低分子RNAの定量のためのAQRNA-seq

要約

Absolute quantification RNA Sequencing (AQRNA-seq) は、生物学的混合物中のすべての低分子 RNA の状況を定量するために開発された技術です。ここでは、AQRNA-seqのライブラリー調製とデータ処理の両方のステップを実証し、飢餓誘発性休眠中の Mycobacterium bovis BCGのトランスファーRNA(tRNA)プールの変化を定量化します。

要約

AQRNA-seqは、生体サンプル中のシーケンシングリードカウントとsmall RNAコピー数との間に直接的な線形関係を提供し、small RNAのプールの正確な定量を可能にします。ここで説明するAQRNA-seqライブラリ調製手順には、カスタム設計のシーケンシングリンカーの使用と、逆転写処理性をブロックするメチル化RNA修飾を減らすステップが含まれ、これにより完全長cDNAの収量が増加します。さらに、付随するバイオインフォマティクスパイプラインの詳細な実装についても説明します。このAQRNA-seqのデモンストレーションは、20日間の栄養欠乏と6日間の蘇生の時間経過で5日間に採取された Mycobacterium bovis BCG中の45のtRNAの定量分析を通じて行われました。AQRNA-seqの効率と厳密性を向上させるための継続的な取り組みについても、ここで説明します。これには、PCR増幅後のプライマーダイマーの問題を軽減するためのゲル精製の回避方法や、より正確なリードマッピングを可能にするために全長リードの割合を増やす方法の検討が含まれます。AQRNA-seqの今後の機能強化は、多様な生物の細胞および組織サンプル中のすべてのsmall RNA種を定量するためのこの技術の自動化とハイスループットの実装を促進することに焦点を当てます。

概要

次世代シーケンシング(NGS)は、超並列シーケンシングとも呼ばれ、DNA断片化、アダプターオリゴヌクレオチドのライゲーション、ポリメラーゼ連鎖反応(PCR)ベースの増幅、DNAのシーケンシング、およびフラグメント配列のゲノムへの再アセンブルを含むDNAシーケンシング技術です。NGSのシーケンシングRNAへの適応(RNA-seq)は、RNA転写産物とそのバリアント^を同定および定量するための強力なアプローチです1。RNAライブラリー調製ワークフローとバイオインフォマティクス解析パイプラインの革新的な開発は、ラボ装置の進歩と相まって、RNA-seqアプリケーションのレパートリーを拡大し、エクソームシーケンシングを超えて、ノンコーディングRNAプロファイリング²、シングルセル解析³、空間トランスクリプトミクス^4,5、選択的スプライシング^解析6などの高度な機能オミクスへと進歩していますなど。これらの高度なRNA-seq法は、正常細胞および疾患細胞および組織におけるトランスクリプトームの定量解析を通じて、複雑なRNA機能を明らかにします。

RNA-seqのこれらの進歩にもかかわらず、....

プロトコル

注: 図1 は、AQRNA-seqライブラリの調製に関連する手順を図示したものです。この手順で使用した試薬、化学薬品、カラム/キットに関する詳細な情報は、 材料表に記載されています。インプット RNA サンプルの純度、完全性、および量の包括的な評価は、(i)3% アガロースゲル電気泳動、(ii)生体分子のサンプル品質管理のための自動電気泳動ツール( 材料表を参照)、および (iii) 紫外可視分光光度法および/または蛍光定量法を使用して行うことをお勧めします。特に指定がない限り、すべての反応とマスターミックスを氷上に保管することが義務付けられています。試薬(酵素など)をクールボックスに入れて-20°Cで保管したり、-20°Cで保管したりして、保存期間を維持し、ライブラリー中間体の複数回の凍結融解サイクルを回避します。

1. RNAの脱リン酸化

注:5'-リン酸(P;供与体)の除去は、RNAの3'-ヒドロキシル(OH;アクセプター)への自己ライゲーションを防ぎます。リンカーは、3'末端がジデオキシシチジン(リンカー1)またはスペーサー(リンカー2)のいずれかを組み込むように修飾されているため、自己ライゲーションしません。リンカーは、その5'-PをRNAまたはcDNAの....

