AQRNA-seq zur Quantifizierung kleiner RNAs

Zusammenfassung

Die absolute Quantifizierung der RNA-Sequenzierung (AQRNA-seq) ist eine Technologie, die entwickelt wurde, um die Landschaft aller kleinen RNAs in biologischen Gemischen zu quantifizieren. Hier werden sowohl die Bibliotheksvorbereitung als auch die Datenverarbeitungsschritte von AQRNA-seq demonstriert, wobei Veränderungen im Transfer-RNA (tRNA)-Pool in Mycobacterium bovis BCG während der hungerinduzierten Dormanzphase quantifiziert werden.

Zusammenfassung

AQRNA-seq bietet eine direkte lineare Beziehung zwischen den Lesezahlen der Sequenzierung und der Anzahl kleiner RNA-Kopien in einer biologischen Probe und ermöglicht so eine genaue Quantifizierung des Pools kleiner RNAs. Das hier beschriebene Verfahren zur Vorbereitung der AQRNA-seq-Bibliothek beinhaltet die Verwendung von kundenspezifisch entwickelten Sequenzierungslinkern und einen Schritt zur Reduzierung von Methylierungs-RNA-Modifikationen, die die Prozessivität der reversen Transkription blockieren, was zu einer erhöhten Ausbeute an cDNAs in voller Länge führt. Darüber hinaus wird eine detaillierte Implementierung der begleitenden Bioinformatik-Pipeline vorgestellt. Diese Demonstration von AQRNA-seq wurde durch eine quantitative Analyse der 45 tRNAs in Mycobacterium bovis BCG durchgeführt, die an 5 ausgewählten Tagen über einen Zeitraum von 20 Tagen mit Nährstoffentzug und 6 Tagen Wiederbelebung entnommen wurden. Die laufenden Bemühungen zur Verbesserung der Effizienz und Strenge von AQRNA-seq werden hier ebenfalls erörtert. Dazu gehört die Erforschung von Methoden zur Vermeidung der Gelaufreinigung, zur Minderung von Primer-Dimer-Problemen nach der PCR-Amplifikation und zur Erhöhung des Anteils von Reads in voller Länge, um ein genaueres Read-Mapping zu ermöglichen. Zukünftige Verbesserungen von AQRNA-seq werden sich auf die Erleichterung der Automatisierung und Hochdurchsatzimplementierung dieser Technologie zur Quantifizierung aller kleinen RNA-Spezies in Zell- und Gewebeproben verschiedener Organismen konzentrieren.

Einleitung

Next-Generation-Sequencing (NGS), auch bekannt als massiv parallele Sequenzierung, ist eine DNA-Sequenzierungstechnologie, die DNA-Fragmentierung, Ligation von Adapter-Oligonukleotiden, Polymerase-Kettenreaktion (PCR)-basierte Amplifikation, Sequenzierung der DNA und Reassemblierung der Fragmentsequenzen zu einem Genom umfasst. Die Anpassung von NGS an Sequenz-RNA (RNA-seq) ist ein leistungsfähiger Ansatz zur Identifizierung und Quantifizierung von RNA-Transkripten und deren Varianten¹. Innovative Entwicklungen bei Arbeitsabläufen zur Vorbereitung von RNA-Bibliotheken und bioinformatischen Analysepipelines, gepaart mit Fortschritten bei Laborin....

Protokoll

HINWEIS: Abbildung 1 zeigt eine grafische Darstellung der Verfahren, die bei der Vorbereitung der AQRNA-seq-Bibliothek erforderlich sind. Detaillierte Informationen zu den Reagenzien, Chemikalien und Säulen/Kits, die in dem Verfahren verwendet werden, finden Sie in der Materialtabelle. Es wird empfohlen, eine umfassende Bewertung der Reinheit, Integrität und Menge der Eingabe-RNA-Proben mit (i) 3%iger Agarose-Gelelektrophorese, (ii) automatisierten Elektrophoresewerkzeugen zur Probenqualitätskontrolle von Biomolekülen (siehe Materialtabelle) und (iii) UV-sichtbarer Spektrophotometrie und/oder fluorometris....

