AQRNA-seq para quantificar RNAs pequenos

Resumo

O sequenciamento de RNA de quantificação absoluta (AQRNA-seq) é uma tecnologia desenvolvida para quantificar a paisagem de todos os pequenos RNAs em misturas biológicas. Aqui, as etapas de preparação da biblioteca e processamento de dados do AQRNA-seq são demonstradas, quantificando as mudanças no pool de RNA de transferência (tRNA) em Mycobacterium bovis BCG durante a dormência induzida por fome.

Resumo

O AQRNA-seq fornece uma relação linear direta entre o sequenciamento de contagens de leitura e pequenos números de cópias de RNA em uma amostra biológica, permitindo assim a quantificação precisa do conjunto de pequenos RNAs. O procedimento de preparação da biblioteca AQRNA-seq descrito aqui envolve o uso de ligantes de sequenciamento personalizados e uma etapa para reduzir as modificações do RNA de metilação que bloqueiam a processividade da transcrição reversa, o que resulta em um aumento do rendimento de cDNAs de comprimento total. Além disso, é apresentada uma implementação detalhada do pipeline de bioinformática que o acompanha. Esta demonstração de AQRNA-seq foi conduzida por meio de uma análise quantitativa dos 45 tRNAs em Mycobacterium bovis BCG colhidos em 5 dias selecionados em um curso de 20 dias de privação de nutrientes e 6 dias de ressuscitação. Os esforços contínuos para melhorar a eficiência e o rigor do AQRNA-seq também serão discutidos aqui. Isso inclui explorar métodos para evitar a purificação do gel para mitigar os problemas de dímero do primer após a amplificação por PCR e aumentar a proporção de leituras completas para permitir um mapeamento de leitura mais preciso. Aprimoramentos futuros do AQRNA-seq serão focados em facilitar a automação e a implementação de alto rendimento dessa tecnologia para quantificar todas as pequenas espécies de RNA em amostras de células e tecidos de diversos organismos.

Introdução

O sequenciamento de próxima geração (NGS), também conhecido como sequenciamento massivamente paralelo, é uma tecnologia de sequenciamento de DNA que envolve fragmentação de DNA, ligação de oligonucleotídeos adaptadores, amplificação baseada em reação em cadeia da polimerase (PCR), sequenciamento do DNA e remontagem das sequências de fragmentos em um genoma. A adaptação do NGS ao RNA de sequência (RNA-seq) é uma abordagem poderosa para identificar e quantificar transcritos de RNA e suas variantes¹. Desenvolvimentos inovadores nos fluxos de trabalho de preparação de bibliotecas de RNA e pipelines de análise bioinformática, juntamente com avanços na instrumentação laboratorial, expandiram o repertório de aplicações de RNA-seq, progredindo além do sequenciamento do exoma para ômicas funcionais avançadas, como perfil de RNA não codificante², análise de célula única³, transcriptômica espacial ^4,5, análise de splicing alternativa⁶, entre outros. Esses métodos avançados de RNA-seq revelam funções complexas de RNA por meio da análise quantitativa do transcriptoma em células e tecidos normais e doentes.

Apesar desses avanços no RNA-seq, várias características técnicas importantes limitam o poder quantitativo do método. Embora a maioria dos métodos de RNA-seq permita a quantificação precisa e exata das mudanças nos níveis de RNAs entre variáveis experimentais (ou seja, amostras biológicas e/ou estados fisiológicos), eles não podem fornecer comparações quantitativas dos níveis de moléculas de RNA dentro de uma amostra. Por exemplo, a maioria dos métodos de RNA-seq não pode quantificar com precisão o número relativo de cópias de moléculas isoaceitadoras de tRNA individuais em um pool celular de tRNAs expressos. Conforme destacado na publicação complementar⁷, essa limitação ao RNA-seq surge de várias características da estrutura do RNA e da bioquímica da preparação da biblioteca. Por exemplo, a atividade das enzimas de ligação usadas para ligar os ligantes de sequenciamento de extremidade 3' e 5' às moléculas de RNA é fortemente influenciada pela identidade dos nucleotídeos terminais do RNA e dos ligantes de sequenciamento. Isso leva a grandes variações nas eficiências das ligações de ligantes e profundos aumentos artefactuais nas leituras de sequenciamento ^8,9,10.

Um segundo conjunto de limitações surge das propriedades estruturais inerentes das moléculas de RNA. Especificamente, a formação da estrutura secundária do RNA e as mudanças dinâmicas nas dezenas de modificações pós-transcricionais do RNA do epitranscriptoma podem causar queda ou mutação da polimerase durante a transcrição reversa. Esses erros resultam em síntese de cDNA incompleta ou truncada ou sequência de RNA alterada. Embora ambos os fenômenos possam ser explorados para mapear estruturas secundárias ou algumas modificações, eles degradam a precisão quantitativa do RNA-seq se as etapas subsequentes de preparação da biblioteca falharem em capturar cDNAs truncados ou se o processamento de dados descartar sequências mutantes que não correspondem a um conjunto de dados de referência^{11 , 12} . Além disso, a imensa diversidade química, de comprimento e estrutural dos transcritos de RNA, bem como a falta de ferramentas para fragmentar uniformemente RNAs longos, diminui a aplicabilidade da maioria dos métodos de RNA-seq a todas as espécies de RNA¹³.

