AQRNA-seq para cuantificar ARNs pequeños

Resumen

La secuenciación de ARN de cuantificación absoluta (AQRNA-seq) es una tecnología desarrollada para cuantificar el panorama de todos los ARN pequeños en mezclas biológicas. Aquí, se demuestran los pasos de preparación de la biblioteca y procesamiento de datos de AQRNA-seq, cuantificando los cambios en el grupo de ARN de transferencia (ARNt) en Mycobacterium bovis BCG durante la latencia inducida por inanición.

Resumen

AQRNA-seq proporciona una relación lineal directa entre los recuentos de lecturas de secuenciación y el número pequeño de copias de ARN en una muestra biológica, lo que permite una cuantificación precisa del grupo de ARN pequeños. El procedimiento de preparación de la biblioteca AQRNA-seq descrito aquí implica el uso de enlazadores de secuenciación diseñados a medida y un paso para reducir las modificaciones del ARN de metilación que bloquean la procesividad de transcripción inversa, lo que da como resultado un mayor rendimiento de ADNc de longitud completa. Además, se presenta una implementación detallada de la cartera de productos bioinformáticos que la acompaña. Esta demostración de AQRNA-seq se llevó a cabo a través de un análisis cuantitativo de los 45 ARNt en Mycobacterium bovis BCG cosechados en 5 días seleccionados a lo largo de un curso de 20 días de privación de nutrientes y 6 días de reanimación. Los esfuerzos en curso para mejorar la eficiencia y el rigor de AQRNA-seq también se discutirán aquí. Esto incluye explorar métodos para obviar la purificación en gel para mitigar los problemas de dímero de cebador después de la amplificación de PCR y para aumentar la proporción de lecturas completas para permitir un mapeo de lectura más preciso. Las futuras mejoras de AQRNA-seq se centrarán en facilitar la automatización y la implementación de alto rendimiento de esta tecnología para cuantificar todas las especies pequeñas de ARN en muestras de células y tejidos de diversos organismos.

Introducción

La secuenciación de próxima generación (NGS), también conocida como secuenciación paralela masiva, es una tecnología de secuenciación de ADN que implica la fragmentación del ADN, la ligadura de oligonucleótidos adaptadores, la amplificación basada en la reacción en cadena de la polimerasa (PCR), la secuenciación del ADN y el reensamblaje de las secuencias de fragmentos en un genoma. La adaptación de NGS a la secuencia de ARN (RNA-seq) es un enfoque poderoso para identificar y cuantificar las transcripciones de ARN y sus variantes¹. Los desarrollos innovadores en los flujos de trabajo de preparación de bibliotecas de ARN y las tuberías de análisis bioinformático, junto con los avances en la instrumentación de laboratorio, han ampliado el repertorio de aplicaciones de secuenciación de ARN, progresando más allá de la secuenciación del exoma hacia ómicas funcionales avanzadas como el perfil de ARN no codificante², el análisis de células individuales³, la transcriptómica espacial ^4,5, el análisis de empalme alternativo⁶entre otros. Estos métodos avanzados de secuenciación de ARN revelan funciones complejas de ARN a través del análisis cuantitativo del transcriptoma en células y tejidos normales y enfermos.

A pesar de estos avances en la secuenciación de ARN, varias características técnicas clave limitan el poder cuantitativo del método. Si bien la mayoría de los métodos de secuenciación de ARN permiten una cuantificación precisa y precisa de los cambios en los niveles de ARN entre variables experimentales (es decir, muestras biológicas y/o estados fisiológicos), no pueden proporcionar comparaciones cuantitativas de los niveles de moléculas de ARN dentro de una muestra. Por ejemplo, la mayoría de los métodos de secuenciación de ARN no pueden cuantificar con precisión el número relativo de copias de moléculas isoaceptoras de ARNt individuales en un grupo celular de ARNt expresados. Como se destaca en la publicación complementaria⁷, esta limitación a la secuenciación de ARN surge de varias características de la estructura del ARN y la bioquímica de la preparación de la biblioteca. Por ejemplo, la actividad de las enzimas de ligadura utilizadas para unir los enlazadores de secuenciación de los extremos 3' y 5' a las moléculas de ARN está fuertemente influenciada por la identidad de los nucleótidos terminales del ARN y los enlazadores de secuenciación. Esto conduce a grandes variaciones en la eficiencia de las ligaduras de enlazadores y profundos aumentos artifactuales en las lecturas de secuenciación ^8,9,10.

Un segundo conjunto de limitaciones surgen de las propiedades estructurales inherentes de las moléculas de ARN. Específicamente, la formación de la estructura secundaria del ARN y los cambios dinámicos en las docenas de modificaciones postranscripcionales del ARN del epitranscriptoma pueden causar la caída de la polimerasa o la mutación durante la transcripción inversa. Estos errores dan lugar a una síntesis de ADNc incompleta o truncada o a una secuencia de ARN alterada. Si bien ambos fenómenos pueden explotarse para mapear estructuras secundarias o algunas modificaciones, degradan la precisión cuantitativa de la secuenciación de ARN si los pasos posteriores de preparación de la biblioteca no logran capturar ADNc truncados o si el procesamiento de datos arroja secuencias mutadas que no coinciden con un conjunto de datos de referencia^11,12. Además, la inmensa diversidad química, estructural y de longitud de los transcritos de ARN, así como la falta de herramientas para fragmentar uniformemente los ARN largos, disminuye la aplicabilidad de la mayoría de los métodos de secuenciación de ARN a todas las especies de ARN¹³.

