small RNA 정량을 위한 AQRNA-seq

요약

절대 정량 RNA 염기서열분석(AQRNA-seq)은 생물학적 혼합물에서 모든 소형 RNA의 환경을 정량화하기 위해 개발된 기술입니다. 여기에서는 AQRNA-seq의 라이브러리 준비 및 데이터 처리 단계를 모두 시연하여 기아 유발 휴면 기간 동안 Mycobacterium bovis BCG의 전달 RNA(tRNA) 풀의 변화를 정량화합니다.

초록

AQRNA-seq는 생물학적 샘플에서 염기서열분석 판독 횟수와 small RNA copy numbers 사이에 직접적인 선형 관계를 제공하여 small RNA pool의 정확한 정량화를 가능하게 합니다. 여기에 설명된 AQRNA-seq 라이브러리 준비 절차에는 맞춤형으로 설계된 염기서열분석 링커의 사용과 역전사 진행성을 차단하는 메틸화 RNA 변형을 줄이는 단계가 포함되며, 이로 인해 전장 cDNA의 수율이 증가합니다. 또한 수반되는 생물정보학 파이프라인의 자세한 구현이 제시됩니다. 이 AQRNA-seq 시연은 20일간의 영양 결핍 과정과 6일의 소생술에 걸쳐 선택된 5일에 걸쳐 수확된 Mycobacterium bovis BCG의 45개 tRNA에 대한 정량 분석을 통해 수행되었습니다. AQRNA-seq의 효율성과 엄격성을 개선하기 위한 지속적인 노력도 여기에서 논의될 것입니다. 여기에는 PCR 증폭 후 primer dimer 문제를 완화하기 위해 gel purification을 없애고 보다 정확한 read mapping을 가능하게 하기 위해 full-length read의 비율을 늘리는 방법을 탐색하는 것이 포함됩니다. AQRNA-seq에 대한 향후 개선 사항은 다양한 유기체의 세포 및 조직 샘플에서 모든 small RNA 종을 정량화하기 위한 이 기술의 자동화 및 고처리량 구현을 촉진하는 데 중점을 둘 것입니다.

서문

대규모 병렬 염기서열분석(MMS)이라고도 하는 차세대 염기서열분석(NGS)은 DNA 단편화, 어댑터 올리고뉴클레오티드의 ligation, 중합효소연쇄반응(PCR) 기반 증폭, DNA 염기서열분석, 단편 염기서열을 게놈으로 재조립하는 DNA 염기서열 분석 기술입니다. RNA 염기서열(RNA-seq)에 대한 NGS의 적응은 RNA 전사체와 그 변이체를 식별하고 정량화하는 강력한 접근법입니다¹. RNA 라이브러리 준비 워크플로우 및 생물정보학 분석 파이프라인의 혁신적인 개발과 실험실 기기의 발전은 RNA-seq 애플리케이션의 레퍼토리를 확장하여 엑솜 시퀀싱을 넘어 non-coding RNA 프로파일링², 단일 세포 분석³, 공간 전사체학 ^4,5, 대체 스플라이싱 분석⁶과 같은 고급 기능 오믹스로 발전했습니다, 다른 사람들 사이에서. 이러한 첨단 RNA-seq 방법은 정상 및 병든 세포 및 조직에서 전사체의 정량 분석을 통해 복잡한 RNA 기능을 밝힙니다.

RNA-seq의 이러....

프로토콜

참고: 그림 1 은 AQRNA-seq 라이브러리 준비와 관련된 절차를 그래픽으로 보여줍니다. 절차에 사용된 시약, 화학 물질 및 컬럼/키트에 대한 자세한 정보는 재료 표에서 확인할 수 있습니다. (i) 3% 아가로스 겔 전기영동, (ii) 생체 분자의 시료 품질 관리를 위한 자동 전기영동 도구( 재료 표 참조), (iii) UV-Visible 분광광도법 및/또는 형광 정량화를 사용하여 입력 RNA 시료의 순도, 무결성 및 수량을 종합적으로 평가하는 것이 좋습니다. 달리 명시되지 않는 한 모든 반응과 마스터 믹스를 얼음 위에 보관해야 합니다. 시약(예: 효소)을 -20°C 보관 및 저온 보관 상자로 운송하여 유통 기한을 보존하고 라이브러리 중간체의 여러 동결-해동 주기를 방지합니다.