Diskussion

Der Arbeitsablauf zur Vorbereitung der AQRNA-seq-Bibliothek wurde entwickelt, um die Erfassung von RNAs in einer Probe zu maximieren und den Polymeraseabfall während der reversen Transkription^{zu minimieren 7}. Durch eine zweistufige Linker-Ligation werden neuartige DNA-Oligos (Linker 1 und Linker 2) im Überschuss ligiert, um die RNA in der Probe vollständig zu ergänzen. Überschüssige Linker können effizient mit RecJf, einer 5'- bis 3'-Exonuklease, die für einzelsträngige DNAs spezifisch is.......

Materialien

Name	Company	Catalog Number	Comments
2-ketoglutarate	Sigma-Aldrich	75890	Prepare a working solution (1 M) and store it at -20ºC
2100 Bioanalyzer Instrument	Agilent	G2938C
5'-deadenylase (50 U/μL)	New England Biolabs	M0331S (component #: M0331SVIAL)	Store at -20 °C
Adenosine 5'-Triphosphate (ATP)	New England Biolabs	M0437M (component #: N0437AVIAL)	NEB M0437M contains T4 RNA Ligase 1 (30 U/μL), T4 RNA Ligase Reaction Buffer (10X), PEG 8000 (1X), and ATP (100 mM); prepare a working solution (10 mM) and store it at -20ºC
AGAROSE GPG/LE	AmericanBio	AB00972-00500	Store at ambient temperature
Ammonium iron(II) sulfate hexahydrate	Sigma-Aldrich	F2262	Prepare a working solution (0.25 M) and store it at -20 °C
Bioanalyzer Small RNA Analysis	Agilent	5067-1548	The Small RNA Analysis is used for checking the quality of input RNAs and the efficiency of enzymatic reactions (e.g., Linker 1 ligation)
Bovine Serum Albumin (BSA; 10 mg/mL)	New England Biolabs	B9000	This product was discontinued on 12/15/2022 and is replaced with Recombinant Albumin, Molecular Biology Grade (NEB B9200).
Chloroform	Macron Fine Chemicals	4441-10
Demethylase	ArrayStar	AS-FS-004	Demethylase comes with the rtStar tRNA Pretreatment & First-Strand cDNA Synthesis Kit (AS-FS-004)
Deoxynucleotide (dNTP) Solution Mix	New England Biolabs	N0447L (component #: N0447LVIAL)	This dNTP Solution Mix contains equimolar concentrations of dATP, dCTP, dGTP and dTTP (10 mM each)
Digital Dual Heat Block	VWR Scientific Products	13259-052	Heating block is used with the QIAquick Gel Extraction Kit
DyeEx 2.0 Spin Kit	Qiagen	63204	Effective at removing short remnants (e.g., oligos less than 10 bp in length)
Electrophoresis Power Supply	Bio-Rad Labrotories	PowerPac 300
Eppendorf PCR Tubes (0.5 mL)	Eppendorf	0030124537
Eppendorf Safe-Lock Tubes (0.5 mL)	Eppendorf	022363611
Eppendorf Safe-Lock Tubes (1.5 mL)	Eppendorf	022363204
Eppendorf Safe-Lock Tubes (2 mL)	Eppendorf	022363352
Ethyl alcohol (Ethanol), Pure	Sigma-Aldrich	E7023	The pure ethanol is used with the Oligo Clean and Concentrator Kit from Zymo Research
Gel Imaging System	Alpha Innotech	FluorChem 8900
Gel Loading Dye, Purple (6X), no SDS	New England Biolabs	N0556S (component #: B7025SVIAL)	NEB N0556S contains Quick-Load Purple 50 bp DNA Ladder and Gel Loading Dye, Purple (6X), no SDS
GENESYS 180 UV-Vis Spectrophotometer	Thermo Fisher Scientific	840-309000	The spectrophotometer is used for measuring the oligo concentrations using the Beer's law
