AQRNA-seq zur Quantifizierung kleiner RNAs

Zusammenfassung

Die absolute Quantifizierung der RNA-Sequenzierung (AQRNA-seq) ist eine Technologie, die entwickelt wurde, um die Landschaft aller kleinen RNAs in biologischen Gemischen zu quantifizieren. Hier werden sowohl die Bibliotheksvorbereitung als auch die Datenverarbeitungsschritte von AQRNA-seq demonstriert, wobei Veränderungen im Transfer-RNA (tRNA)-Pool in Mycobacterium bovis BCG während der hungerinduzierten Dormanzphase quantifiziert werden.

Zusammenfassung

AQRNA-seq bietet eine direkte lineare Beziehung zwischen den Lesezahlen der Sequenzierung und der Anzahl kleiner RNA-Kopien in einer biologischen Probe und ermöglicht so eine genaue Quantifizierung des Pools kleiner RNAs. Das hier beschriebene Verfahren zur Vorbereitung der AQRNA-seq-Bibliothek beinhaltet die Verwendung von kundenspezifisch entwickelten Sequenzierungslinkern und einen Schritt zur Reduzierung von Methylierungs-RNA-Modifikationen, die die Prozessivität der reversen Transkription blockieren, was zu einer erhöhten Ausbeute an cDNAs in voller Länge führt. Darüber hinaus wird eine detaillierte Implementierung der begleitenden Bioinformatik-Pipeline vorgestellt. Diese Demonstration von AQRNA-seq wurde durch eine quantitative Analyse der 45 tRNAs in Mycobacterium bovis BCG durchgeführt, die an 5 ausgewählten Tagen über einen Zeitraum von 20 Tagen mit Nährstoffentzug und 6 Tagen Wiederbelebung entnommen wurden. Die laufenden Bemühungen zur Verbesserung der Effizienz und Strenge von AQRNA-seq werden hier ebenfalls erörtert. Dazu gehört die Erforschung von Methoden zur Vermeidung der Gelaufreinigung, zur Minderung von Primer-Dimer-Problemen nach der PCR-Amplifikation und zur Erhöhung des Anteils von Reads in voller Länge, um ein genaueres Read-Mapping zu ermöglichen. Zukünftige Verbesserungen von AQRNA-seq werden sich auf die Erleichterung der Automatisierung und Hochdurchsatzimplementierung dieser Technologie zur Quantifizierung aller kleinen RNA-Spezies in Zell- und Gewebeproben verschiedener Organismen konzentrieren.

Einleitung

Next-Generation-Sequencing (NGS), auch bekannt als massiv parallele Sequenzierung, ist eine DNA-Sequenzierungstechnologie, die DNA-Fragmentierung, Ligation von Adapter-Oligonukleotiden, Polymerase-Kettenreaktion (PCR)-basierte Amplifikation, Sequenzierung der DNA und Reassemblierung der Fragmentsequenzen zu einem Genom umfasst. Die Anpassung von NGS an Sequenz-RNA (RNA-seq) ist ein leistungsfähiger Ansatz zur Identifizierung und Quantifizierung von RNA-Transkripten und deren Varianten¹. Innovative Entwicklungen bei Arbeitsabläufen zur Vorbereitung von RNA-Bibliotheken und bioinformatischen Analysepipelines, gepaart mit Fortschritten bei Laborinstrumenten, haben das Repertoire an RNA-Seq-Anwendungen erweitert und sind über die Exomsequenzierung hinaus zu fortschrittlichen funktionellen Omics-Anwendungen wie nicht-kodierendem RNA-Profiling², Einzelzellanalyse³, räumlicher Transkriptomik ^4,5 und alternativer Spleißanalyse⁶ vorangeschrittenunter anderem. Diese fortschrittlichen RNA-seq-Methoden decken komplexe RNA-Funktionen durch quantitative Analyse des Transkriptoms in normalen und erkrankten Zellen und Geweben auf.

Trotz dieser Fortschritte in der RNA-seq schränken mehrere wichtige technische Merkmale die quantitative Leistungsfähigkeit der Methode ein. Während die meisten RNA-seq-Methoden eine präzise und genaue Quantifizierung von Änderungen der RNA-Spiegel zwischen experimentellen Variablen (d. h. biologischen Proben und/oder physiologischen Zuständen) ermöglichen, können sie keine quantitativen Vergleiche der Konzentrationen von RNA-Molekülen in einer Probe liefern. Zum Beispiel können die meisten RNA-seq-Methoden die relative Anzahl der Kopien einzelner tRNA-Isoakzeptormoleküle in einem zellulären Pool exprimierter tRNAs nicht genau quantifizieren. Wie in der Begleitpublikation⁷ hervorgehoben, ergibt sich diese Einschränkung des RNA-seq aus mehreren Merkmalen der RNA-Struktur und der Biochemie der Bibliotheksvorbereitung. Zum Beispiel wird die Aktivität der Ligationsenzyme, die zum Anhängen der 3'- und 5'-End-Sequenzierungslinker an RNA-Moleküle verwendet werden, stark von der Identität der terminalen Nukleotide der RNA und der Sequenzierungslinker beeinflusst. Dies führt zu großen Schwankungen in der Effizienz von Linker-Ligationen und zu tiefgreifenden künstlichen Steigerungen der Sequenzierungs-Reads ^8,9,10.

Eine zweite Reihe von Einschränkungen ergibt sich aus den inhärenten strukturellen Eigenschaften von RNA-Molekülen. Insbesondere die Bildung der RNA-Sekundärstruktur und dynamische Veränderungen in den Dutzenden von posttranskriptionellen RNA-Modifikationen des Epitranskriptoms können zu einem Polymeraseabfall oder einer Mutation während der reversen Transkription führen. Diese Fehler führen zu einer unvollständigen oder verkürzten cDNA-Synthese oder einer veränderten RNA-Sequenz. Während diese beiden Phänomene ausgenutzt werden können, um Sekundärstrukturen oder einige Modifikationen zu kartieren, verschlechtern sie die quantitative Genauigkeit von RNA-seq, wenn nachfolgende Bibliotheksvorbereitungsschritte keine verkürzten cDNAs erfassen oder wenn die Datenverarbeitung mutierte Sequenzen auswirft, die nicht mit einem Referenzdatensatz übereinstimmen^11,12. Darüber hinaus verringert die immense chemische, längen- und strukturelle Vielfalt von RNA-Transkripten sowie der Mangel an Werkzeugen zur gleichmäßigen Fragmentierung langer RNAs die Anwendbarkeit der meisten RNA-seq-Methoden auf alle RNA-Spezies¹³.