O método AQRNA-seq (sequenciamento de RNA de quantificação absoluta) foi desenvolvido para remover várias dessas restrições técnicas e biológicas que limitam a precisão quantitativa⁷. Ao minimizar os vieses dependentes de sequência na captura, ligação e amplificação durante a preparação da biblioteca de sequenciamento de RNA, o AQRNA-seq atinge linearidade superior em comparação com outros métodos, quantificando com precisão 75% de uma biblioteca de referência de 963 miRNAs com precisão de 2 vezes. Essa correlação linear de sequenciamento, contagem de leitura e abundância de RNA também é observada em uma análise de um conjunto de comprimentos variáveis de padrões de oligonucleotídeos de RNA e em referência a métodos ortogonais como northern blotting. Estabelecer linearidade entre a contagem de leitura de sequenciamento e a abundância de RNA permite que o AQRNA-seq alcance uma quantificação precisa e absoluta de todas as espécies de RNA em uma amostra.

Aqui está uma descrição do protocolo para o fluxo de trabalho de preparação da biblioteca AQRNA-seq e o pipeline de análise de dados downstream que o acompanha. O método foi aplicado para elucidar a dinâmica da abundância de tRNA durante a dormência induzida pela fome e subsequente ressuscitação no modelo de tuberculose Mycobacterium bovis bacilos de Calmette et Guérin (BCG). Os resultados foram apresentados para a visualização exploratória dos dados de sequenciamento, juntamente com análises subsequentes de agrupamento e expressão diferencial que revelaram padrões discerníveis na abundância de tRNA associados a vários fenótipos.

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Protocolo

NOTA: A Figura 1 fornece uma ilustração gráfica dos procedimentos envolvidos na preparação da biblioteca AQRNA-seq. Informações detalhadas sobre os reagentes, produtos químicos e colunas/kits usados no procedimento podem ser encontradas na Tabela de Materiais. Recomenda-se realizar uma avaliação abrangente da pureza, integridade e quantidade das amostras de RNA de entrada usando (i) eletroforese em gel de agarose a 3%, (ii) ferramentas de eletroforese automatizadas para controle de qualidade de amostras de biomoléculas (ver Tabela de Materiais) e (iii) espectrofotometria UV-Visível e/ou quantificação fluorométrica. É obrigatório manter todas as reações e mastermixes no gelo, a menos que especificado de outra forma. Transporte reagentes (por exemplo, enzimas) em caixas frigoríficas de e para armazenamento a -20 °C para preservar sua vida útil e evitar vários ciclos de congelamento e descongelamento de intermediários de biblioteca.

1. Desfosforilação de RNAs

NOTA: A remoção do 5'-fosfato (P; doador) impede a autoligação ao 3'-hidroxila (OH; aceitador) de RNAs. Os ligantes não se autoligam, pois sua extremidade 3 'é modificada para incorporar uma didesoxicitidina (Linker 1) ou um espaçador (Linker 2). Os ligantes só podem ser ligados juntando seu 5'-P ao 3'-OH dos RNAs ou cDNAs.

1. Prepare a reação de desfosforilação em um tubo de PCR estéril (por exemplo, tubo de 200 μL ou 500 μL) adicionando até 2 μL da amostra de RNA, 0,5 μL de inibidor de RNase 40 U/μL, 1 μL de padrão interno de 0,5 μM (Tabela 1), 0,5 μL de tampão de reação de RNA ligase 10x T4, 1 μL de fosfatase alcalina de camarão 1 U/μL, e água livre de RNase suficiente para elevar o volume total a 5 μL.
   NOTA: Para amostras típicas, 75 ng de RNAs (ou aproximadamente 2 pmol para um RNA de 80 nt) são considerados suficientes para a quantificação de pequenos RNAs usando este protocolo.
2. Incubar a 37 °C por 30 min para desfosforilar os RNAs e depois a 65 °C por 5 min para inativar a enzima e desnaturar os RNAs. Manter as amostras a 4 °C durante, pelo menos, 10 minutos para evitar a renaturalização.