El método AQRNA-seq (secuenciación de ARN de cuantificación absoluta) se ha desarrollado para eliminar varias de estas restricciones técnicas y biológicas que limitan la precisión cuantitativa⁷. Al minimizar los sesgos dependientes de la secuencia en la captura, ligadura y amplificación durante la preparación de la biblioteca de secuenciación de ARN, AQRNA-seq logra una linealidad superior en comparación con otros métodos, cuantificando con precisión el 75% de una biblioteca de referencia de 963 miARN con una precisión de 2 veces. Esta correlación lineal entre el recuento de lecturas de secuenciación y la abundancia de ARN también se observa en un análisis de un grupo de longitud variable de estándares de oligonucleótidos de ARN y en referencia a métodos ortogonales como el Northern blot. El establecimiento de la linealidad entre el recuento de lecturas de secuenciación y la abundancia de ARN permite a AQRNA-seq lograr una cuantificación precisa y absoluta de todas las especies de ARN dentro de una muestra.

A continuación, se muestra una descripción del protocolo para el flujo de trabajo de preparación de la biblioteca AQRNA-seq y la canalización de análisis de datos descendente que lo acompaña. El método se aplicó para dilucidar la dinámica de la abundancia de ARNt durante la latencia inducida por inanición y la posterior reanimación en el modelo de tuberculosis Mycobacterium bovis bacilli de Calmette et Guérin (BCG). Se presentaron los resultados para la visualización exploratoria de los datos de secuenciación, junto con los posteriores análisis de agrupamiento y expresión diferencial que revelaron patrones discernibles en la abundancia de ARNt asociados con varios fenotipos.

Protocolo

NOTA: La Figura 1 proporciona una ilustración gráfica de los procedimientos involucrados en la preparación de la biblioteca AQRNA-seq. La información detallada sobre los reactivos, productos químicos y columnas/kits utilizados en el procedimiento se puede encontrar en la Tabla de Materiales. Se recomienda realizar una evaluación exhaustiva de la pureza, integridad y cantidad de las muestras de ARN de entrada utilizando (i) electroforesis en gel de agarosa al 3%, (ii) herramientas de electroforesis automatizadas para el control de la calidad de las muestras de biomoléculas (véase la Tabla de Materiales), y (iii) espectrofotometría UV-Visible y/o cuantificación fluorométrica. Es obligatorio mantener todas las reacciones y mezclas maestras en hielo, a menos que se especifique lo contrario. Transporte reactivos (por ejemplo, enzimas) en neveras portátiles hasta y desde el almacenamiento a -20 °C para preservar su vida útil y evitar múltiples ciclos de congelación y descongelación de productos intermedios de biblioteca.

1. Desfosforilación de ARN

NOTA: La eliminación del 5'-fosfato (P; donante) impide la autoligadura al 3'-hidroxilo (OH; aceptor) de los ARN. Los enlazadores no se autoligarán, ya que su extremo 3' se modifica para incorporar una didesoxicitidina (Linker 1) o un espaciador (Linker 2). Los enlazadores solo se pueden ligar uniendo su 5'-P al 3'-OH de los ARN o ADNc.

1. Preparar la reacción de desfosforilación en un tubo de PCR estéril (por ejemplo, tubo de 200 μL o 500 μL) añadiendo hasta 2 μL de la muestra de ARN, 0,5 μL de 40 U/μL de inhibidor de la ARNasa, 1 μL de patrón interno de 0,5 μM (Tabla 1), 0,5 μL de tampón de reacción de ARN ligasa T4 10x, 1 μL de 1 U/μL de fosfatasa alcalina de camarones, y suficiente agua libre de RNasa para llevar el volumen total a 5 μL.
   NOTA: Para muestras típicas, 75 ng de ARN (o aproximadamente 2 pmol para un ARN de 80 nt) se consideran suficientes para la cuantificación de ARN pequeños utilizando este protocolo.
2. Incubar a 37 °C durante 30 min para desfosforilar los ARN y luego a 65 °C durante 5 min para inactivar la enzima y desnaturalizar los ARN. Mantenga las muestras a 4 °C durante al menos 10 minutos para evitar la renaturalización.

