii) отображение прочтений на референсные последовательности, (iv) разрешение неоднозначных отображений и (v) генерацию матрицы распространенности.

Результаты

Mycobacterium bovis Штамм БЦЖ (bacilli de Calmette et Guérin) 1173P2, претерпевающий экспоненциальный рост, подвергался временным рядам (0, 4, 10 и 20 дней) питательного голодания с последующей 6-дневной реанимацией в богатой питательными веществами среде, как это было представлено ранее в Hu et ^al.7. М?...

Обсуждение

Рабочий процесс подготовки библиотеки AQRNA-seq предназначен для максимального захвата РНК в образце и минимизации падения полимеразы во время обратной транскрипции⁷. С помощью двухэтапного линкерного лигирования новые олигонотиды ДНК (Линкер 1 и Линкер 2) лигируются в избытк...

Материалы

Name	Company	Catalog Number	Comments
2-ketoglutarate	Sigma-Aldrich	75890	Prepare a working solution (1 M) and store it at -20ºC
2100 Bioanalyzer Instrument	Agilent	G2938C
Adenosine 5'-Triphosphate (ATP)	New England Biolabs	M0437M (component #: N0437AVIAL)	NEB M0437M contains T4 RNA Ligase 1 (30 U/μL), T4 RNA Ligase Reaction Buffer (10X), PEG 8000 (1X), and ATP (100 mM); prepare a working solution (10 mM) and store it at -20ºC
AGAROSE GPG/LE	AmericanBio	AB00972-00500	Store at ambient temperature
Ammonium iron(II) sulfate hexahydrate	Sigma-Aldrich	F2262	Prepare a working solution (0.25 M) and store it at -20 °C
Bioanalyzer Small RNA Analysis	Agilent	5067-1548	The Small RNA Analysis is used for checking the quality of input RNAs and the efficiency of enzymatic reactions (e.g., Linker 1 ligation)
Bovine Serum Albumin (BSA; 10 mg/mL)	New England Biolabs	B9000	This product was discontinued on 12/15/2022 and is replaced with Recombinant Albumin, Molecular Biology Grade (NEB B9200).
Chloroform	Macron Fine Chemicals	4441-10
Demethylase	ArrayStar	AS-FS-004	Demethylase comes with the rtStar tRNA Pretreatment & First-Strand cDNA Synthesis Kit (AS-FS-004)
Deoxynucleotide (dNTP) Solution Mix	New England Biolabs	N0447L (component #: N0447LVIAL)	This dNTP Solution Mix contains equimolar concentrations of dATP, dCTP, dGTP and dTTP (10 mM each)
Digital Dual Heat Block	VWR Scientific Products	13259-052	Heating block is used with the QIAquick Gel Extraction Kit
DyeEx 2.0 Spin Kit	Qiagen	63204	Effective at removing short remnants (e.g., oligos less than 10 bp in length)
Electrophoresis Power Supply	Bio-Rad Labrotories	PowerPac 300
Eppendorf PCR Tubes (0.5 mL)	Eppendorf	0030124537
Eppendorf Safe-Lock Tubes (0.5 mL)	Eppendorf	022363611
Eppendorf Safe-Lock Tubes (1.5 mL)	Eppendorf	022363204
Eppendorf Safe-Lock Tubes (2 mL)	Eppendorf	022363352
Ethyl alcohol (Ethanol), Pure	Sigma-Aldrich	E7023	The pure ethanol is used with the Oligo Clean and Concentrator Kit from Zymo Research
Gel Imaging System	Alpha Innotech	FluorChem 8900
Gel Loading Dye, Purple (6X), no SDS	New England Biolabs	N0556S (component #: B7025SVIAL)	NEB N0556S contains Quick-Load Purple 50 bp DNA Ladder and Gel Loading Dye, Purple (6X), no SDS
GENESYS 180 UV-Vis Spectrophotometer	Thermo Fisher Scientific	840-309000	The spectrophotometer is used for measuring the oligo concentrations using the Beer's law