Die AQRNA-seq-Methode (absolute Quantifizierung RNA-Sequenzierung) wurde entwickelt, um mehrere dieser technischen und biologischen Einschränkungen zu beseitigen, die die quantitative Genauigkeit einschränken⁷. Durch die Minimierung sequenzabhängiger Verzerrungen bei der Erfassung, Ligation und Amplifikation während der Vorbereitung der RNA-Sequenzierungsbibliotheken erreicht AQRNA-seq eine überlegene Linearität im Vergleich zu anderen Methoden und quantifiziert 75 % einer Referenzbibliothek von 963 miRNAs mit 2-facher Genauigkeit. Diese lineare Korrelation von Sequenzierung, Lesezahl und RNA-Abundanz wird auch bei der Analyse eines Pools variabler Länge von RNA-Oligonukleotidstandards und in Bezug auf orthogonale Methoden wie Northern Blot beobachtet. Die Etablierung der Linearität zwischen der Anzahl der Sequenzierungs-Reads und der RNA-Abundanz ermöglicht AQRNA-seq eine genaue, absolute Quantifizierung aller RNA-Spezies innerhalb einer Probe.

Im Folgenden finden Sie eine Beschreibung des Protokolls für den Workflow zur Vorbereitung von AQRNA-seq-Bibliotheken und der zugehörigen nachgelagerten Datenanalyse-Pipeline. Die Methode wurde angewendet, um die Dynamik der tRNA-Abundanz während der hungerinduzierten Ruhephase und der anschließenden Wiederbelebung im Mycobacterium bovis bacilli de Calmette et Guérin (BCG) Modell der Tuberkulose aufzuklären. Die Ergebnisse wurden für die explorative Visualisierung der Sequenzierungsdaten vorgestellt, zusammen mit anschließenden Clustering- und differentiellen Expressionsanalysen, die erkennbare Muster in der tRNA-Abundanz aufdeckten, die mit verschiedenen Phänotypen assoziiert sind.

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Protokoll

HINWEIS: Abbildung 1 zeigt eine grafische Darstellung der Verfahren, die bei der Vorbereitung der AQRNA-seq-Bibliothek erforderlich sind. Detaillierte Informationen zu den Reagenzien, Chemikalien und Säulen/Kits, die in dem Verfahren verwendet werden, finden Sie in der Materialtabelle. Es wird empfohlen, eine umfassende Bewertung der Reinheit, Integrität und Menge der Eingabe-RNA-Proben mit (i) 3%iger Agarose-Gelelektrophorese, (ii) automatisierten Elektrophoresewerkzeugen zur Probenqualitätskontrolle von Biomolekülen (siehe Materialtabelle) und (iii) UV-sichtbarer Spektrophotometrie und/oder fluorometrischer Quantifizierung durchzuführen. Es ist zwingend erforderlich, alle Reaktionen und Mastermixe auf Eis zu halten, sofern nicht anders angegeben. Transportieren Sie Reagenzien (z. B. Enzyme) in Kühlboxen zur und von -20 °C Lagerung, um ihre Haltbarkeit zu erhalten und mehrere Gefrier-Tau-Zyklen von Bibliothekszwischenprodukten zu vermeiden.

1. Dephosphorylierung von RNAs

HINWEIS: Die Entfernung des 5'-Phosphats (P; Donor) verhindert die Selbstligation an das 3'-Hydroxyl (OH; Akzeptor) von RNAs. Linker ligieren sich nicht selbst, da ihr 3'-Ende so modifiziert wird, dass es entweder ein Didesoxycytidin (Linker 1) oder einen Spacer (Linker 2) enthält. Linker können nur ligiert werden, indem ihr 5'-P an das 3'-OH der RNAs oder cDNAs gebunden wird.

1. Bereiten Sie die Dephosphorylierungsreaktion in einem sterilen PCR-Röhrchen (z. B. 200 μl oder 500 μl Röhrchen) vor, indem Sie bis zu 2 μl der RNA-Probe, 0,5 μl 40 μl RNase-Inhibitor, 1 μl 0,5 μM internen Standard (Tabelle 1), 0,5 μl 10x T4-RNA-Ligase-Reaktionspuffer, 1 μl 1 μl alkalische Garnelenphosphatase, und ausreichend RNase-freies Wasser, um das Gesamtvolumen auf 5 μL zu bringen.
   HINWEIS: Für typische Proben werden 75 ng RNA (oder ca. 2 pmol für eine 80 nt RNA) als ausreichend für die Quantifizierung kleiner RNAs unter Verwendung dieses Protokolls angesehen.
2. Inkubieren Sie 30 Minuten lang bei 37 °C, um RNAs zu dephosphorylieren, und dann 5 Minuten lang bei 65 °C, um das Enzym zu inaktivieren und die RNAs zu denaturieren. Bewahren Sie die Proben mindestens 10 Minuten lang bei 4 °C auf, um eine Renaturierung zu verhindern.