2. Ligadura del enlazador 1 al extremo 3' de los ARN

1. Prepare la reacción de ligadura del Linker 1 en un tubo de PCR estéril añadiendo 5 μL de los ARN desfosforilados (productos del paso 1), 0,5 μL de 40 U/μL de inhibidor de la ARNasa, 1 μL de 100 μM de Linker 1 (Tabla 1), 3 μL de 10 mM de ATP, 2,5 μL de tampón de reacción de ARN ligasa T4 10x, 15 μL de PEG8000 (solución al 50%), 2 μL de 30 U/μL de ARN ligasa T4 1 y 1 μL de agua libre de ARNasa.
   NOTA: Los reactivos se pueden convertir en una mezcla maestra para facilitar el procesamiento de las muestras. No incluya PEG8000 y ARN ligasa 1 T4 en la mezcla maestra.
2. Incubar a 25 °C durante 2 h y luego a 16 °C durante 16 h para ligar el Linker 1 a los ARN.
3. Purificar en columna los ARN ligados a Linker-1. Utilice un kit para la recuperación y limpieza de ADN/ARN (consulte la tabla de materiales).
   NOTA: Este protocolo de purificación de columnas se aplica a todas las purificaciones de columnas posteriores que utilicen el mismo kit. Los kits que utilizan la tecnología de filtración en gel para eliminar los terminadores de tinte de las reacciones de secuenciación (ver Tabla de Materiales) no se pueden utilizar aquí, ya PEG8000 es incompatible con los filtros de gel de dichos kits. Se recomienda guardar una alícuota (1,2 μL) de cada muestra después de la purificación. Cuando sea necesario, estas alícuotas se pueden utilizar para comprobar la eficacia de la ligadura mediante la ejecución de un analizador de ácido nucleico comercial. Mantenga las muestras purificadas restantes en hielo o a -20 °C hasta que se realicen nuevos pasos.
   1. Para un volumen de muestra < 50 μL, añada agua sin RNasa hasta llegar a 50 μL. Añada 2 volúmenes del tampón de unión a oligonucleótidos (incluido en el kit) a 1 volumen de la muestra. Agregue 8 volúmenes de etanol al 100% a 1 volumen de la muestra.
   2. Cargue la muestra (hasta 750 μL a la vez) en una columna colocada dentro de un tubo de recolección de 2 mL (incluido en el kit). Para unir los ARN a la columna, centrifugar a 10.000 x g durante 30 s y desechar el flujo (es decir, el líquido en el tubo de recolección). Vuelva a colocar la columna en el tubo de recolección.
   3. Para lavar las impurezas de la columna, añada 750 μL del tampón de lavado de ADN (incluido en el kit) a la columna. Centrifugar a 10.000 x g durante 30 s y desechar el flujo. Vuelva a colocar la columna en el tubo de recolección.
   4. Centrifugar a velocidad máxima (por ejemplo, 16.000 x g para una microcentrífuga de sobremesa) durante 1 minuto adicional para eliminar el tampón de lavado de ADN residual.
   5. Para eluir los ARN, mueva con cuidado la columna a un tubo estéril de 1,5 mL, agregue agua libre de ARNasa a la columna. Utilice un volumen mayor del necesario al eluir los ARN para tener en cuenta la posible pérdida de volumen durante el proceso de elución. Por ejemplo, si se requieren 15 μL para el siguiente paso, agregue 17 μL de agua libre de RNasa para la elución. Centrífuga a 10.000 x g durante 30 s.

3. Eliminación de metilaciones postranscripcionales por AlkB demetilasa

NOTA: AlkB es una enzima bacteriana que elimina los grupos metilo de algunos, pero no todos, los nucleótidos metilados en el ADN y el ARN. La eliminación de varios tipos de ribonucleótidos metilados en el ARN evita la caída de la transcriptasa inversa para permitir lecturas más completas e identificación de sitios de modificación. Este paso debe controlarse a un pH bajo para evitar la degradación inesperada de los ARN.

1. Prepare una solución madre de 1 M 2-cetoglutarato disolviendo 1,4611 g de 2-cetoglutarato (146,11 g por M) en 10 mL de agua libre de RNasa. Filtro: esterilice la solución a través de un filtro de jeringa de 0,2 μm. Aliquotar la solución madre en tubos estériles de 2 ml y almacenar a -20 °C.
2. Prepare una solución madre de 0,5 M de ácido L-ascórbico disolviendo 0,88 g de ácido L-ascórbico (176,12 g por M) en 10 ml de agua libre de RNasa. Filtro: esterilice la solución a través de un filtro de jeringa de 0,2 μm. Aliquotar la solución madre en tubos estériles de 2 ml y almacenar a -20 °C.
3. Preparar una solución madre de 0,25 M de sulfato ferroso amónico hexahidratado disolviendo 0,9835 g de sulfato ferroso amónico hexahidratado (392,14 g por M) en 10 mL de agua libre de RNasa. Filtro: esterilice la solución a través de un filtro de jeringa de 0,2 μm. Aliquotar la solución madre en tubos estériles de 2 ml y almacenar a -20 °C.
4. Prepare una solución madre de 1 M de HEPES disolviendo 2,383 g de HEPES (238,30 g por M) en 10 mL de agua libre de RNasa. Ajuste el pH de la solución a 8 usando NaOH y esterilice la solución a través de un filtro de jeringa de 0,2 μm. Aliquotar la solución madre en tubos estériles de 2 ml y almacenar a -20 °C.
5. Prepare un tampón de reacción AlkB 2x. Para producir 10 mL del tampón, combine 1,5 μL de 1 M de 2-cetoglutarato (elaborado en el paso 3.1), 80 μL de ácido L-ascórbico 0,5 M (elaborado en el paso 3.2), 6 μL de 0,25 M de sulfato ferroso de amonio hexahidratado (elaborado en el paso 3.3), 100 μL de 10 mg/mL de BSA, 1000 μL de 1 M HEPES (fabricado en el paso 3.4; añadir el último), y 8812,5 μL de agua libre de RNasa. Filtro: esterilice el tampón a través de un filtro de jeringa de 0,2 μm.
   NOTA: El tampón de reacción 2x AlkB debe prepararse fresco inmediatamente antes de cada experimento debido a la labilidad química de los componentes.
6. Prepare la reacción de digestión de AlkB en un tubo de PCR estéril añadiendo 20 μL de los ARN ligados a Linker-1 (productos del paso 2), 50 μL del tampón de reacción 2x AlkB (fabricado en el paso 3.5), 2 μL de AlkB desmetilasa, 1 μL de inhibidor de RNasa y 27 μL de agua libre de RNasa.
7. Incubar a temperatura ambiente durante 2 h para eliminar las metilaciones postranscripcionales de los ARN.
8. Para eliminar AlkB de la reacción, siga los pasos que se describen a continuación.
   1. Para una separación de fases limpia, agregue 50 μL de agua libre de RNasa en la reacción AlkB y luego agregue 100 μL de fenol: cloroformo: alcohol isoamílico 25:24:1 (pH = 5,2).
   2. Agitar con la mano durante 10 s y, a continuación, centrifugar a 16.000 x g durante 10 min. Asegúrese de que el rotor de la centrífuga de sobremesa sea compatible con los tubos de PCR. Utilice adaptadores si es necesario.
   3. Transfiera los ARN (es decir, la capa acuosa en la parte superior; aproximadamente 140 μL) a un tubo estéril de 1,5 mL. Si el cloroformo (es decir, la capa inferior) se mezcla con la capa acuosa, centrifugar nuevamente con los mismos ajustes.
   4. Agregue 100 μL de cloroformo a los ARN extraídos para eliminar el fenol residual. Agitar con la mano durante 10 s y, a continuación, centrifugar a 16.000 x g durante 10 min.
   5. Transfiera los ARN (es decir, la capa acuosa en la parte superior; aproximadamente 120 μL) a un tubo estéril de 1,5 mL.
9. Purificar en columna los ARN extraídos. Utilice un kit para la recuperación y limpieza de ADN/ARN (consulte la tabla de materiales). Siga el protocolo detallado en el paso 2.3 para realizar la purificación de la columna.