2. Ligação do Linker 1 à extremidade 3' dos RNAs

1. Prepare a reação de ligação do Linker 1 em um tubo de PCR estéril adicionando 5 μL de RNAs desfosforilados (produtos da etapa 1), 0,5 μL de inibidor de RNase 40 U/μL, 1 μL de 100 μM Linker 1 (Tabela 1), 3 μL de ATP 10 mM, 2,5 μL de tampão de reação de RNA ligase 10x T4, 15 μL de PEG8000 (solução a 50%), 2 μL de 30 U/μL T4 RNA ligase 1 e 1 μL de água livre de RNase.
   NOTA: Os reagentes podem ser transformados em master mix para facilitar o processamento das amostras. Não inclua PEG8000 e T4 RNA ligase 1 na mistura principal.
2. Incubar a 25 °C por 2 h e depois a 16 °C por 16 h para ligar o Linker 1 aos RNAs.
3. Coluna - purificar os RNAs ligados ao Linker-1. Use um kit para recuperação e limpeza de DNA / RNA (consulte a Tabela de Materiais).
   NOTA: Este protocolo de purificação de coluna se aplica a todas as purificações de coluna subsequentes usando o mesmo kit. Kits que usam tecnologia de filtragem de gel para remover terminadores de corante de reações de sequenciamento (consulte Tabela de Materiais) não podem ser usados aqui, pois PEG8000 é incompatível com os filtros de gel de tais kits. Recomenda-se guardar uma alíquota (1,2 μL) de cada amostra após a purificação. Quando necessário, essas alíquotas podem ser usadas para verificar a eficiência da ligação executando um analisador comercial de ácido nucleico. Manter as restantes amostras purificadas congeladas ou a -20 °C até novas etapas.
   1. Para o volume da amostra < 50 μL, adicione água isenta de RNase para levá-la a 50 μL. Adicione 2 volumes do tampão de ligação oligo (fornecido no kit) a 1 volume da amostra. Adicionar 8 volumes de etanol a 100% a 1 volume da amostra.
   2. Carregue a amostra (até 750 μL de cada vez) em uma coluna colocada dentro de um tubo de coleta de 2 mL (fornecido no kit). Para ligar os RNAs à coluna, centrifugue a 10.000 x g por 30 s e descarte o fluxo (ou seja, o líquido no tubo de coleta). Coloque a coluna de volta no tubo de coleta.
   3. Para lavar as impurezas da coluna, adicione 750 μL do tampão de lavagem de DNA (fornecido no kit) à coluna. Centrifugue a 10.000 x g por 30 s e descarte o fluxo. Coloque a coluna de volta no tubo de coleta.
   4. Centrifugue na velocidade máxima (por exemplo, 16.000 x g para uma microcentrífuga de bancada) por mais 1 min para remover o tampão de lavagem de DNA residual.
   5. Para eluir os RNAs, mova cuidadosamente a coluna para um tubo estéril de 1,5 mL, adicione água livre de RNase à coluna. Use um volume maior do que o necessário ao eluir os RNAs para contabilizar a perda de volume potencial durante o processo de eluição. Por exemplo, se forem necessários 15 μL para a etapa seguinte, adicione 17 μL de água livre de RNase para eluição. Centrifugue a 10.000 x g por 30 s.

3. Remoção de metilações pós-transcricionais pela AlkB desmetilase

NOTA: AlkB é uma enzima bacteriana que remove grupos metil de alguns, mas não de todos, nucleotídeos metilados no DNA e RNA. A remoção de vários tipos de ribonucleotídeos metilados no RNA evita a queda da transcriptase reversa para permitir leituras mais completas e identificação de locais de modificação. Esta etapa precisa ser controlada em um pH baixo para evitar a degradação inesperada dos RNAs.

1. Preparar uma solução-mãe de 1 M de 2-cetoglutarato dissolvendo 1,4611 g de 2-cetoglutarato (146,11 g/M) em 10 ml de água isenta de RNase. Filtre e esterilize a solução através de um filtro de seringa de 0,2 μm. Aliquotar a solução-mãe para tubos estéreis de 2 ml e conservar a -20 °C.
2. Prepare uma solução estoque de ácido L-ascórbico 0,5 M dissolvendo 0,88 g de ácido L-ascórbico (176,12 g por M) em 10 mL de água livre de RNase. Filtre e esterilize a solução através de um filtro de seringa de 0,2 μm. Aliquotar a solução-mãe para tubos estéreis de 2 ml e conservar a -20 °C.
3. Prepare uma solução estoque de sulfato ferroso de amônio 0,25 M hexahidratado dissolvendo 0,9835 g de sulfato ferroso de amônio hexahidratado (392,14 g por M) em 10 mL de água livre de RNase. Filtre e esterilize a solução através de um filtro de seringa de 0,2 μm. Aliquotar a solução-mãe para tubos estéreis de 2 ml e conservar a -20 °C.
4. Preparar uma solução-mãe de HEPES 1 M dissolvendo 2,383 g de HEPES (238,30 g/M) em 10 ml de água isenta de RNase. Ajuste o pH da solução para 8 usando NaOH e esterilize o filtro da solução através de um filtro de seringa de 0,2 μm. Aliquotar a solução-mãe para tubos estéreis de 2 ml e conservar a -20 °C.
5. Prepare um tampão de reação 2x AlkB. Para fazer 10 mL do tampão, combine 1,5 μL de 1 M 2-cetoglutarato (feito na etapa 3.1), 80 μL de ácido L-ascórbico 0,5 M (feito na etapa 3.2), 6 μL de sulfato ferroso de amônio 0,25 M hexahidratado (feito na etapa 3.3), 100 μL de 10 mg / mL BSA, 1000 μL de 1 M HEPES (feito na etapa 3.4; adicione por último), e 8812,5 μL de água livre de RNase. Esterilize o tampão através de um filtro de seringa de 0,2 μm.
   NOTA: O tampão de reação 2x AlkB deve ser preparado imediatamente antes de cada experimento devido à labilidade química dos componentes.
6. Prepare a reação de digestão de AlkB em um tubo de PCR estéril adicionando 20 μL de RNAs ligados ao Linker-1 (produtos da etapa 2), 50 μL do tampão de reação 2x AlkB (feito na etapa 3.5), 2 μL de AlkB desmetilase, 1 μL de inibidor de RNase e 27 μL de água livre de RNase.
7. Incube em temperatura ambiente por 2 h para remover metilações pós-transcricionais dos RNAs.
8. Para remover AlkB da reação, siga as etapas descritas abaixo.
   1. Para uma separação de fases limpa, adicione 50 μL de água livre de RNase na reação AlkB e, em seguida, adicione 100 μL de fenol: clorofórmio: álcool isoamílico 25:24:1 (pH = 5,2).
   2. Agite com a mão por 10 s e, em seguida, centrifugue a 16.000 x g por 10 min. Certifique-se de que o rotor da centrífuga de bancada seja compatível com os tubos de PCR. Use adaptadores, se necessário.
   3. Transfira os RNAs (ou seja, a camada aquosa na parte superior; aproximadamente 140 μL) para um tubo estéril de 1,5 mL. Se o clorofórmio (ou seja, a camada inferior) for misturado à camada aquosa, centrifugue novamente com as mesmas configurações.
   4. Adicione 100 μL de clorofórmio aos RNAs extraídos para remover o fenol residual. Agite com a mão por 10 s e, em seguida, centrifugue a 16.000 x g por 10 min.
   5. Transfira os RNAs (ou seja, a camada aquosa na parte superior; aproximadamente 120 μL) para um tubo estéril de 1,5 mL.
9. Coluna - purificar os RNAs extraídos. Use um kit para recuperação e limpeza de DNA / RNA (consulte a Tabela de Materiais). Siga o protocolo detalhado na etapa 2.3 para realizar a purificação da coluna.