2. Ligation von Linker 1 bis zum 3'-Ende von RNAs

1. Bereiten Sie die Linker-1-Ligationsreaktion in einem sterilen PCR-Röhrchen vor, indem Sie 5 μl der dephosphorylierten RNAs (Produkte aus Schritt 1), 0,5 μl 40 μl/μl RNase-Inhibitor, 1 μl 100 μM Linker 1 (Tabelle 1), 3 μl 10 mM ATP, 2,5 μl 10x T4-RNA-Ligase-Reaktionspuffer, 15 μl PEG8000 (50%ige Lösung) hinzufügen. 2 μl 30 U/μl T4-RNA-Ligase 1 und 1 μl RNase-freies Wasser.
   HINWEIS: Reagenzien können zu Mastermixen verarbeitet werden, um die Verarbeitung der Proben zu erleichtern. Nehmen Sie keine PEG8000 und T4-RNA-Ligase 1 in den Mastermix auf.
2. Inkubieren Sie 2 h lang bei 25 °C und dann 16 h lang bei 16 °C, um Linker 1 an die RNAs zu ligieren.
3. Säulenreinigung der Linker-1-ligierten RNAs. Verwenden Sie ein Kit für die DNA/RNA-Rückgewinnung und -Reinigung (siehe Materialtabelle).
   HINWEIS: Dieses Säulenaufreinigungsprotokoll gilt für alle nachfolgenden Säulenaufreinigungen mit demselben Kit. Kits, die eine Gelfiltrationstechnologie verwenden, um Farbstoffterminatoren aus Sequenzierungsreaktionen zu entfernen (siehe Materialtabelle), können hier nicht verwendet werden, da PEG8000 nicht mit den Gelfiltern solcher Kits kompatibel ist. Es wird empfohlen, nach der Aufreinigung ein Aliquot (1,2 μl) jeder Probe aufzubewahren. Falls erforderlich, können diese Aliquots zur Überprüfung der Ligationseffizienz verwendet werden, indem ein kommerzieller Nukleinsäureanalysator betrieben wird. Bewahren Sie die restlichen gereinigten Proben bis zu weiteren Schritten auf Eis oder bei -20 °C auf.
   1. Für ein Probenvolumen < 50 μl fügen Sie RNase-freies Wasser hinzu, um es auf 50 μl zu bringen. Fügen Sie 2 Volumen des Oligo-Bindungspuffers (im Kit enthalten) zu 1 Volumen der Probe hinzu. Geben Sie 8 Volumen 100 % Ethanol zu 1 Volumen der Probe.
   2. Laden Sie die Probe (bis zu 750 μl auf einmal) in eine Säule, die sich in einem 2-ml-Entnahmeröhrchen (im Kit enthalten) befindet. Um RNAs an die Säule zu binden, zentrifugieren Sie 30 s lang bei 10.000 x g und verwerfen Sie den Durchfluss (d. h. die Flüssigkeit im Sammelröhrchen). Setzen Sie die Säule wieder in das Auffangröhrchen ein.
   3. Um die Verunreinigungen von der Säule zu waschen, geben Sie 750 μl des DNA-Waschpuffers (im Kit enthalten) in die Säule. Bei 10.000 x g für 30 s zentrifugieren und den Durchfluss verwerfen. Setzen Sie die Säule wieder in das Auffangröhrchen ein.
   4. Zentrifugieren Sie bei maximaler Drehzahl (z. B. 16.000 x g für eine Tisch-Mikrozentrifuge) für weitere 1 Minute, um den verbleibenden DNA-Waschpuffer zu entfernen.
   5. Um die RNAs zu eluieren, bringen Sie die Säule vorsichtig in ein steriles 1,5-ml-Röhrchen und geben Sie RNase-freies Wasser in die Säule. Verwenden Sie bei der Eluierung der RNAs ein größeres Volumen als erforderlich, um einen möglichen Volumenverlust während des Elutionsprozesses zu berücksichtigen. Wenn beispielsweise 15 μl für den folgenden Schritt benötigt werden, fügen Sie 17 μl RNase-freies Wasser für die Elution hinzu. Zentrifugieren Sie bei 10.000 x g für 30 s.

3. Entfernung von posttranskriptionellen Methylierungen durch AlkB-Demethylase

HINWEIS: AlkB ist ein bakterielles Enzym, das Methylgruppen von einigen, aber nicht allen methylierten Nukleotiden in DNA und RNA entfernt. Die Entfernung verschiedener Arten von methylierten Ribonukleotiden in RNA verhindert den Abfall der reversen Transkriptase, um mehr Reads in voller Länge und die Identifizierung von Modifikationsstellen zu ermöglichen. Dieser Schritt muss bei einem niedrigen pH-Wert gesteuert werden, um einen unerwarteten Abbau der RNAs zu verhindern.