4. Eliminación del exceso de Linker 1

NOTA: Se recomienda guardar una alícuota (1,2 μL) de cada muestra después de la purificación. Cuando sea necesario, estas alícuotas se pueden utilizar para comprobar la eficiencia de la digestión de RecJf mediante el funcionamiento de un analizador de ácidos nucleicos comercial. Proceda con las muestras purificadas inmediatamente para revertir la transcripción.

1. Prepare la reacción de indeadenilación en un tubo de PCR estéril añadiendo 15 μL de ARN ligados a Linker-1 (productos del paso 3), 1 μL de inhibidor de ARNasa de 40 U/μL, 2 μL de tampón 2 del kit 10x (consulte la Tabla de materiales) y 2 μL de 50 U/μL de 5'-deadenilasa.
2. Incubar a 30 °C durante 1 h para eliminar la adenina en el extremo 5' del Linker 1. Añadir 2 μL de 30 U/μL de RecJf en la reacción de deadenilación.
3. Incubar a 37 °C durante 30 min para digerir el exceso de Linker 1. Agregue otros 2 μL de 30 U/μL de RecJf a la reacción.
4. Incubar a 37 °C durante 30 min para continuar la digestión del exceso de Linker 1 y luego a 65 °C durante 20 min para desnaturalizar la enzima.
5. Purificar en columna los ARN ligados a Linker-1. Utilice un kit que utilice tecnología de filtración en gel para eliminar los terminadores de colorante de las reacciones de secuenciación (consulte la Tabla de materiales), ya que es eficaz para eliminar restos cortos (por ejemplo, oligonucleótidos con una longitud de 2 a 10 pb). Siga los pasos que se describen a continuación para la purificación.
   1. Prepare las columnas de filtro de gel de acuerdo con el protocolo del fabricante. Coloque una columna en un tubo estéril de 1,5 ml y cargue la columna con 24 μl de la muestra.
   2. Para purificar los ARN, centrifugar a 800 x g durante 3 min y desechar la columna. Los ARN purificados se encuentran en el eluyente.

5. Reacción de transcripción inversa (RT)

NOTA: La siguiente configuración de reacción RT (ver Tabla de Materiales) sigue el protocolo del fabricante, con pequeñas modificaciones para permitir la compatibilidad con AQRNA-seq.

1. Prepare la reacción de recocido del cebador RT en un tubo de PCR estéril añadiendo 24 μL de ARN molde (productos del paso 4), 1 μL de cebador RT de 2 μM (Tabla 1) y 1 μL de dNTP (10 mM de cada tipo de nucleótidos).
2. Incubar a 80 °C durante 2 min para recocer los cebadores RT a los ARN molde y, a continuación, enfriar en hielo inmediatamente durante 2 min.
3. Prepare la reacción RT añadiendo 6 μL de tampón de reacción RT 5x, 1 μL de inhibidor de RNasa 40 U/μL y 1 μL de transcriptasa inversa en el tubo de reacción de recocido.
4. Incubar a 50 °C durante 2 h para realizar la transcripción inversa de las plantillas de ARN, y luego a 70 °C durante 15 min para inactivar la enzima. Los productos RT (es decir, híbridos de ARN y ADNc) pueden almacenarse a 4 °C o -20 °C durante la noche.

6. Hidrólisis del ARN

1. Añadir 1 μL de NaOH 5 M en el híbrido ARN-ADNc (productos del paso 5). Incubar a 93 °C durante 3 min para hidrolizar la cadena de ARN del híbrido ARN-ADNc.
2. Añadir 0,77 μL de HCl 5 M para neutralizar la reacción. Después de agregar HCl, mueva para mezclar y gire por el tubo. La neutralización es instantánea.
   NOTA: Se recomienda probar la cantidad precisa de 5 M de HCl que se necesita para neutralizar 1 μL de NaOH (por ejemplo, usando tiras de pH) en condiciones tamponadas.
3. Purificar en columna los ADNc monocatenarios. Utilice un kit para la recuperación y limpieza de ADN/ARN (consulte la tabla de materiales). Siga el protocolo detallado en el paso 2.3 para realizar la purificación de la columna.
   NOTA: Los kits que utilizan tecnología de filtración en gel para eliminar los terminadores de tinte de las reacciones de secuenciación (consulte la Tabla de materiales) no se pueden usar aquí debido a la variación del pH en los pasos anteriores.
4. Vacíe rápidamente los ADNc purificados a < 5 μL y luego agregue agua libre de RNasa para que el volumen vuelva a 5 μL. Tenga cuidado de no vaciar rápidamente los ADNc hasta que se sequen por completo.
5. Transfiera los ADNc purificados a un tubo de PCR estéril. Los ADNc purificados pueden almacenarse a -20 °C durante un máximo de 1 semana.