4. Remoção do excesso de Linker 1

NOTA: Recomenda-se guardar uma alíquota (1,2 μL) de cada amostra após a purificação. Quando necessário, essas alíquotas podem ser usadas para verificar a eficiência da digestão do RecJf executando um analisador comercial de ácido nucleico. Prossiga com as amostras purificadas imediatamente para reverter a transcrição.

1. Prepare a reação de deadenilação em um tubo de PCR estéril adicionando 15 μL de RNAs ligados ao Linker-1 (produtos da etapa 3), 1 μL de inibidor de RNase 40 U / μL, 2 μL de tampão de kit 10x 2 (consulte a Tabela de Materiais) e 2 μL de 50 U / μL 5'-deadenilase.
2. Incubar a 30 °C durante 1 h para remover a adenina na extremidade 5' do Linker 1. Adicione 2 μL de 30 U / μL RecJf na reação de deadenilação.
3. Incubar a 37 °C durante 30 min para digerir o excesso de Linker 1. Adicione mais 2 μL de 30 U / μL RecJf na reação.
4. Incubar a 37 °C durante 30 min para continuar a digestão do excesso de Linker 1 e depois a 65 °C durante 20 min para desnaturar a enzima.
5. Coluna - purificar os RNAs ligados ao Linker-1. Use um kit que use tecnologia de filtragem em gel para remover terminadores de corante de reações de sequenciamento (consulte Tabela de Materiais), pois é eficaz na remoção de restos curtos (por exemplo, oligonucleotídeos com comprimento de 2 a 10 pb). Siga as etapas descritas abaixo para purificação.
   1. Prepare colunas de filtro de gel de acordo com o protocolo do fabricante. Coloque uma coluna em um tubo estéril de 1,5 mL e carregue a coluna com 24 μL da amostra.
   2. Para purificar os RNAs, centrifugue a 800 x g por 3 min e descarte a coluna. Os RNAs purificados estão no eluente.

5. Reação de transcrição reversa (RT)

NOTA: A seguinte configuração de reação RT (consulte a Tabela de Materiais) segue o protocolo do fabricante, com pequenas modificações para permitir a compatibilidade com AQRNA-seq.

1. Prepare a reação de recozimento do primer RT em um tubo de PCR estéril adicionando 24 μL de RNAs molde (produtos da etapa 4), 1 μL de primer RT de 2 μM (Tabela 1) e 1 μL de dNTP (10 mM de cada tipo de nucleotídeos).
2. Incubar a 80 °C durante 2 min para recozer os primários RT para os RNAs molde e, em seguida, arrefecer imediatamente no gelo durante 2 min.
3. Prepare a reação RT adicionando 6 μL de tampão de reação 5x RT, 1 μL de inibidor de RNase 40 U / μL e 1 μL de transcriptase reversa no tubo de reação de recozimento.
4. Incubar a 50 °C por 2 h para transcrever reversamente os modelos de RNA e, em seguida, a 70 °C por 15 min para inativar a enzima. Os produtos RT (ou seja, híbridos de RNA-cDNA) podem ser armazenados a 4 ° C ou -20 ° C durante a noite.

6. Hidrólise de RNA

1. Adicione 1 μL de NaOH 5 M ao híbrido RNA-cDNA (produtos da etapa 5). Incubar a 93 °C por 3 min para hidrolisar a fita de RNA do híbrido RNA-cDNA.
2. Adicione 0,77 μL de HCl 5 M para neutralizar a reação. Depois de adicionar HCl, mexa para misturar e gire o tubo. A neutralização é instantânea.
   NOTA: Recomenda-se testar a quantidade precisa de 5 M HCl necessária para neutralizar 1 μL de NaOH (por exemplo, usando tiras de pH) em condições tamponadas.
3. Coluna - purificar os cDNAs de fita simples. Use um kit para recuperação e limpeza de DNA / RNA (consulte a Tabela de Materiais). Siga o protocolo detalhado na etapa 2.3 para realizar a purificação da coluna.
   NOTA: Os kits que usam tecnologia de filtragem em gel para remover os terminadores de corante das reações de sequenciamento (consulte a Tabela de Materiais) não podem ser usados aqui devido à variação de pH nas etapas anteriores.
4. Aspire rapidamente os cDNAs purificados a < 5 μL e, em seguida, adicione água livre de RNase para trazer o volume de volta a 5 μL. Tenha cuidado para não acelerar os cDNAs até a secura completa.
5. Transfira os cDNAs purificados para um tubo de PCR estéril. Os cDNAs purificados podem ser armazenados a -20 °C por até 1 semana.