1. Bereiten Sie eine Stammlösung von 1 M 2-Ketoglutarat vor, indem Sie 1,4611 g 2-Ketoglutarat (146,11 g pro M) in 10 ml RNase-freiem Wasser auflösen. Filter: Sterilisieren Sie die Lösung durch einen 0,2 μm Spritzenvorsatzfilter. Die Stammlösung wird in sterile 2-ml-Röhrchen aliquotiert und bei -20 °C gelagert.
2. Bereiten Sie eine Stammlösung von 0,5 M L-Ascorbinsäure vor, indem Sie 0,88 g L-Ascorbinsäure (176,12 g pro M) in 10 mL RNase-freiem Wasser lösen. Filter: Sterilisieren Sie die Lösung durch einen 0,2 μm Spritzenvorsatzfilter. Die Stammlösung wird in sterile 2-ml-Röhrchen aliquotiert und bei -20 °C gelagert.
3. Bereiten Sie eine Stammlösung von 0,25 M Ammoniumeisensulfat-Hexahydrat vor, indem Sie 0,9835 g Ammoniumeisensulfat-Hexahydrat (392,14 g pro M) in 10 ml RNase-freiem Wasser lösen. Filter: Sterilisieren Sie die Lösung durch einen 0,2 μm Spritzenvorsatzfilter. Die Stammlösung wird in sterile 2-ml-Röhrchen aliquotiert und bei -20 °C gelagert.
4. Bereiten Sie eine Stammlösung von 1 M HEPES vor, indem Sie 2,383 g HEPES (238,30 g pro M) in 10 ml RNase-freiem Wasser auflösen. Stellen Sie den pH-Wert der Lösung mit NaOH auf 8 ein und sterilisieren Sie die Lösung durch einen 0,2-μm-Spritzenfilter. Die Stammlösung wird in sterile 2-ml-Röhrchen aliquotiert und bei -20 °C gelagert.
5. Bereiten Sie einen 2x AlkB-Reaktionspuffer vor. Um 10 ml des Puffers herzustellen, kombinieren Sie 1,5 μl 1 M 2-Ketoglutarat (hergestellt in Schritt 3.1), 80 μl 0,5 M l Ascorbinsäure (hergestellt in Schritt 3.2), 6 μl 0,25 M Ammoniumeisensulfat-Hexahydrat (hergestellt in Schritt 3.3), 100 μl 10 mg/ml BSA, 1000 μl 1 M HEPES (hergestellt in Schritt 3.4; zuletzt hinzufügen), und 8812,5 μl RNase-freies Wasser. Der Filter sterilisiert den Puffer durch einen 0,2 μm Spritzenvorsatzfilter.
   HINWEIS: Der 2x AlkB-Reaktionspuffer muss aufgrund der chemischen Labilität der Komponenten unmittelbar vor jedem Versuch frisch hergestellt werden.
6. Bereiten Sie die AlkB-Verdauungsreaktion in einem sterilen PCR-Röhrchen vor, indem Sie 20 μl der Linker-1-ligierten RNAs (Produkte aus Schritt 2), 50 μl des 2x AlkB-Reaktionspuffers (hergestellt in Schritt 3.5), 2 μl AlkB-Demethylase, 1 μl RNase-Inhibitor und 27 μl RNase-freies Wasser hinzufügen.
7. 2 h bei Raumtemperatur inkubieren, um posttranskriptionelle Methylierungen von den RNAs zu entfernen.
8. Um AlkB aus der Reaktion zu entfernen, führen Sie die unten beschriebenen Schritte aus.
   1. Für eine saubere Phasentrennung geben Sie 50 μl RNase-freies Wasser in die AlkB-Reaktion und fügen Sie dann 100 μl Phenol: Chloroform: Isoamylalkohol 25:24:1 (pH = 5,2) hinzu.
   2. Mit der Hand 10 s schütteln und dann bei 16.000 x g 10 min zentrifugieren. Stellen Sie sicher, dass der Rotor der Tischzentrifuge mit den PCR-Röhrchen kompatibel ist. Verwenden Sie bei Bedarf Adapter.
   3. Übertragen Sie die RNAs (d. h. die wässrige Schicht oben; ca. 140 μl) in ein steriles 1,5-ml-Röhrchen. Wenn Chloroform (d. h. die untere Schicht) in die wässrige Schicht gemischt wird, wird erneut mit den gleichen Einstellungen zentrifugiert.
   4. Fügen Sie den extrahierten RNAs 100 μl Chloroform hinzu, um das restliche Phenol zu entfernen. Mit der Hand 10 s schütteln und dann bei 16.000 x g 10 min zentrifugieren.
   5. Übertragen Sie die RNAs (d. h. die wässrige Schicht oben; ca. 120 μl) in ein steriles 1,5-ml-Röhrchen.
9. Säulenreinigung der extrahierten RNAs. Verwenden Sie ein Kit für die DNA/RNA-Rückgewinnung und -Reinigung (siehe Materialtabelle). Befolgen Sie das in Schritt 2.3 beschriebene Protokoll, um die Säulenreinigung durchzuführen.

4. Entfernen von überschüssigem Linker 1

HINWEIS: Es wird empfohlen, ein Aliquot (1,2 μl) jeder Probe nach der Aufreinigung aufzubewahren. Bei Bedarf können diese Aliquoten zur Überprüfung der Effizienz des RecJf-Aufschlusses verwendet werden, indem ein kommerzieller Nukleinsäureanalysator betrieben wird. Fahren Sie mit den gereinigten Proben sofort fort, um die Transkription zu reversen.

1. Bereiten Sie die Totenylierungsreaktion in einem sterilen PCR-Röhrchen vor, indem Sie 15 μl Linker-1-ligierte RNAs (Produkte aus Schritt 3), 1 μl 40 U/μl RNase-Inhibitor, 2 μl 10x Kit-Puffer 2 (siehe Materialtabelle) und 2 μl 50 μl 5'-Totenylase hinzufügen.
2. 1 h bei 30 °C inkubieren, um das Adenin am 5'-Ende von Linker 1 zu entfernen. 2 μl 30 U/μl RecJf in die Totenylierungsreaktion geben.
3. 30 min bei 37 °C inkubieren, um überschüssigen Linker 1 zu verdauen. Geben Sie weitere 2 μl 30 U/μl RecJf in die Reaktion.
4. Inkubieren Sie 30 Minuten lang bei 37 °C, um den Verdau des überschüssigen Linkers 1 fortzusetzen, und dann 20 Minuten lang bei 65 °C, um das Enzym zu denaturieren.
5. Säulenreinigung der Linker-1-ligierten RNAs. Verwenden Sie ein Kit, das die Gelfiltrationstechnologie verwendet, um Farbstoffterminatoren aus Sequenzierungsreaktionen zu entfernen (siehe Materialtabelle), da es bei der Entfernung kurzer Reste (z. B. Oligonukleotide mit einer Länge von 2 bis 10 bp) wirksam ist. Befolgen Sie die unten beschriebenen Schritte zur Reinigung.
   1. Bereiten Sie die Gelfiltersäulen gemäß dem Protokoll des Herstellers vor. Setzen Sie eine Säule in ein steriles 1,5-ml-Röhrchen ein und beladen Sie die Säule mit 24 μl der Probe.
   2. Um die RNAs zu reinigen, zentrifugieren Sie 3 Minuten lang bei 800 x g und verwerfen Sie die Säule. Die gereinigten RNAs befinden sich im Eluenten.

5. Reverse Transkriptionsreaktion (RT)

HINWEIS: Der folgende RT-Reaktionsaufbau (siehe Materialtabelle) folgt dem Protokoll des Herstellers, mit geringfügigen Änderungen, um die AQRNA-seq-Kompatibilität zu ermöglichen.

1. Bereiten Sie die RT-Primer-Annealing-Reaktion in einem sterilen PCR-Röhrchen vor, indem Sie 24 μl Template-RNAs (Produkte aus Schritt 4), 1 μl 2 μM RT-Primer (Tabelle 1) und 1 μl dNTP (10 mM jeder Art von Nukleotiden) hinzufügen.
2. Inkubieren Sie 2 Minuten lang bei 80 °C, um RT-Primer an den Template-RNAs zu glühen, und kühlen Sie dann sofort 2 Minuten lang auf Eis ab.
3. Bereiten Sie die RT-Reaktion vor, indem Sie 6 μl 5x RT-Reaktionspuffer, 1 μl 40 U/μl RNase-Inhibitor und 1 μl reverse Transkriptase in das Annealing-Reaktionsröhrchen geben.
4. Inkubieren Sie 2 Stunden lang bei 50 °C, um die RNA-Templates umzuschreiben, und dann 15 Minuten lang bei 70 °C, um das Enzym zu inaktivieren. Die RT-Produkte (d. h. RNA-cDNA-Hybride) können über Nacht bei 4 °C oder -20 °C gelagert werden.