7. Ligadura del enlazador 2 hasta el extremo 3' de los ADNc

1. Prepare la reacción de ligadura de Linker 2 en un tubo de PCR estéril agregando 5 μL de ADNc (productos del paso 6), 1 μL de 50 μM de Linker 2 (Tabla 1), 2 μL de tampón de reacción de ADN ligasa T4 10x, 1 μL de ATP 10 m, 9 μL de PEG8000 (solución al 50%) y 2 μL de 400 U/μL de ADN ligasa T4.
   NOTA: Los reactivos se pueden convertir en una mezcla maestra para facilitar el procesamiento de las muestras. No incluya PEG8000 y T4 ADN ligasa en la mezcla maestra.
2. Incubar a 16 °C durante 16 h para ligar Linker 2 a los ADNc.
3. Purificar en columna los ADNc ligados a Linker-2. Utilice un kit para la recuperación y limpieza de ADN/ARN (consulte la tabla de materiales). Siga el protocolo detallado en el paso 2.3 para realizar la purificación de la columna.

8. Eliminación del exceso de Linker 2

1. Prepare la reacción de indeadenilación en un tubo de PCR estéril añadiendo 16 μL de ADNc ligados a Linker-2, 2 μL de tampón 2 del kit 10x y 2 μL de 50 U/μL de 5'-deadenilasa. Incubar a 30 °C durante 1 h para eliminar la adenina en el extremo 5' del Linker 2.
2. Añadir 2 μL de 30 U/μL de RecJf en la reacción de deadenilación. Incubar a 37 °C durante 30 min para digerir el exceso de Linker 2. Agregue otros 2 μL de 30 U/μL de RecJf a la reacción.
3. Incubar a 37 °C durante 30 min para continuar la digestión del exceso de Linker 2 y luego a 65 °C durante 20 min para desnaturalizar la enzima.

9. Amplificación por PCR de los ADNc con cebadores de secuenciación

1. Asigne cebadores de PCR a las muestras. Cada muestra necesita una combinación única de cebadores directos e inversos (Tabla 1) para una multiplexación eficaz.
2. Agregue agua sin RNasa para llevar el volumen de la muestra a 25 μL. Guarde 5 μL de cada muestra en un tubo de PCR estéril como respaldo en caso de que sea necesario repetir la PCR.
3. Prepare la reacción de PCR (consulte la Tabla de materiales para el kit de PCR) agregando 20 μL de ADNc (productos del paso 8), 1 μL de cebador directo de 2,5 μM, 1 μL de cebador inverso de 2,5 μM, 25 μL de tampón de ADN polimerasa 2x, 2 μL de agua libre de ARNasa y 1 μL de ADN polimerasa.
   NOTA: Los reactivos se pueden convertir en una mezcla maestra para facilitar el procesamiento de las muestras. No agregue ADN polimerasa a la mezcla maestra.
4. Realice la PCR con una desnaturalización inicial a 94 °C durante 1 min, seguida de 18 ciclos de desnaturalización a 98 °C durante 20 s - recocido a 58 °C durante 20 s - extensión a 68 °C durante 1 min.
   NOTA: No amplifique por PCR más allá del rango lineal. Un total de 18 ciclos será óptimo para la mayoría de los experimentos, pero esto puede depender del contexto.
5. Vacíe los productos de PCR a menos de 25 μL y, a continuación, añada agua sin RNasa para que el volumen vuelva a ser de 25 μL. Transfiera 5 μL de los productos de PCR a un tubo estéril de 0,5 mL para comprobar la distribución del tamaño (consulte el paso 9.6). Almacene los 20 μL restantes de los productos PCR a -20 °C hasta que se realicen los siguientes pasos.
6. Compruebe la distribución del tamaño de los productos PCR como se describe a continuación.
   1. Prepare gel de agarosa al 3% en tampón TAE.
      NOTA: En este protocolo, el bromuro de etidio (EtBr) se utiliza para la tinción en gel posterior a la electroforesis (consulte el paso 9.6.5). Las tinciones de ADN apropiadas se pueden agregar a la solución de gel en este paso o se pueden usar para la tinción en gel más adelante.
   2. Mezcle 1 μL de colorante de carga 6x en 5 μL de productos PCR (del paso 9.5) y cargue el gel con la mezcla.
   3. Cargue 5 μL de escaleras de ADN en el pocillo antes de la primera muestra y en el pocillo después de la última muestra. Utilice escaleras de ADN de 50 pb o 100 pb para permitir una mejor discriminación del tamaño de los productos de PCR entre 150 pb y 300 pb.
   4. Ejecute una electroforesis en gel para localizar los productos de PCR. La condición de ejecución adecuada puede depender del contexto. En este caso, funciona a 120 V, 400 mA durante 75 minutos para una losa de gel de 17,78 cm (ancho) x 10,16 cm (alto) x 1 cm (grosor).
   5. Coloque el gel en una caja y llénela con agua desionizada (DI) hasta que el gel esté completamente sumergido. Agregue 10 μL de EtBr en el agua desionizada empapando el gel. Envuelve la caja con papel de aluminio y colócala en una coctelera. Tiñe el gel durante 30 minutos mientras agitas.
   6. Deseche los residuos que contengan EtBr en una botella de residuos colocada en una campana extractora. Enjuague el gel con agua desionizada una vez y deseche el agua que contiene EtBr en la botella de desecho.
   7. Llene la caja con agua desionizada hasta que el gel esté completamente sumergido. Envuelve la caja con papel de aluminio y colócala en una coctelera. Lavar el gel durante 10 min mientras se agita.
   8. Deseche el agua que contiene EtBr en la botella de residuos en la campana extractora. Utilice un generador de imágenes en gel para visualizar las bandas. Adquiere una imagen de alta resolución del gel.