HEPES	Sigma-Aldrich	H4034	Prepare a working solution (1 M; pH = 8 with NaOH) and store it at -20 °C
Hydrochloric acid (HCl)	VWR Scientific Products	BDH3028	Prepare a working solution (5 M) and store it at ambient temperature
Isopropyl Alcohol (Isopropanol), Pure	Macron Fine Chemicals	3032-16	Isopropanol is used with the QIAquick Gel Extraction Kit
L-Ascorbic acid	Sigma-Aldrich	A5960	Prepare a working solution (0.5 M) and store it at -20ºC
Microcentrifuge	Eppendorf	5415D
NanoDrop 2000 Spectrophotometer	Thermo Fisher Scientific	ND-2000
NEBuffer 2 (10X)	New England Biolabs	M0264L (component #: B7002SVIAL)	NEB M0264L contains RecJf (30 U/μL) and NEBuffer 2 (10X); store at -20 °C
Nuclease-Free Water (not DEPC-Treated)	Thermo Fisher Scientific	AM9938
Oligo Clean & Concentrator Kit	Zymo Research	D4061	Store at ambient temperature
PEG 8000 (50% solution)	New England Biolabs	M0437M (component #: B1004SVIAL)	NEB M0437M contains T4 RNA Ligase 1 (30 U/μL), T4 RNA Ligase Reaction Buffer (10X), PEG 8000 (1X), and ATP (100 mM); prepare a working solution (10 mM) and store it at -20ºC
Peltier Thermal Cycler	MJ Research	PTC-200
Phenol:choloroform:isoamyl alcohol 25:24:1 pH = 5.2	Thermo Fisher Scientific	J62336
PrimeScript Buffer (5X)	TaKaRa	2680A
PrimeScript Reverse Transcriptase	TaKaRa	2680A
QIAquick Gel Extraction Kit	Qiagen	28704	This kit requires a heating block and isopropanol to work with
Quick-Load Purple 100 bp DNA Ladder	New England Biolabs	N0551S (component #: N0551SVIAL)
Quick-Load Purple 50 bp DNA Ladder	New England Biolabs	N0556S (component #: N0556SVIAL)	NEB N0556S contains Quick-Load Purple 50 bp DNA Ladder and Gel Loading Dye, Purple (6X), no SDS
RecJf (30 U/μL)	New England Biolabs	M0264L (component #: M0264LVIAL)	NEB M0264L contains RecJf (30 U/μL) and NEBuffer 2 (10X); store at -20 °C
RNase Inhibitor (murine; 40 U/μL)	New England Biolabs	M0314L (component #: M0314LVIAL)	Store at -20 °C
SeqAMP DNA Polymerase	TaKaRa	638509	TaKaRa 638509 contains SeqAMP DNA Polymerase and SeqAMP PCR Buffer (2X)
SeqAMP PCR Buffer (2X)	TaKaRa	638509	TaKaRa 638509 contains SeqAMP DNA Polymerase and SeqAMP PCR Buffer (2X)
Shrimp Alkaline Phosphatase (1 U/μL)	New England Biolabs	M0371L (component #: M0371LVIAL)
Sodium hydroxide (NaOH)	Sigma-Aldrich	S5881	Prepare a working solution (5 M) and store it at ambient temperature
T4 DNA Ligase (400 U/μL)	New England Biolabs	M0202L (component #: M0202LVIAL)	NEB M0202L contains T4 DNA Ligase (400 U/μL) and T4 DNA Ligase Reaction Buffer (10X)
T4 DNA Ligase Reaction Buffer (10X)	New England Biolabs	M0202L (component #: B0202SVIAL)	NEB M0202L contains T4 DNA Ligase (400 U/μL) and T4 DNA Ligase Reaction Buffer (10X)
T4 RNA Ligase 1 (30 U/μL)	New England Biolabs	M0437M (component #: M0437MVIAL)	NEB M0437M contains T4 RNA Ligase 1 (30 U/μL), T4 RNA Ligase Reaction Buffer (10X), PEG 8000 (1X), and ATP (100 mM)
T4 RNA Ligase Reaction Buffer (10X)	New England Biolabs	M0437M (component #: B0216SVIAL)	NEB M0437M contains T4 RNA Ligase 1 (30 U/μL), T4 RNA Ligase Reaction Buffer (10X), PEG 8000 (1X), and ATP (100 mM)