6. RNA-Hydrolyse

1. Geben Sie 1 μl 5 M NaOH in den RNA-cDNA-Hybrid (Produkte aus Schritt 5). 3 Minuten lang bei 93 °C inkubieren, um den RNA-Strang des RNA-cDNA-Hybrids zu hydrolysieren.
2. Fügen Sie 0,77 μl 5 M HCl hinzu, um die Reaktion zu neutralisieren. Nachdem Sie HCl hinzugefügt haben, schnippen Sie zum Mischen und drehen Sie die Röhre nach unten. Die Neutralisation erfolgt sofort.
   HINWEIS: Es wird empfohlen, die genaue Menge von 5 M HCl, die für die Neutralisation von 1 μl NaOH erforderlich ist (z. B. mit pH-Streifen), unter gepufferten Bedingungen zu testen.
3. Säulenreinigung der einzelsträngigen cDNAs. Verwenden Sie ein Kit für die DNA/RNA-Rückgewinnung und -Reinigung (siehe Materialtabelle). Befolgen Sie das in Schritt 2.3 beschriebene Protokoll, um die Säulenreinigung durchzuführen.
   HINWEIS: Kits, die eine Gelfiltrationstechnologie verwenden, um Farbstoffterminatoren aus Sequenzierungsreaktionen zu entfernen (siehe Materialtabelle), können hier aufgrund der pH-Variation in den vorherigen Schritten nicht verwendet werden.
4. Beschleunigen Sie die gereinigten cDNAs auf < 5 μl und fügen Sie dann RNasefreies Wasser hinzu, um das Volumen wieder auf 5 μl zu bringen. Achten Sie darauf, die cDNAs nicht bis zur vollständigen Trockenheit zu völliger Trockenheit zu völlig zu verfassen
5. Übertragen Sie die aufgereinigten cDNAs in ein steriles PCR-Röhrchen. Die aufgereinigten cDNAs können bis zu 1 Woche bei -20 °C gelagert werden.

7. Ligation von Linker 2 bis zum 3'-Ende von cDNAs

1. Bereiten Sie die Linker-2-Ligationsreaktion in einem sterilen PCR-Röhrchen vor, indem Sie 5 μl cDNAs (Produkte aus Schritt 6), 1 μl 50 μM Linker 2 (Tabelle 1), 2 μl 10x T4-DNA-Ligase-Reaktionspuffer, 1 μl 10 mM ATP, 9 μl PEG8000 (50%ige Lösung) und 2 μl 400 μl T4-DNA-Ligase hinzufügen.
   HINWEIS: Reagenzien können zu Mastermixen verarbeitet werden, um die Verarbeitung der Proben zu erleichtern. Nehmen Sie keine PEG8000 und T4-DNA-Ligase in den Mastermix auf.
2. Inkubieren Sie 16 Stunden lang bei 16 °C, um Linker 2 an die cDNAs zu ligieren.
3. Säulenreinigung der Linker-2-ligierten cDNAs. Verwenden Sie ein Kit für die DNA/RNA-Rückgewinnung und -Reinigung (siehe Materialtabelle). Befolgen Sie das in Schritt 2.3 beschriebene Protokoll, um die Säulenreinigung durchzuführen.

8. Entfernen von überschüssigem Linker 2

1. Bereiten Sie die Deadenylierungsreaktion in einem sterilen PCR-Röhrchen vor, indem Sie 16 μl Linker-2-ligierte cDNAs, 2 μl 10x Kit-Puffer 2 und 2 μl 50 U/μl 5'-Deadenylase hinzufügen. Inkubieren Sie 1 h lang bei 30 °C, um das Adenin am 5'-Ende von Linker 2 zu entfernen.
2. 2 μl 30 U/μl RecJf in die Totenylierungsreaktion geben. 30 min bei 37 °C inkubieren, um überschüssigen Linker 2 zu verdauen. Geben Sie weitere 2 μl 30 U/μl RecJf in die Reaktion.
3. Inkubieren Sie 30 Minuten lang bei 37 °C, um den Verdau des überschüssigen Linkers 2 fortzusetzen, und dann 20 Minuten lang bei 65 °C, um das Enzym zu denaturieren.