10. Purificación en gel

1. Prepare gel de agarosa al 3% en tampón TAE. Haga un gel de 1 cm de espesor con peines anchos (1 mm de grosor; 5 mm de ancho; 15 mm de profundidad), de modo que cada pocillo pueda contener al menos 25 μL de mezcla de colorante de carga de muestra.
2. Mezcle 4 μL de colorante de carga 6x con 20 μL de productos PCR (del paso 9.5) y cargue el gel con la mezcla. Deje carriles vacíos entre las muestras para minimizar la contaminación cruzada durante la escisión en gel.
3. Cargue escaleras de ADN, ejecute electroforesis en gel, tiña y lave el gel, y tome imágenes de gel como se describe en el paso 9.6.
4. Elimine los bloques de gel que contienen productos de PCR dentro del rango de tamaño objetivo. Para minimizar la contaminación con dímeros de cebadores (enlazadores de 175 pb sin insertos), extraiga productos de PCR con un tamaño superior a 195 pb (enlazadores de 175 pb + miRNAs de 20 pb).
5. Purifique los productos de PCR mediante extracción en gel. Utilice un kit de extracción en gel (consulte la tabla de materiales). El protocolo de purificación se basa en el protocolo del fabricante, con pequeñas modificaciones para la compatibilidad con AQRNA-seq. Todos los pasos de centrifugación deben realizarse a 17.900 x g durante 1 min utilizando una centrífuga de sobremesa a temperatura ambiente, a menos que se especifique lo contrario. Siga los pasos que se describen a continuación.
   1. Mida el peso de los bloques de gel dentro de los tubos. Agregue 6 volúmenes de tampón QG (incluido en el kit) a 1 volumen de bloque de gel (1 mg de gel es aproximadamente 1 μL).
   2. Incubar a 50 °C durante 10 min o hasta la disolución completa de los bloques de gel. Tubos de vórtice cada 2 min para facilitar la disolución del gel. Después de disolver el gel, la mezcla debe parecerse al color del Buffer QG sin el gel disuelto. Si el color es naranja o violeta, agregue 10 μL de acetato de sodio 3 M (pH = 5.0) y mezcle bien.
   3. Agregue 1 volumen de gel de isopropanol a la mezcla y mezcle bien. Coloque una columna de centrifugado en un tubo de recolección de 2 ml (incluido en el kit).
   4. Para unir el ADN, aplique la muestra (hasta 750 μL cada vez) a la columna y centrifuga. Deseche el flujo y vuelva a colocar la columna en el mismo tubo de recolección. La cantidad máxima de gel por columna de centrifugado es de 400 mg.
   5. Añada 500 μL de tampón QG a la columna y centrifuga. Deseche el flujo y vuelva a colocar la columna en el mismo tubo de recolección.
   6. Para lavar las impurezas, agregue 750 μL de tampón PE (incluido en el kit) a la columna, deje reposar la columna durante 5 minutos y centrifuga. Deseche el flujo y vuelva a colocar la columna en el mismo tubo de recolección. Centrifugar una vez más para eliminar el tampón de lavado residual.
   7. Coloque la columna en un tubo estéril de 1,5 ml. Para eluir el ADN, agregue 30 μL de tampón EB (incluido en el kit) al centro de la membrana de la columna, deje reposar la columna durante 4 minutos y centrifuga.
   8. Acelere y vuelva a suspender los productos de PCR purificados en gel en 12 μL de Buffer EB.
6. Mida la concentración de las bibliotecas construidas mediante espectrofotometría UV-Visible y/o cuantificación fluorométrica.

11. Secuenciación de bibliotecas

1. Envíe las bibliotecas construidas a un centro de secuenciación externo para la evaluación de la calidad y la secuenciación de Illumina. Para garantizar una sensibilidad suficiente en el mapeo cuantitativo de pequeños paisajes de ARN, opte por la secuenciación de extremos emparejados con lecturas de 75 pb desde cada dirección (es decir, PE75), con el objetivo de obtener al menos 1,5 M de lecturas de secuencia bruta en cada dirección para cada muestra. Utilice cebadores personalizados (Tabla 1) para la secuenciación de NextSeq, pero esto es opcional para la secuenciación en MiSeq.
   NOTA: La secuenciación se puede realizar utilizando las plataformas MiSeq o NextSeq500. La elección de la plataforma puede depender de la naturaleza de las muestras y del recuento total de muestras.