1. RNA의 탈인산화(Dephosphorylation)

참고: 5'-인산(P; donor)을 제거하면 RNA의 3'-hydroxyl(OH; 수용체)에 대한 자가 결찰(self-ligation)을 방지할 수 있습니다. 링커는 3' 말단이 디데옥시시티딘(Linker 1) 또는 스....

토론

AQRNA-seq 라이브러리 준비 워크플로우는 시료 내 RNA의 캡처를 극대화하고 역전사 중 중합효소 감소를 최소화하도록 설계되었습니다⁷. 2단계 링커 결찰을 통해 새로운 DNA 올리고(링커 1 및 링커 2)가 과도하게 결찰되어 시료 내 RNA를 완전히 보완합니다. 과잉 링커는 단일 가닥 DNA에 특이적인 5' 내지 3' 엑소뉴클레아제인 RecJf를 사용하여 효율적으로 제거할 수 있으며, 접합된 산물은 ?.......

자료

Name	Company	Catalog Number	Comments
2-ketoglutarate	Sigma-Aldrich	75890	Prepare a working solution (1 M) and store it at -20ºC
2100 Bioanalyzer Instrument	Agilent	G2938C
5'-deadenylase (50 U/μL)	New England Biolabs	M0331S (component #: M0331SVIAL)	Store at -20 °C
Adenosine 5'-Triphosphate (ATP)	New England Biolabs	M0437M (component #: N0437AVIAL)	NEB M0437M contains T4 RNA Ligase 1 (30 U/μL), T4 RNA Ligase Reaction Buffer (10X), PEG 8000 (1X), and ATP (100 mM); prepare a working solution (10 mM) and store it at -20ºC
AGAROSE GPG/LE	AmericanBio	AB00972-00500	Store at ambient temperature
Ammonium iron(II) sulfate hexahydrate	Sigma-Aldrich	F2262	Prepare a working solution (0.25 M) and store it at -20 °C
Bioanalyzer Small RNA Analysis	Agilent	5067-1548	The Small RNA Analysis is used for checking the quality of input RNAs and the efficiency of enzymatic reactions (e.g., Linker 1 ligation)
Bovine Serum Albumin (BSA; 10 mg/mL)	New England Biolabs	B9000	This product was discontinued on 12/15/2022 and is replaced with Recombinant Albumin, Molecular Biology Grade (NEB B9200).
Chloroform	Macron Fine Chemicals	4441-10
Demethylase	ArrayStar	AS-FS-004	Demethylase comes with the rtStar tRNA Pretreatment & First-Strand cDNA Synthesis Kit (AS-FS-004)
Deoxynucleotide (dNTP) Solution Mix	New England Biolabs	N0447L (component #: N0447LVIAL)	This dNTP Solution Mix contains equimolar concentrations of dATP, dCTP, dGTP and dTTP (10 mM each)
Digital Dual Heat Block	VWR Scientific Products	13259-052	Heating block is used with the QIAquick Gel Extraction Kit
DyeEx 2.0 Spin Kit	Qiagen	63204	Effective at removing short remnants (e.g., oligos less than 10 bp in length)
Electrophoresis Power Supply	Bio-Rad Labrotories	PowerPac 300
Eppendorf PCR Tubes (0.5 mL)	Eppendorf	0030124537
Eppendorf Safe-Lock Tubes (0.5 mL)	Eppendorf	022363611
Eppendorf Safe-Lock Tubes (1.5 mL)	Eppendorf	022363204
Eppendorf Safe-Lock Tubes (2 mL)	Eppendorf	022363352
Ethyl alcohol (Ethanol), Pure	Sigma-Aldrich	E7023	The pure ethanol is used with the Oligo Clean and Concentrator Kit from Zymo Research
Gel Imaging System	Alpha Innotech	FluorChem 8900
Gel Loading Dye, Purple (6X), no SDS	New England Biolabs	N0556S (component #: B7025SVIAL)	NEB N0556S contains Quick-Load Purple 50 bp DNA Ladder and Gel Loading Dye, Purple (6X), no SDS
GENESYS 180 UV-Vis Spectrophotometer	Thermo Fisher Scientific	840-309000	The spectrophotometer is used for measuring the oligo concentrations using the Beer's law
HEPES	Sigma-Aldrich	H4034	Prepare a working solution (1 M; pH = 8 with NaOH) and store it at -20 °C