7. Ligação do Linker 2 à extremidade 3' dos cDNAs

1. Prepare a reação de ligação do Linker 2 em um tubo de PCR estéril adicionando 5 μL de cDNAs (produtos da etapa 6), 1 μL de 50 μM Linker 2 (Tabela 1), 2 μL de tampão de reação de DNA ligase 10x T4, 1 μL de ATP 10 mM, 9 μL de PEG8000 (solução a 50%) e 2 μL de 400 U/μL de DNA ligase T4.
   NOTA: Os reagentes podem ser transformados em master mix para facilitar o processamento das amostras. Não inclua PEG8000 e T4 DNA ligase na mistura principal.
2. Incubar a 16 °C durante 16 h para ligar o Linker 2 aos cDNAs.
3. Purificar em coluna os cDNAs ligados ao Linker-2. Use um kit para recuperação e limpeza de DNA / RNA (consulte a Tabela de Materiais). Siga o protocolo detalhado na etapa 2.3 para realizar a purificação da coluna.

8. Remoção do excesso de Linker 2

1. Prepare a reação de deadenilação em um tubo de PCR estéril adicionando 16 μL de cDNAs ligados ao Linker-2, 2 μL de tampão de kit 10x 2 e 2 μL de 50 U / μL 5'-deadenilase. Incubar a 30 °C durante 1 h para remover a adenina na extremidade 5' do Linker 2.
2. Adicione 2 μL de 30 U / μL RecJf na reação de deadenilação. Incubar a 37 °C durante 30 min para digerir o excesso de Linker 2. Adicione mais 2 μL de 30 U / μL RecJf na reação.
3. Incubar a 37 °C durante 30 min para continuar a digestão do excesso de Linker 2 e depois a 65 °C durante 20 min para desnaturar a enzima.

9. Amplificação por PCR dos cDNAs com primers de sequenciamento

1. Atribua primers de PCR às amostras. Cada amostra precisa de uma combinação única de primers diretos e reversos (Tabela 1) para uma multiplexação eficaz.
2. Adicione água livre de RNase para elevar o volume da amostra para 25 μL. Guarde 5 μL de cada amostra em um tubo de PCR estéril como backup caso a PCR precise ser repetida.
3. Prepare a reação de PCR (consulte a Tabela de Materiais para o kit de PCR) adicionando 20 μL de cDNAs (produtos da etapa 8), 1 μL de primer direto de 2,5 μM, 1 μL de primer reverso de 2,5 μM, 25 μL de tampão de DNA polimerase 2x, 2 μL de água livre de RNase e 1 μL de DNA polimerase.
   NOTA: Os reagentes podem ser transformados em master mix para facilitar o processamento das amostras. Não adicione DNA polimerase à mistura principal.
4. Realizar PCR com uma desnaturação inicial a 94 °C durante 1 min, seguida de 18 ciclos de desnaturação a 98 °C durante 20 s - recozimento a 58 °C durante 20 s - extensão a 68 °C durante 1 min.
   NOTA: Não amplificar PCR além da faixa linear. Um total de 18 ciclos será ideal para a maioria dos experimentos, mas isso pode depender do contexto.
5. Acelere o vácuo dos produtos de PCR para menos de 25 μL e, em seguida, adicione água livre de RNase para trazer o volume de volta para 25 μL. Transfira 5 μL dos produtos de PCR para um tubo estéril de 0,5 mL para verificar a distribuição de tamanho (consulte a etapa 9.6). Armazene os 20 μL restantes dos produtos de PCR a -20 °C até novas etapas.
6. Verifique a distribuição de tamanho dos produtos de PCR conforme descrito abaixo.
   1. Prepare gel de agarose a 3% em tampão TAE.
      NOTA: Neste protocolo, o brometo de etídio (EtBr) é usado para coloração em gel pós-eletroforese (consulte a etapa 9.6.5). Colorações de DNA apropriadas podem ser adicionadas à solução de gel nesta etapa ou usadas para coloração de gel posteriormente.
   2. Misture 1 μL de corante de carga 6x em 5 μL de produtos de PCR (da etapa 9.5) e carregue o gel com a mistura.
   3. Carregue 5 μL de escadas de DNA no poço antes da primeira amostra e no poço após a última amostra. Use escadas de DNA de 50 pb ou 100 pb para permitir uma melhor discriminação de tamanho de produtos de PCR entre 150 pb e 300 pb.
   4. Execute a eletroforese em gel para localizar os produtos de PCR. A condição de funcionamento apropriada pode depender do contexto. Aqui, opere a 120 V, 400 mA por 75 min para uma placa de gel de 17,78 cm (largura) x 10,16 cm (altura) x 1 cm (espessura).
   5. Coloque o gel em uma caixa e encha a caixa com água deionizada (DI) até que o gel esteja completamente imerso. Adicione 10 μL de EtBr na água DI embebendo o gel. Embrulhe a caixa com papel alumínio e coloque-a em uma coqueteleira. Manchar o gel durante 30 min enquanto agita.
   6. Descarte os resíduos contendo EtBr em uma garrafa de lixo colocada em uma capela. Enxágue o gel com água DI uma vez e descarte a água contendo EtBr no frasco de resíduos.
   7. Encha a caixa com água DI até que o gel esteja completamente imerso. Embrulhe a caixa com papel alumínio e coloque-a em uma coqueteleira. Lave o gel por 10 min agitando.
   8. Descarte a água contendo EtBr na garrafa de resíduos na hotte. Use um gerador de imagens de gel para visualizar as bandas. Adquira uma imagem de alta resolução do gel.