12. Canalización de análisis de datos

NOTA: La Figura 2 proporciona una ilustración gráfica de los procedimientos simplificados involucrados en la canalización de análisis de datos, que toma lecturas de secuencia sin procesar (en formato FASTQ) como entrada y genera una matriz de abundancia con filas que representan miembros de pequeñas especies de ARN de interés y columnas que representan muestras. Para la secuenciación de extremos emparejados, cada muestra corresponde a dos archivos FASTQ, uno para las lecturas directas y otro para las lecturas inversas. El pipeline completo de analítica de datos, con todos los scripts asociados y un manual con extensas anotaciones para cada paso, está disponible en GitHub (https://github.com/Chenrx9293/AQRNA-seq-JoVE.git).

1. Recupere lecturas de secuencias sin procesar del centro de secuenciación externo y evalúe la calidad de la secuenciación mediante programas de código abierto como FastQC¹⁴ o fastp¹⁵.
2. Cree una biblioteca de secuencias de referencia en formato FASTA.
   NOTA: La clave para la adaptabilidad de la tubería a diversas clases pequeñas de ARN es una biblioteca de secuencias de referencia adecuada. Para lograr estimaciones precisas de la abundancia de miembros de clases específicas de ARN de interés (por ejemplo, miARN), se prevé que los usuarios seleccionen meticulosamente una biblioteca de secuencias de referencia para su uso con la tubería. Todas las demás instrucciones para la ejecución de la tubería permanecen consistentes en diferentes clases de ARN pequeñas.
3. Cree un directorio denominado AQRNA-seq para implementar la canalización de análisis de datos y coloque todos los scripts, las lecturas de secuencias filtradas por calidad y la biblioteca de secuencias de referencia en este directorio. Siga las instrucciones detalladas en GitHub (https://github.com/Chenrx9293/AQRNA-seq-JoVE.git) para preparar subdirectorios y realizar modificaciones esenciales en los archivos para dirigirse a diferentes organismos y/o pequeñas especies de ARN, así como la compatibilidad del sistema operativo y/o el programador de trabajos.
4. Implemente la canalización de análisis de datos siguiendo los pasos descritos en el manual en GitHub (https://github.com/Chenrx9293/AQRNA-seq-JoVE.git), que contiene descripciones, archivos de entrada y salida, así como líneas de comandos para cada paso. En resumen, la canalización abarca (i) el recorte de las secuencias enlazadoras y los nucleótidos aleatorios de las lecturas, (ii) el filtrado de las lecturas en función de su longitud, (iii) el mapeo de las lecturas a las secuencias de referencia, (iv) la resolución de asignaciones ambiguas y (v) la generación de la matriz de abundancia.

Resultados

Mycobacterium bovis La cepa BCG (bacilos de Calmette et Guérin) 1173P2 en crecimiento exponencial se sometió a una serie temporal (0, 4, 10 y 20 días) de inanición de nutrientes, seguida de una reanimación de 6 días en un medio rico en nutrientes, como se presentó previamente en Hu et ^al.7. Se aislaron pequeños ARN de cultivo bacteriano, con tres réplicas biológicas, en cada uno de los cinco puntos de tiempo designados. Las bibliotecas de Illumina se construyeron utilizando el f...

Discusión

El flujo de trabajo de preparación de la biblioteca AQRNA-seq está diseñado para maximizar la captura de ARN dentro de una muestra y minimizar la caída de la polimerasa durante la transcripción inversa⁷. A través de una ligadura de enlazador de dos pasos, los nuevos oligonucleótidos de ADN (Linker 1 y Linker 2) se ligan en exceso para complementar completamente el ARN dentro de la muestra. El exceso de enlazadores se puede eliminar de manera eficiente con RecJf, una exonucleasa de 5' a 3' e...