Hydrochloric acid (HCl)	VWR Scientific Products	BDH3028	Prepare a working solution (5 M) and store it at ambient temperature
Isopropyl Alcohol (Isopropanol), Pure	Macron Fine Chemicals	3032-16	Isopropanol is used with the QIAquick Gel Extraction Kit
L-Ascorbic acid	Sigma-Aldrich	A5960	Prepare a working solution (0.5 M) and store it at -20ºC
Microcentrifuge	Eppendorf	5415D
NanoDrop 2000 Spectrophotometer	Thermo Fisher Scientific	ND-2000
NEBuffer 2 (10X)	New England Biolabs	M0264L (component #: B7002SVIAL)	NEB M0264L contains RecJf (30 U/μL) and NEBuffer 2 (10X); store at -20 °C
Nuclease-Free Water (not DEPC-Treated)	Thermo Fisher Scientific	AM9938
Oligo Clean & Concentrator Kit	Zymo Research	D4061	Store at ambient temperature
PEG 8000 (50% solution)	New England Biolabs	M0437M (component #: B1004SVIAL)	NEB M0437M contains T4 RNA Ligase 1 (30 U/μL), T4 RNA Ligase Reaction Buffer (10X), PEG 8000 (1X), and ATP (100 mM); prepare a working solution (10 mM) and store it at -20ºC
Peltier Thermal Cycler	MJ Research	PTC-200
Phenol:choloroform:isoamyl alcohol 25:24:1 pH = 5.2	Thermo Fisher Scientific	J62336
PrimeScript Buffer (5X)	TaKaRa	2680A
PrimeScript Reverse Transcriptase	TaKaRa	2680A
QIAquick Gel Extraction Kit	Qiagen	28704	This kit requires a heating block and isopropanol to work with
Quick-Load Purple 100 bp DNA Ladder	New England Biolabs	N0551S (component #: N0551SVIAL)
Quick-Load Purple 50 bp DNA Ladder	New England Biolabs	N0556S (component #: N0556SVIAL)	NEB N0556S contains Quick-Load Purple 50 bp DNA Ladder and Gel Loading Dye, Purple (6X), no SDS
RecJf (30 U/μL)	New England Biolabs	M0264L (component #: M0264LVIAL)	NEB M0264L contains RecJf (30 U/μL) and NEBuffer 2 (10X); store at -20 °C
RNase Inhibitor (murine; 40 U/μL)	New England Biolabs	M0314L (component #: M0314LVIAL)	Store at -20 °C
SeqAMP DNA Polymerase	TaKaRa	638509	TaKaRa 638509 contains SeqAMP DNA Polymerase and SeqAMP PCR Buffer (2X)
SeqAMP PCR Buffer (2X)	TaKaRa	638509	TaKaRa 638509 contains SeqAMP DNA Polymerase and SeqAMP PCR Buffer (2X)
Shrimp Alkaline Phosphatase (1 U/μL)	New England Biolabs	M0371L (component #: M0371LVIAL)
Sodium hydroxide (NaOH)	Sigma-Aldrich	S5881	Prepare a working solution (5 M) and store it at ambient temperature
T4 DNA Ligase (400 U/μL)	New England Biolabs	M0202L (component #: M0202LVIAL)	NEB M0202L contains T4 DNA Ligase (400 U/μL) and T4 DNA Ligase Reaction Buffer (10X)
T4 DNA Ligase Reaction Buffer (10X)	New England Biolabs	M0202L (component #: B0202SVIAL)	NEB M0202L contains T4 DNA Ligase (400 U/μL) and T4 DNA Ligase Reaction Buffer (10X)
T4 RNA Ligase 1 (30 U/μL)	New England Biolabs	M0437M (component #: M0437MVIAL)	NEB M0437M contains T4 RNA Ligase 1 (30 U/μL), T4 RNA Ligase Reaction Buffer (10X), PEG 8000 (1X), and ATP (100 mM)
T4 RNA Ligase Reaction Buffer (10X)	New England Biolabs	M0437M (component #: B0216SVIAL)	NEB M0437M contains T4 RNA Ligase 1 (30 U/μL), T4 RNA Ligase Reaction Buffer (10X), PEG 8000 (1X), and ATP (100 mM)