9. PCR-Amplifikation der cDNAs mit Sequenzierungsprimern

1. Weisen Sie den Proben PCR-Primer zu. Jede Probe benötigt eine einzigartige Kombination aus Vorwärts- und Rückwärtsprimern (Tabelle 1) für ein effektives Multiplexing.
2. Fügen Sie RNase-freies Wasser hinzu, um das Probenvolumen auf 25 μl zu bringen. Speichern Sie 5 μl jeder Probe in einem sterilen PCR-Röhrchen als Backup für den Fall, dass die PCR wiederholt werden muss.
3. Bereiten Sie die PCR-Reaktion vor (siehe Materialtabelle für das PCR-Kit), indem Sie 20 μl cDNAs (Produkte aus Schritt 8), 1 μl 2,5 μM Forward-Primer, 1 μl 2,5 μM Reverse-Primer, 25 μl 2x DNA-Polymerase-Puffer, 2 μl RNase-freies Wasser und 1 μl DNA-Polymerase hinzufügen.
   HINWEIS: Reagenzien können zu Mastermixen verarbeitet werden, um die Verarbeitung der Proben zu erleichtern. Fügen Sie dem Mastermix keine DNA-Polymerase hinzu.
4. PCR mit einer anfänglichen Denaturierung bei 94 °C für 1 min, gefolgt von 18 Denaturierungszyklen bei 98 °C für 20 s - Glühen bei 58 °C für 20 s - Verlängerung bei 68 °C für 1 min.
   HINWEIS: Amplifizieren Sie nicht über den linearen Bereich hinaus. Insgesamt 18 Zyklen sind für die meisten Experimente optimal, dies kann jedoch kontextabhängig sein.
5. Erhitzen Sie die PCR-Produkte auf weniger als 25 μl und fügen Sie dann RNase-freies Wasser hinzu, um das Volumen wieder auf 25 μl zu bringen. Übertragen Sie 5 μl der PCR-Produkte in ein steriles 0,5-ml-Röhrchen, um die Größenverteilung zu überprüfen (siehe Schritt 9.6). Lagern Sie die restlichen 20 μL der PCR-Produkte bis zu weiteren Schritten bei -20 °C.
6. Überprüfen Sie die Größenverteilung der PCR-Produkte wie unten beschrieben.
   1. Bereiten Sie 3% Agarose-Gel in TAE-Puffer vor.
      HINWEIS: In diesem Protokoll wird Ethidiumbromid (EtBr) für die Färbung von Gelen nach der Elektrophorese verwendet (siehe Schritt 9.6.5). Geeignete DNA-Färbungen können in diesem Schritt in die Gellösung gegeben oder später für die Gelfärbung verwendet werden.
   2. Mischen Sie 1 μl 6x Ladefarbstoff in 5 μl PCR-Produkte (aus Schritt 9.5) und beladen Sie das Gel mit der Mischung.
   3. Laden Sie 5 μl DNA-Leitern in die Vertiefung vor der ersten Probe und in die Vertiefung nach der letzten Probe. Verwenden Sie 50 bp oder 100 bp DNA-Leitern, um eine verbesserte Größenunterscheidung von PCR-Produkten zwischen 150 bp und 300 bp zu ermöglichen.
   4. Führen Sie eine Gelelektrophorese durch, um die PCR-Produkte zu lokalisieren. Die geeignete Ausführungsbedingung kann kontextabhängig sein. Hier wird eine Gelplatte mit 17,78 cm (Breite) x 10,16 cm (Höhe) x 1 cm (Dicke) mit 120 V, 400 mA 75 min lang betrieben.
   5. Legen Sie das Gel in eine Schachtel und füllen Sie die Schachtel mit deionisiertem (DI) Wasser, bis das Gel vollständig eingetaucht ist. Geben Sie 10 μl EtBr in das DI-Wasser und tränken Sie das Gel. Wickeln Sie die Schachtel mit Folie ein und stellen Sie sie auf einen Shaker. Färben Sie das Gel 30 Minuten lang unter Schütteln.
   6. Entsorgen Sie den EtBr-haltigen Abfall in eine Abfallflasche, die sich in einem Abzug befindet. Spülen Sie das Gel einmal mit DI-Wasser ab und entsorgen Sie das EtBr-haltige Wasser in die Abfallflasche.
   7. Füllen Sie die Schachtel mit DI-Wasser, bis das Gel vollständig eingetaucht ist. Wickeln Sie die Schachtel mit Folie ein und stellen Sie sie auf einen Shaker. Waschen Sie das Gel 10 Minuten lang unter Schütteln.
   8. Entsorgen Sie das EtBr-haltige Wasser in der Abfallflasche im Abzug. Verwenden Sie einen Gel-Imager, um die Bänder zu visualisieren. Nehmen Sie ein hochauflösendes Bild des Gels auf.

10. Gel-Reinigung

1. Bereiten Sie 3% Agarose-Gel in TAE-Puffer vor. Stellen Sie mit breiten Kämmen (1 mm Dicke; 5 mm Breite; 15 mm Tiefe) ein Gel mit einer Dicke von 1 cm her, so dass jede Vertiefung mindestens 25 μl der Probenlade-Farbstoffmischung enthalten kann.
2. Mischen Sie 4 μL 6x Ladefarbstoff mit 20 μl PCR-Produkten (aus Schritt 9.5) und beladen Sie das Gel mit der Mischung. Lassen Sie leere Fahrspuren zwischen den Proben, um Kreuzkontaminationen während der Gelexzision zu minimieren.
3. Laden Sie DNA-Leitern, führen Sie eine Gelelektrophorese durch, färben und waschen Sie das Gel und nehmen Sie Gelbilder auf, wie in Schritt 9.6 beschrieben.
4. Excise die Gelblöcke, die PCR-Produkte innerhalb des Zielgrößenbereichs enthalten. Um die Kontamination mit Primer-Dimeren (175 bp-Linker ohne Inserts) zu minimieren, extrahieren Sie PCR-Produkte mit einer Größe über 195 bp (175 bp-Linker + 20 bp miRNAs).
5. Reinigen Sie die PCR-Produkte durch Gelextraktion. Verwenden Sie ein Gel-Extraktionskit (siehe Materialtabelle). Das Aufreinigungsprotokoll basiert auf dem Protokoll des Herstellers, mit geringfügigen Änderungen für die AQRNA-seq-Kompatibilität. Alle Zentrifugationsschritte sollten bei 17.900 x g für 1 min mit einer Tischzentrifuge bei Raumtemperatur durchgeführt werden, sofern nicht anders angegeben. Führen Sie die unten beschriebenen Schritte aus.
   1. Messen Sie das Gewicht der Gelblöcke in den Tuben. Fügen Sie 6 Volumen Buffer QG (im Kit enthalten) zu 1 Volumen des Gelblocks hinzu (1 mg Gel entspricht ca. 1 μl).
   2. Inkubieren Sie bei 50 °C für 10 min oder bis zur vollständigen Auflösung der Gelblöcke. Vortex-Röhrchen alle 2 Minuten, um die Auflösung des Gels zu erleichtern. Nach dem Auflösen des Gels sollte die Mischung der Farbe des Buffer QG ohne das gelöste Gel ähneln. Wenn die Farbe orange oder violett ist, 10 μl 3 M Natriumacetat (pH = 5,0) hinzufügen und gründlich mischen.
   3. Geben Sie 1 Gelvolumen Isopropanol in die Mischung und mischen Sie sie gründlich. Legen Sie eine Spin-Säule in ein 2-ml-Sammelröhrchen (im Kit enthalten).
   4. Um DNA zu binden, geben Sie die Probe (jeweils bis zu 750 μl) auf die Säule und zentrifugieren Sie. Entsorgen Sie den Durchfluss und setzen Sie die Säule wieder in dasselbe Auffangröhrchen ein. Die maximale Menge an Gel pro Spin-Säule beträgt 400 mg.
   5. Geben Sie 500 μl Puffer QG in die Säule und zentrifugieren Sie. Entsorgen Sie den Durchfluss und setzen Sie die Säule wieder in dasselbe Auffangröhrchen ein.
   6. Um die Verunreinigungen zu waschen, geben Sie 750 μl Buffer PE (im Kit enthalten) in die Säule, lassen Sie die Säule 5 Minuten stehen und zentrifugieren Sie. Entsorgen Sie den Durchfluss und setzen Sie die Säule wieder in dasselbe Auffangröhrchen ein. Zentrifugieren Sie erneut, um den restlichen Waschpuffer zu entfernen.
   7. Legen Sie die Säule in ein steriles 1,5-ml-Röhrchen. Um DNA zu eluieren, geben Sie 30 μl Puffer EB (im Kit enthalten) in die Mitte der Säulenmembran, lassen Sie die Säule 4 Minuten stehen und zentrifugieren Sie.
   8. Die gelgereinigten PCR-Produkte werden in 12 μl Puffer EB beschleunigt und resuspendiert.
6. Messen Sie die Konzentration der konstruierten Bibliotheken durch UV-sichtbare Spektrophotometrie und/oder fluorometrische Quantifizierung.