10. Purificação do gel

1. Prepare gel de agarose a 3% em tampão TAE. Faça um gel de 1 cm de espessura com pentes largos (1 mm de espessura; 5 mm de largura; 15 mm de profundidade), de modo que cada poço possa conter pelo menos 25 μL de mistura de corante para carregamento de amostra.
2. Misture 4 μL de corante de carga 6x com 20 μL de produtos de PCR (da etapa 9.5) e carregue o gel com a mistura. Deixe faixas vazias entre as amostras para minimizar a contaminação cruzada durante a excisão do gel.
3. Carregue escadas de DNA, execute eletroforese em gel, manche e lave o gel e tire imagens de gel conforme descrito na etapa 9.6.
4. Extirpar os blocos de gel que contêm produtos de PCR dentro da faixa de tamanho alvo. Para minimizar a contaminação com dímeros de primer (ligantes de 175 pb sem inserções), extraia produtos de PCR com tamanho acima de 195 pb (ligantes de 175 pb + miRNAs de 20 pb).
5. Purifique os produtos de PCR usando extração em gel. Use um kit de extração de gel (consulte a Tabela de Materiais). O protocolo de purificação é baseado no protocolo do fabricante, com pequenas modificações para compatibilidade com AQRNA-seq. Todas as etapas de centrifugação devem ser conduzidas a 17.900 x g por 1 min usando uma centrífuga de bancada à temperatura ambiente, a menos que especificado de outra forma. Siga as etapas descritas abaixo.
   1. Meça o peso dos blocos de gel dentro dos tubos. Adicione 6 volumes de tampão QG (fornecido no kit) a 1 volume de bloco de gel (1 mg de gel é aproximadamente 1 μL).
   2. Incubar a 50 °C durante 10 min ou até à dissolução completa dos blocos de gel. Tubos de vórtice a cada 2 minutos para facilitar a dissolução do gel. Depois de dissolver o gel, a mistura deve se parecer com a cor do Buffer QG sem o gel dissolvido. Se a cor for laranja ou violeta, adicione 10 μL de acetato de sódio 3 M (pH = 5,0) e misture bem.
   3. Adicione 1 volume de gel de isopropanol à mistura e misture bem. Coloque uma coluna giratória em um tubo de coleta de 2 mL (fornecido no kit).
   4. Para ligar o DNA, aplique a amostra (até 750 μL de cada vez) na coluna e na centrífuga. Descarte o fluxo e coloque a coluna de volta no mesmo tubo de coleta. A quantidade máxima de gel por coluna de centrifugação é de 400 mg.
   5. Adicione 500 μL de tampão QG à coluna e centrifugue. Descarte o fluxo e coloque a coluna de volta no mesmo tubo de coleta.
   6. Para lavar as impurezas, adicione 750 μL de Buffer PE (fornecido no kit) à coluna, deixe a coluna repousar por 5 min e centrifugue. Descarte o fluxo e coloque a coluna de volta no mesmo tubo de coleta. Centrifugue mais uma vez para remover o tampão de lavagem residual.
   7. Coloque a coluna em um tubo estéril de 1,5 mL. Para eluir o DNA, adicione 30 μL de tampão EB (fornecido no kit) ao centro da membrana da coluna, deixe a coluna repousar por 4 min e centrifugue.
   8. Acelere e ressuspenda os produtos de PCR purificados em gel em 12 μL de tampão EB.
6. Medir a concentração das bibliotecas construídas por espectrofotometria UV-Visível e/ou quantificação fluorométrica.

11. Sequenciamento da biblioteca

1. Envie as bibliotecas construídas para um centro de sequenciamento externo para avaliação de qualidade e sequenciamento Illumina. Para garantir sensibilidade suficiente no mapeamento quantitativo de pequenas paisagens de RNA, opte pelo sequenciamento de extremidade emparelhada com leituras de 75 pb de cada direção (ou seja, PE75), visando pelo menos 1,5 M de leituras de sequência bruta em cada direção para cada amostra. Use primers personalizados (Tabela 1) para sequenciamento NextSeq, mas isso é opcional para sequenciamento em MiSeq.
   NOTA: O sequenciamento pode ser realizado usando as plataformas MiSeq ou NextSeq500. A escolha da plataforma pode depender da natureza das amostras e da contagem total de amostras.

12. Pipeline de análise de dados

NOTA: A Figura 2 fornece uma ilustração gráfica dos procedimentos simplificados envolvidos no pipeline de análise de dados, que recebe leituras de sequência bruta (no formato FASTQ) como entrada e gera uma matriz de abundância com linhas representando membros de pequenas espécies de RNA de interesse e colunas representando amostras. Para sequenciamento de extremidade emparelhada, cada amostra corresponde a dois arquivos FASTQ, um para as leituras diretas e outro para as leituras reversas. O pipeline completo de análise de dados, com todos os scripts associados e um manual com anotações extensas para cada etapa, está disponível no GitHub (https://github.com/Chenrx9293/AQRNA-seq-JoVE.git).