Materiales

Name	Company	Catalog Number	Comments
2-ketoglutarate	Sigma-Aldrich	75890	Prepare a working solution (1 M) and store it at -20ºC
2100 Bioanalyzer Instrument	Agilent	G2938C
5'-deadenylase (50 U/μL)	New England Biolabs	M0331S (component #: M0331SVIAL)	Store at -20 °C
Adenosine 5'-Triphosphate (ATP)	New England Biolabs	M0437M (component #: N0437AVIAL)	NEB M0437M contains T4 RNA Ligase 1 (30 U/μL), T4 RNA Ligase Reaction Buffer (10X), PEG 8000 (1X), and ATP (100 mM); prepare a working solution (10 mM) and store it at -20ºC
AGAROSE GPG/LE	AmericanBio	AB00972-00500	Store at ambient temperature
Ammonium iron(II) sulfate hexahydrate	Sigma-Aldrich	F2262	Prepare a working solution (0.25 M) and store it at -20 °C
Bioanalyzer Small RNA Analysis	Agilent	5067-1548	The Small RNA Analysis is used for checking the quality of input RNAs and the efficiency of enzymatic reactions (e.g., Linker 1 ligation)
Bovine Serum Albumin (BSA; 10 mg/mL)	New England Biolabs	B9000	This product was discontinued on 12/15/2022 and is replaced with Recombinant Albumin, Molecular Biology Grade (NEB B9200).
Chloroform	Macron Fine Chemicals	4441-10
Demethylase	ArrayStar	AS-FS-004	Demethylase comes with the rtStar tRNA Pretreatment & First-Strand cDNA Synthesis Kit (AS-FS-004)
Deoxynucleotide (dNTP) Solution Mix	New England Biolabs	N0447L (component #: N0447LVIAL)	This dNTP Solution Mix contains equimolar concentrations of dATP, dCTP, dGTP and dTTP (10 mM each)
Digital Dual Heat Block	VWR Scientific Products	13259-052	Heating block is used with the QIAquick Gel Extraction Kit
DyeEx 2.0 Spin Kit	Qiagen	63204	Effective at removing short remnants (e.g., oligos less than 10 bp in length)
Electrophoresis Power Supply	Bio-Rad Labrotories	PowerPac 300
Eppendorf PCR Tubes (0.5 mL)	Eppendorf	0030124537
Eppendorf Safe-Lock Tubes (0.5 mL)	Eppendorf	022363611
Eppendorf Safe-Lock Tubes (1.5 mL)	Eppendorf	022363204
Eppendorf Safe-Lock Tubes (2 mL)	Eppendorf	022363352
Ethyl alcohol (Ethanol), Pure	Sigma-Aldrich	E7023	The pure ethanol is used with the Oligo Clean and Concentrator Kit from Zymo Research
Gel Imaging System	Alpha Innotech	FluorChem 8900
Gel Loading Dye, Purple (6X), no SDS	New England Biolabs	N0556S (component #: B7025SVIAL)	NEB N0556S contains Quick-Load Purple 50 bp DNA Ladder and Gel Loading Dye, Purple (6X), no SDS
GENESYS 180 UV-Vis Spectrophotometer	Thermo Fisher Scientific	840-309000	The spectrophotometer is used for measuring the oligo concentrations using the Beer's law
HEPES	Sigma-Aldrich	H4034	Prepare a working solution (1 M; pH = 8 with NaOH) and store it at -20 °C
Hydrochloric acid (HCl)	VWR Scientific Products	BDH3028	Prepare a working solution (5 M) and store it at ambient temperature
Isopropyl Alcohol (Isopropanol), Pure	Macron Fine Chemicals	3032-16	Isopropanol is used with the QIAquick Gel Extraction Kit
L-Ascorbic acid	Sigma-Aldrich	A5960	Prepare a working solution (0.5 M) and store it at -20ºC
Microcentrifuge	Eppendorf	5415D
NanoDrop 2000 Spectrophotometer	Thermo Fisher Scientific	ND-2000
NEBuffer 2 (10X)	New England Biolabs	M0264L (component #: B7002SVIAL)	NEB M0264L contains RecJf (30 U/μL) and NEBuffer 2 (10X); store at -20 °C
Nuclease-Free Water (not DEPC-Treated)	Thermo Fisher Scientific	AM9938
Oligo Clean & Concentrator Kit	Zymo Research	D4061	Store at ambient temperature
PEG 8000 (50% solution)	New England Biolabs	M0437M (component #: B1004SVIAL)	NEB M0437M contains T4 RNA Ligase 1 (30 U/μL), T4 RNA Ligase Reaction Buffer (10X), PEG 8000 (1X), and ATP (100 mM); prepare a working solution (10 mM) and store it at -20ºC
Peltier Thermal Cycler	MJ Research	PTC-200
Phenol:choloroform:isoamyl alcohol 25:24:1 pH = 5.2	Thermo Fisher Scientific	J62336
PrimeScript Buffer (5X)	TaKaRa	2680A
PrimeScript Reverse Transcriptase	TaKaRa	2680A
QIAquick Gel Extraction Kit	Qiagen	28704	This kit requires a heating block and isopropanol to work with
Quick-Load Purple 100 bp DNA Ladder	New England Biolabs	N0551S (component #: N0551SVIAL)
Quick-Load Purple 50 bp DNA Ladder	New England Biolabs	N0556S (component #: N0556SVIAL)	NEB N0556S contains Quick-Load Purple 50 bp DNA Ladder and Gel Loading Dye, Purple (6X), no SDS
RecJf (30 U/μL)	New England Biolabs	M0264L (component #: M0264LVIAL)	NEB M0264L contains RecJf (30 U/μL) and NEBuffer 2 (10X); store at -20 °C
RNase Inhibitor (murine; 40 U/μL)	New England Biolabs	M0314L (component #: M0314LVIAL)	Store at -20 °C
SeqAMP DNA Polymerase	TaKaRa	638509	TaKaRa 638509 contains SeqAMP DNA Polymerase and SeqAMP PCR Buffer (2X)
SeqAMP PCR Buffer (2X)	TaKaRa	638509	TaKaRa 638509 contains SeqAMP DNA Polymerase and SeqAMP PCR Buffer (2X)
Shrimp Alkaline Phosphatase (1 U/μL)	New England Biolabs	M0371L (component #: M0371LVIAL)
Sodium hydroxide (NaOH)	Sigma-Aldrich	S5881	Prepare a working solution (5 M) and store it at ambient temperature
T4 DNA Ligase (400 U/μL)	New England Biolabs	M0202L (component #: M0202LVIAL)	NEB M0202L contains T4 DNA Ligase (400 U/μL) and T4 DNA Ligase Reaction Buffer (10X)
T4 DNA Ligase Reaction Buffer (10X)	New England Biolabs	M0202L (component #: B0202SVIAL)	NEB M0202L contains T4 DNA Ligase (400 U/μL) and T4 DNA Ligase Reaction Buffer (10X)
T4 RNA Ligase 1 (30 U/μL)	New England Biolabs	M0437M (component #: M0437MVIAL)	NEB M0437M contains T4 RNA Ligase 1 (30 U/μL), T4 RNA Ligase Reaction Buffer (10X), PEG 8000 (1X), and ATP (100 mM)
T4 RNA Ligase Reaction Buffer (10X)	New England Biolabs	M0437M (component #: B0216SVIAL)	NEB M0437M contains T4 RNA Ligase 1 (30 U/μL), T4 RNA Ligase Reaction Buffer (10X), PEG 8000 (1X), and ATP (100 mM)