11. Sequenzierung von Bibliotheken

1. Senden Sie die konstruierten Bibliotheken an ein externes Sequenzierungszentrum zur Qualitätsbewertung und Illumina-Sequenzierung. Um eine ausreichende Empfindlichkeit bei der quantitativen Kartierung kleiner RNA-Landschaften zu gewährleisten, entscheiden Sie sich für eine Paired-End-Sequenzierung mit 75-bp-Reads aus jeder Richtung (d. h. PE75) mit dem Ziel von mindestens 1,5 Mio. Rohsequenz-Reads in jede Richtung für jede Probe. Verwenden Sie benutzerdefinierte Primer (Tabelle 1) für die NextSeq-Sequenzierung, dies ist jedoch optional für die Sequenzierung auf MiSeq.
   HINWEIS: Die Sequenzierung kann mit den Plattformen MiSeq oder NextSeq500 durchgeführt werden. Die Wahl der Plattform kann von der Art der Proben und der Gesamtzahl der Proben abhängen.

12. Pipeline für Datenanalysen

HINWEIS: Abbildung 2 zeigt eine grafische Darstellung vereinfachter Verfahren in der Datenanalyse-Pipeline, die Rohsequenz-Lesevorgänge (im FASTQ-Format) als Eingabe verwendet und eine Abundanzmatrix mit Zeilen generiert, die Mitglieder kleiner RNA-Spezies von Interesse darstellen, und Spalten, die Proben darstellen. Bei der Paired-End-Sequenzierung entspricht jede Probe zwei FASTQ-Dateien, eine für die Forward-Reads und die andere für die Reverse-Reads. Die komplette Data Analytics Pipeline mit allen zugehörigen Skripten und einem Handbuch mit umfangreichen Anmerkungen zu jedem Schritt ist auf GitHub (https://github.com/Chenrx9293/AQRNA-seq-JoVE.git) verfügbar.

1. Rufen Sie Rohsequenz-Reads aus dem externen Sequenzierungszentrum ab und bewerten Sie die Sequenzierungsqualität mit Open-Source-Programmen wie FastQC¹⁴ oder fastp¹⁵.
2. Erstellen Sie eine Referenzsequenzbibliothek im FASTA-Format.
   HINWEIS: Der Schlüssel zur Anpassungsfähigkeit der Pipeline an verschiedene kleine RNA-Klassen ist eine geeignete Referenzsequenzbibliothek. Um genaue Abundanzschätzungen von Mitgliedern bestimmter RNA-Klassen von Interesse (z. B. miRNA) zu erreichen, wird von den Benutzern erwartet, dass sie eine Referenzsequenzbibliothek für die Verwendung mit der Pipeline sorgfältig kuratieren. Alle anderen Anweisungen für die Pipeline-Ausführung bleiben über verschiedene kleine RNA-Klassen hinweg konsistent.
3. Erstellen Sie ein Verzeichnis mit dem Namen AQRNA-seq für die Implementierung der Datenanalysepipeline, und platzieren Sie alle Skripts, qualitätsgefilterten Sequenzlesevorgänge und die Referenzsequenzbibliothek in diesem Verzeichnis. Befolgen Sie die detaillierten Anweisungen auf GitHub (https://github.com/Chenrx9293/AQRNA-seq-JoVE.git), um Unterverzeichnisse vorzubereiten und wesentliche Änderungen an den Dateien vorzunehmen, die auf verschiedene Organismen und/oder kleine RNA-Spezies abzielen, sowie die Kompatibilität des Betriebssystems und/oder des Job-Schedulers.
4. Implementieren Sie die Datenanalyse-Pipeline gemäß den Schritten, die im Handbuch auf GitHub (https://github.com/Chenrx9293/AQRNA-seq-JoVE.git) beschrieben sind, das Beschreibungen, Eingabe- und Ausgabedateien sowie Befehlszeilen für jeden Schritt enthält. Zusammenfassend lässt sich sagen, dass die Pipeline (i) das Trimmen von Linkersequenzen und zufälligen Nukleotiden aus den Reads, (ii) das Filtern von Reads basierend auf ihrer Länge, (iii) das Mapping der Reads auf die Referenzsequenzen, (iv) das Auflösen mehrdeutiger Mappings und (v) das Generieren der Häufigkeitsmatrix umfasst.

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Ergebnisse

Mycobacterium bovis BCG (bacilli de Calmette et Guérin) Stamm 1173P2, die exponentiell wuchsen, wurden einer Zeitreihe (0, 4, 10 und 20 Tage) von Nährstoffmangel unterzogen, gefolgt von einer 6-tägigen Wiederbelebung in nährstoffreichem Medium, wie zuvor in Hu et ^al.7 beschrieben. Kleine RNAs wurden aus Bakterienkulturen mit drei biologischen Replikaten zu jedem der fünf festgelegten Zeitpunkte isoliert. Die Illumina-Bibliotheken wurden unter Verwendung des oben beschriebenen AQRNA-s...