1. Recupere leituras de sequência bruta do centro de sequenciamento externo e avalie a qualidade do sequenciamento usando programas de código aberto, como FastQC¹⁴ ou fastp¹⁵.
2. Crie uma biblioteca de sequências de referência no formato FASTA.
   NOTA: A chave para a adaptabilidade do pipeline a diversas classes pequenas de RNA é uma biblioteca de sequências de referência apropriada. Para obter estimativas precisas de abundância de membros de classes específicas de RNA de interesse (por exemplo, miRNA), espera-se que os usuários façam uma curadoria meticulosa de uma biblioteca de sequências de referência para uso com o pipeline. Todas as outras instruções para execução de pipeline permanecem consistentes em diferentes classes de RNA pequenas.
3. Crie um diretório chamado AQRNA-seq para implementar o pipeline de análise de dados e coloque todos os scripts, leituras de sequência filtradas por qualidade e a biblioteca de sequência de referência nesse diretório. Siga as instruções detalhadas no GitHub (https://github.com/Chenrx9293/AQRNA-seq-JoVE.git) para preparar subdiretórios e fazer modificações essenciais nos arquivos para direcionar diferentes organismos e/ou pequenas espécies de RNA, bem como a compatibilidade do sistema operacional e/ou agendador de tarefas.
4. Implemente o pipeline de análise de dados seguindo as etapas descritas no manual no GitHub (https://github.com/Chenrx9293/AQRNA-seq-JoVE.git), que contém descrições, arquivos de entrada e saída, bem como linhas de comando para cada etapa. Em resumo, o pipeline abrange (i) o corte de sequências de ligantes e nucleotídeos aleatórios das leituras, (ii) a filtragem de leituras com base em seu comprimento, (iii) o mapeamento das leituras para as sequências de referência, (iv) a resolução de mapeamentos ambíguos e (v) a geração da matriz de abundância.

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Resultados

Mycobacterium bovis A cepa BCG (bacilos de Calmette et Guérin) 1173P2 em crescimento exponencial foi submetida a uma série temporal (0, 4, 10 e 20 dias) de falta de nutrientes, seguida por uma ressuscitação de 6 dias em meio rico em nutrientes, conforme apresentado anteriormente em Hu et ^al.7. Pequenos RNAs foram isolados da cultura bacteriana, com três repetições biológicas, em cada um dos cinco pontos de tempo designados. As bibliotecas Illumina foram construídas usando o fluxo...

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Discussão

O fluxo de trabalho de preparação da biblioteca AQRNA-seq foi projetado para maximizar a captura de RNAs em uma amostra e minimizar a queda da polimerase durante a transcrição reversa⁷. Por meio de uma ligação de ligante em duas etapas, novos oligos de DNA (Linker 1 e Linker 2) são ligados em excesso para complementar totalmente o RNA dentro da amostra. O excesso de ligantes pode ser removido de forma eficiente com RecJf, uma exonuclease de 5' a 3' específica para DNAs de fita simples, dei...