HEPES	Sigma-Aldrich	H4034	Prepare a working solution (1 M; pH = 8 with NaOH) and store it at -20 °C
Hydrochloric acid (HCl)	VWR Scientific Products	BDH3028	Prepare a working solution (5 M) and store it at ambient temperature
Isopropyl Alcohol (Isopropanol), Pure	Macron Fine Chemicals	3032-16	Isopropanol is used with the QIAquick Gel Extraction Kit
L-Ascorbic acid	Sigma-Aldrich	A5960	Prepare a working solution (0.5 M) and store it at -20ºC
Microcentrifuge	Eppendorf	5415D
NanoDrop 2000 Spectrophotometer	Thermo Fisher Scientific	ND-2000
NEBuffer 2 (10X)	New England Biolabs	M0264L (component #: B7002SVIAL)	NEB M0264L contains RecJf (30 U/μL) and NEBuffer 2 (10X); store at -20 °C
Nuclease-Free Water (not DEPC-Treated)	Thermo Fisher Scientific	AM9938
Oligo Clean & Concentrator Kit	Zymo Research	D4061	Store at ambient temperature
PEG 8000 (50% solution)	New England Biolabs	M0437M (component #: B1004SVIAL)	NEB M0437M contains T4 RNA Ligase 1 (30 U/μL), T4 RNA Ligase Reaction Buffer (10X), PEG 8000 (1X), and ATP (100 mM); prepare a working solution (10 mM) and store it at -20ºC
Peltier Thermal Cycler	MJ Research	PTC-200
Phenol:choloroform:isoamyl alcohol 25:24:1 pH = 5.2	Thermo Fisher Scientific	J62336
PrimeScript Buffer (5X)	TaKaRa	2680A
PrimeScript Reverse Transcriptase	TaKaRa	2680A
QIAquick Gel Extraction Kit	Qiagen	28704	This kit requires a heating block and isopropanol to work with
Quick-Load Purple 100 bp DNA Ladder	New England Biolabs	N0551S (component #: N0551SVIAL)
Quick-Load Purple 50 bp DNA Ladder	New England Biolabs	N0556S (component #: N0556SVIAL)	NEB N0556S contains Quick-Load Purple 50 bp DNA Ladder and Gel Loading Dye, Purple (6X), no SDS
RecJf (30 U/μL)	New England Biolabs	M0264L (component #: M0264LVIAL)	NEB M0264L contains RecJf (30 U/μL) and NEBuffer 2 (10X); store at -20 °C
RNase Inhibitor (murine; 40 U/μL)	New England Biolabs	M0314L (component #: M0314LVIAL)	Store at -20 °C
SeqAMP DNA Polymerase	TaKaRa	638509	TaKaRa 638509 contains SeqAMP DNA Polymerase and SeqAMP PCR Buffer (2X)
SeqAMP PCR Buffer (2X)	TaKaRa	638509	TaKaRa 638509 contains SeqAMP DNA Polymerase and SeqAMP PCR Buffer (2X)
Shrimp Alkaline Phosphatase (1 U/μL)	New England Biolabs	M0371L (component #: M0371LVIAL)
Sodium hydroxide (NaOH)	Sigma-Aldrich	S5881	Prepare a working solution (5 M) and store it at ambient temperature
T4 DNA Ligase (400 U/μL)	New England Biolabs	M0202L (component #: M0202LVIAL)	NEB M0202L contains T4 DNA Ligase (400 U/μL) and T4 DNA Ligase Reaction Buffer (10X)
T4 DNA Ligase Reaction Buffer (10X)	New England Biolabs	M0202L (component #: B0202SVIAL)	NEB M0202L contains T4 DNA Ligase (400 U/μL) and T4 DNA Ligase Reaction Buffer (10X)
T4 RNA Ligase 1 (30 U/μL)	New England Biolabs	M0437M (component #: M0437MVIAL)	NEB M0437M contains T4 RNA Ligase 1 (30 U/μL), T4 RNA Ligase Reaction Buffer (10X), PEG 8000 (1X), and ATP (100 mM)
T4 RNA Ligase Reaction Buffer (10X)	New England Biolabs	M0437M (component #: B0216SVIAL)	NEB M0437M contains T4 RNA Ligase 1 (30 U/μL), T4 RNA Ligase Reaction Buffer (10X), PEG 8000 (1X), and ATP (100 mM)