ディスカッション

AQRNA-seqライブラリ調製ワークフローは、サンプル中のRNAの捕捉を最大化し、逆転写中のポリメラーゼのフォールオフを最小限に抑える^{ように設計されています7。}2段階のリンカーライゲーションにより、新規DNAオリゴ(Linker 1およびLinker 2)が過剰にライゲーションされ、サンプル内のRNAが完全に補完されます。余分なリンカーは、一本鎖DNAに特異的な5'から3'のエキソヌクレア?.......

資料

Name	Company	Catalog Number	Comments
2-ketoglutarate	Sigma-Aldrich	75890	Prepare a working solution (1 M) and store it at -20ºC
2100 Bioanalyzer Instrument	Agilent	G2938C
5'-deadenylase (50 U/μL)	New England Biolabs	M0331S (component #: M0331SVIAL)	Store at -20 °C
Adenosine 5'-Triphosphate (ATP)	New England Biolabs	M0437M (component #: N0437AVIAL)	NEB M0437M contains T4 RNA Ligase 1 (30 U/μL), T4 RNA Ligase Reaction Buffer (10X), PEG 8000 (1X), and ATP (100 mM); prepare a working solution (10 mM) and store it at -20ºC
AGAROSE GPG/LE	AmericanBio	AB00972-00500	Store at ambient temperature
Ammonium iron(II) sulfate hexahydrate	Sigma-Aldrich	F2262	Prepare a working solution (0.25 M) and store it at -20 °C
Bioanalyzer Small RNA Analysis	Agilent	5067-1548	The Small RNA Analysis is used for checking the quality of input RNAs and the efficiency of enzymatic reactions (e.g., Linker 1 ligation)
Bovine Serum Albumin (BSA; 10 mg/mL)	New England Biolabs	B9000	This product was discontinued on 12/15/2022 and is replaced with Recombinant Albumin, Molecular Biology Grade (NEB B9200).
Chloroform	Macron Fine Chemicals	4441-10
Demethylase	ArrayStar	AS-FS-004	Demethylase comes with the rtStar tRNA Pretreatment & First-Strand cDNA Synthesis Kit (AS-FS-004)
Deoxynucleotide (dNTP) Solution Mix	New England Biolabs	N0447L (component #: N0447LVIAL)	This dNTP Solution Mix contains equimolar concentrations of dATP, dCTP, dGTP and dTTP (10 mM each)
Digital Dual Heat Block	VWR Scientific Products	13259-052	Heating block is used with the QIAquick Gel Extraction Kit
DyeEx 2.0 Spin Kit	Qiagen	63204	Effective at removing short remnants (e.g., oligos less than 10 bp in length)
Electrophoresis Power Supply	Bio-Rad Labrotories	PowerPac 300
Eppendorf PCR Tubes (0.5 mL)	Eppendorf	0030124537
Eppendorf Safe-Lock Tubes (0.5 mL)	Eppendorf	022363611
Eppendorf Safe-Lock Tubes (1.5 mL)	Eppendorf	022363204
Eppendorf Safe-Lock Tubes (2 mL)	Eppendorf	022363352
Ethyl alcohol (Ethanol), Pure	Sigma-Aldrich	E7023	The pure ethanol is used with the Oligo Clean and Concentrator Kit from Zymo Research
Gel Imaging System	Alpha Innotech	FluorChem 8900
Gel Loading Dye, Purple (6X), no SDS	New England Biolabs	N0556S (component #: B7025SVIAL)	NEB N0556S contains Quick-Load Purple 50 bp DNA Ladder and Gel Loading Dye, Purple (6X), no SDS
GENESYS 180 UV-Vis Spectrophotometer	Thermo Fisher Scientific	840-309000	The spectrophotometer is used for measuring the oligo concentrations using the Beer's law
HEPES	Sigma-Aldrich	H4034	Prepare a working solution (1 M; pH = 8 with NaOH) and store it at -20 °C
Hydrochloric acid (HCl)	VWR Scientific Products	BDH3028	Prepare a working solution (5 M) and store it at ambient temperature