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Materiais

Name	Company	Catalog Number	Comments
2-ketoglutarate	Sigma-Aldrich	75890	Prepare a working solution (1 M) and store it at -20ºC
2100 Bioanalyzer Instrument	Agilent	G2938C
Adenosine 5'-Triphosphate (ATP)	New England Biolabs	M0437M (component #: N0437AVIAL)	NEB M0437M contains T4 RNA Ligase 1 (30 U/μL), T4 RNA Ligase Reaction Buffer (10X), PEG 8000 (1X), and ATP (100 mM); prepare a working solution (10 mM) and store it at -20ºC
AGAROSE GPG/LE	AmericanBio	AB00972-00500	Store at ambient temperature
Ammonium iron(II) sulfate hexahydrate	Sigma-Aldrich	F2262	Prepare a working solution (0.25 M) and store it at -20 °C
Bioanalyzer Small RNA Analysis	Agilent	5067-1548	The Small RNA Analysis is used for checking the quality of input RNAs and the efficiency of enzymatic reactions (e.g., Linker 1 ligation)
Bovine Serum Albumin (BSA; 10 mg/mL)	New England Biolabs	B9000	This product was discontinued on 12/15/2022 and is replaced with Recombinant Albumin, Molecular Biology Grade (NEB B9200).
Chloroform	Macron Fine Chemicals	4441-10
Demethylase	ArrayStar	AS-FS-004	Demethylase comes with the rtStar tRNA Pretreatment & First-Strand cDNA Synthesis Kit (AS-FS-004)
Deoxynucleotide (dNTP) Solution Mix	New England Biolabs	N0447L (component #: N0447LVIAL)	This dNTP Solution Mix contains equimolar concentrations of dATP, dCTP, dGTP and dTTP (10 mM each)
Digital Dual Heat Block	VWR Scientific Products	13259-052	Heating block is used with the QIAquick Gel Extraction Kit
DyeEx 2.0 Spin Kit	Qiagen	63204	Effective at removing short remnants (e.g., oligos less than 10 bp in length)
Electrophoresis Power Supply	Bio-Rad Labrotories	PowerPac 300
Eppendorf PCR Tubes (0.5 mL)	Eppendorf	0030124537
Eppendorf Safe-Lock Tubes (0.5 mL)	Eppendorf	022363611
Eppendorf Safe-Lock Tubes (1.5 mL)	Eppendorf	022363204
Eppendorf Safe-Lock Tubes (2 mL)	Eppendorf	022363352
Ethyl alcohol (Ethanol), Pure	Sigma-Aldrich	E7023	The pure ethanol is used with the Oligo Clean and Concentrator Kit from Zymo Research
Gel Imaging System	Alpha Innotech	FluorChem 8900
Gel Loading Dye, Purple (6X), no SDS	New England Biolabs	N0556S (component #: B7025SVIAL)	NEB N0556S contains Quick-Load Purple 50 bp DNA Ladder and Gel Loading Dye, Purple (6X), no SDS
GENESYS 180 UV-Vis Spectrophotometer	Thermo Fisher Scientific	840-309000	The spectrophotometer is used for measuring the oligo concentrations using the Beer's law
HEPES	Sigma-Aldrich	H4034	Prepare a working solution (1 M; pH = 8 with NaOH) and store it at -20 °C
Hydrochloric acid (HCl)	VWR Scientific Products	BDH3028	Prepare a working solution (5 M) and store it at ambient temperature
Isopropyl Alcohol (Isopropanol), Pure	Macron Fine Chemicals	3032-16	Isopropanol is used with the QIAquick Gel Extraction Kit
L-Ascorbic acid	Sigma-Aldrich	A5960	Prepare a working solution (0.5 M) and store it at -20ºC
Microcentrifuge	Eppendorf	5415D
NanoDrop 2000 Spectrophotometer	Thermo Fisher Scientific	ND-2000
NEBuffer 2 (10X)	New England Biolabs	M0264L (component #: B7002SVIAL)	NEB M0264L contains RecJf (30 U/μL) and NEBuffer 2 (10X); store at -20 °C
Nuclease-Free Water (not DEPC-Treated)	Thermo Fisher Scientific	AM9938
Oligo Clean & Concentrator Kit	Zymo Research	D4061	Store at ambient temperature
PEG 8000 (50% solution)	New England Biolabs	M0437M (component #: B1004SVIAL)	NEB M0437M contains T4 RNA Ligase 1 (30 U/μL), T4 RNA Ligase Reaction Buffer (10X), PEG 8000 (1X), and ATP (100 mM); prepare a working solution (10 mM) and store it at -20ºC
Peltier Thermal Cycler	MJ Research	PTC-200
Phenol:choloroform:isoamyl alcohol 25:24:1 pH = 5.2	Thermo Fisher Scientific	J62336
PrimeScript Buffer (5X)	TaKaRa	2680A
PrimeScript Reverse Transcriptase	TaKaRa	2680A
QIAquick Gel Extraction Kit	Qiagen	28704	This kit requires a heating block and isopropanol to work with
Quick-Load Purple 100 bp DNA Ladder	New England Biolabs	N0551S (component #: N0551SVIAL)
Quick-Load Purple 50 bp DNA Ladder	New England Biolabs	N0556S (component #: N0556SVIAL)	NEB N0556S contains Quick-Load Purple 50 bp DNA Ladder and Gel Loading Dye, Purple (6X), no SDS
RecJf (30 U/μL)	New England Biolabs	M0264L (component #: M0264LVIAL)	NEB M0264L contains RecJf (30 U/μL) and NEBuffer 2 (10X); store at -20 °C
RNase Inhibitor (murine; 40 U/μL)	New England Biolabs	M0314L (component #: M0314LVIAL)	Store at -20 °C
SeqAMP DNA Polymerase	TaKaRa	638509	TaKaRa 638509 contains SeqAMP DNA Polymerase and SeqAMP PCR Buffer (2X)
SeqAMP PCR Buffer (2X)	TaKaRa	638509	TaKaRa 638509 contains SeqAMP DNA Polymerase and SeqAMP PCR Buffer (2X)
Shrimp Alkaline Phosphatase (1 U/μL)	New England Biolabs	M0371L (component #: M0371LVIAL)
Sodium hydroxide (NaOH)	Sigma-Aldrich	S5881	Prepare a working solution (5 M) and store it at ambient temperature
T4 DNA Ligase (400 U/μL)	New England Biolabs	M0202L (component #: M0202LVIAL)	NEB M0202L contains T4 DNA Ligase (400 U/μL) and T4 DNA Ligase Reaction Buffer (10X)
T4 DNA Ligase Reaction Buffer (10X)	New England Biolabs	M0202L (component #: B0202SVIAL)	NEB M0202L contains T4 DNA Ligase (400 U/μL) and T4 DNA Ligase Reaction Buffer (10X)
T4 RNA Ligase 1 (30 U/μL)	New England Biolabs	M0437M (component #: M0437MVIAL)	NEB M0437M contains T4 RNA Ligase 1 (30 U/μL), T4 RNA Ligase Reaction Buffer (10X), PEG 8000 (1X), and ATP (100 mM)
T4 RNA Ligase Reaction Buffer (10X)	New England Biolabs	M0437M (component #: B0216SVIAL)	NEB M0437M contains T4 RNA Ligase 1 (30 U/μL), T4 RNA Ligase Reaction Buffer (10X), PEG 8000 (1X), and ATP (100 mM)