Isopropyl Alcohol (Isopropanol), Pure	Macron Fine Chemicals	3032-16	Isopropanol is used with the QIAquick Gel Extraction Kit
L-Ascorbic acid	Sigma-Aldrich	A5960	Prepare a working solution (0.5 M) and store it at -20ºC
Microcentrifuge	Eppendorf	5415D
NanoDrop 2000 Spectrophotometer	Thermo Fisher Scientific	ND-2000
NEBuffer 2 (10X)	New England Biolabs	M0264L (component #: B7002SVIAL)	NEB M0264L contains RecJf (30 U/μL) and NEBuffer 2 (10X); store at -20 °C
Nuclease-Free Water (not DEPC-Treated)	Thermo Fisher Scientific	AM9938
Oligo Clean & Concentrator Kit	Zymo Research	D4061	Store at ambient temperature
PEG 8000 (50% solution)	New England Biolabs	M0437M (component #: B1004SVIAL)	NEB M0437M contains T4 RNA Ligase 1 (30 U/μL), T4 RNA Ligase Reaction Buffer (10X), PEG 8000 (1X), and ATP (100 mM); prepare a working solution (10 mM) and store it at -20ºC
Peltier Thermal Cycler	MJ Research	PTC-200
Phenol:choloroform:isoamyl alcohol 25:24:1 pH = 5.2	Thermo Fisher Scientific	J62336
PrimeScript Buffer (5X)	TaKaRa	2680A
PrimeScript Reverse Transcriptase	TaKaRa	2680A
QIAquick Gel Extraction Kit	Qiagen	28704	This kit requires a heating block and isopropanol to work with
Quick-Load Purple 100 bp DNA Ladder	New England Biolabs	N0551S (component #: N0551SVIAL)
Quick-Load Purple 50 bp DNA Ladder	New England Biolabs	N0556S (component #: N0556SVIAL)	NEB N0556S contains Quick-Load Purple 50 bp DNA Ladder and Gel Loading Dye, Purple (6X), no SDS
RecJf (30 U/μL)	New England Biolabs	M0264L (component #: M0264LVIAL)	NEB M0264L contains RecJf (30 U/μL) and NEBuffer 2 (10X); store at -20 °C
RNase Inhibitor (murine; 40 U/μL)	New England Biolabs	M0314L (component #: M0314LVIAL)	Store at -20 °C
SeqAMP DNA Polymerase	TaKaRa	638509	TaKaRa 638509 contains SeqAMP DNA Polymerase and SeqAMP PCR Buffer (2X)
SeqAMP PCR Buffer (2X)	TaKaRa	638509	TaKaRa 638509 contains SeqAMP DNA Polymerase and SeqAMP PCR Buffer (2X)
Shrimp Alkaline Phosphatase (1 U/μL)	New England Biolabs	M0371L (component #: M0371LVIAL)
Sodium hydroxide (NaOH)	Sigma-Aldrich	S5881	Prepare a working solution (5 M) and store it at ambient temperature
T4 DNA Ligase (400 U/μL)	New England Biolabs	M0202L (component #: M0202LVIAL)	NEB M0202L contains T4 DNA Ligase (400 U/μL) and T4 DNA Ligase Reaction Buffer (10X)
T4 DNA Ligase Reaction Buffer (10X)	New England Biolabs	M0202L (component #: B0202SVIAL)	NEB M0202L contains T4 DNA Ligase (400 U/μL) and T4 DNA Ligase Reaction Buffer (10X)
T4 RNA Ligase 1 (30 U/μL)	New England Biolabs	M0437M (component #: M0437MVIAL)	NEB M0437M contains T4 RNA Ligase 1 (30 U/μL), T4 RNA Ligase Reaction Buffer (10X), PEG 8000 (1X), and ATP (100 mM)
T4 RNA Ligase Reaction Buffer (10X)	New England Biolabs	M0437M (component #: B0216SVIAL)	NEB M0437M contains T4 RNA Ligase 1 (30 U/μL), T4 RNA Ligase Reaction Buffer (10X), PEG 8000 (1X), and ATP (100 mM)