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Diskussion

Der Arbeitsablauf zur Vorbereitung der AQRNA-seq-Bibliothek wurde entwickelt, um die Erfassung von RNAs in einer Probe zu maximieren und den Polymeraseabfall während der reversen Transkription^{zu minimieren 7}. Durch eine zweistufige Linker-Ligation werden neuartige DNA-Oligos (Linker 1 und Linker 2) im Überschuss ligiert, um die RNA in der Probe vollständig zu ergänzen. Überschüssige Linker können effizient mit RecJf, einer 5'- bis 3'-Exonuklease, die für einzelsträngige DNAs spezifisch is...

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Materialien

Name	Company	Catalog Number	Comments
2-ketoglutarate	Sigma-Aldrich	75890	Prepare a working solution (1 M) and store it at -20ºC
2100 Bioanalyzer Instrument	Agilent	G2938C
Adenosine 5'-Triphosphate (ATP)	New England Biolabs	M0437M (component #: N0437AVIAL)	NEB M0437M contains T4 RNA Ligase 1 (30 U/μL), T4 RNA Ligase Reaction Buffer (10X), PEG 8000 (1X), and ATP (100 mM); prepare a working solution (10 mM) and store it at -20ºC
AGAROSE GPG/LE	AmericanBio	AB00972-00500	Store at ambient temperature
Ammonium iron(II) sulfate hexahydrate	Sigma-Aldrich	F2262	Prepare a working solution (0.25 M) and store it at -20 °C
Bioanalyzer Small RNA Analysis	Agilent	5067-1548	The Small RNA Analysis is used for checking the quality of input RNAs and the efficiency of enzymatic reactions (e.g., Linker 1 ligation)
Bovine Serum Albumin (BSA; 10 mg/mL)	New England Biolabs	B9000	This product was discontinued on 12/15/2022 and is replaced with Recombinant Albumin, Molecular Biology Grade (NEB B9200).
Chloroform	Macron Fine Chemicals	4441-10
Demethylase	ArrayStar	AS-FS-004	Demethylase comes with the rtStar tRNA Pretreatment & First-Strand cDNA Synthesis Kit (AS-FS-004)
Deoxynucleotide (dNTP) Solution Mix	New England Biolabs	N0447L (component #: N0447LVIAL)	This dNTP Solution Mix contains equimolar concentrations of dATP, dCTP, dGTP and dTTP (10 mM each)
Digital Dual Heat Block	VWR Scientific Products	13259-052	Heating block is used with the QIAquick Gel Extraction Kit
DyeEx 2.0 Spin Kit	Qiagen	63204	Effective at removing short remnants (e.g., oligos less than 10 bp in length)
Electrophoresis Power Supply	Bio-Rad Labrotories	PowerPac 300
Eppendorf PCR Tubes (0.5 mL)	Eppendorf	0030124537
Eppendorf Safe-Lock Tubes (0.5 mL)	Eppendorf	022363611
Eppendorf Safe-Lock Tubes (1.5 mL)	Eppendorf	022363204
Eppendorf Safe-Lock Tubes (2 mL)	Eppendorf	022363352
Ethyl alcohol (Ethanol), Pure	Sigma-Aldrich	E7023	The pure ethanol is used with the Oligo Clean and Concentrator Kit from Zymo Research
Gel Imaging System	Alpha Innotech	FluorChem 8900
Gel Loading Dye, Purple (6X), no SDS	New England Biolabs	N0556S (component #: B7025SVIAL)	NEB N0556S contains Quick-Load Purple 50 bp DNA Ladder and Gel Loading Dye, Purple (6X), no SDS
GENESYS 180 UV-Vis Spectrophotometer	Thermo Fisher Scientific	840-309000	The spectrophotometer is used for measuring the oligo concentrations using the Beer's law
HEPES	Sigma-Aldrich	H4034	Prepare a working solution (1 M; pH = 8 with NaOH) and store it at -20 °C
Hydrochloric acid (HCl)	VWR Scientific Products	BDH3028	Prepare a working solution (5 M) and store it at ambient temperature
Isopropyl Alcohol (Isopropanol), Pure	Macron Fine Chemicals	3032-16	Isopropanol is used with the QIAquick Gel Extraction Kit
L-Ascorbic acid	Sigma-Aldrich	A5960	Prepare a working solution (0.5 M) and store it at -20ºC
Microcentrifuge	Eppendorf	5415D
NanoDrop 2000 Spectrophotometer	Thermo Fisher Scientific	ND-2000
NEBuffer 2 (10X)	New England Biolabs	M0264L (component #: B7002SVIAL)	NEB M0264L contains RecJf (30 U/μL) and NEBuffer 2 (10X); store at -20 °C
Nuclease-Free Water (not DEPC-Treated)	Thermo Fisher Scientific	AM9938
Oligo Clean & Concentrator Kit	Zymo Research	D4061	Store at ambient temperature
PEG 8000 (50% solution)	New England Biolabs	M0437M (component #: B1004SVIAL)	NEB M0437M contains T4 RNA Ligase 1 (30 U/μL), T4 RNA Ligase Reaction Buffer (10X), PEG 8000 (1X), and ATP (100 mM); prepare a working solution (10 mM) and store it at -20ºC
Peltier Thermal Cycler	MJ Research	PTC-200
Phenol:choloroform:isoamyl alcohol 25:24:1 pH = 5.2	Thermo Fisher Scientific	J62336
PrimeScript Buffer (5X)	TaKaRa	2680A
PrimeScript Reverse Transcriptase	TaKaRa	2680A
QIAquick Gel Extraction Kit	Qiagen	28704	This kit requires a heating block and isopropanol to work with
Quick-Load Purple 100 bp DNA Ladder	New England Biolabs	N0551S (component #: N0551SVIAL)
Quick-Load Purple 50 bp DNA Ladder	New England Biolabs	N0556S (component #: N0556SVIAL)	NEB N0556S contains Quick-Load Purple 50 bp DNA Ladder and Gel Loading Dye, Purple (6X), no SDS
RecJf (30 U/μL)	New England Biolabs	M0264L (component #: M0264LVIAL)	NEB M0264L contains RecJf (30 U/μL) and NEBuffer 2 (10X); store at -20 °C
RNase Inhibitor (murine; 40 U/μL)	New England Biolabs	M0314L (component #: M0314LVIAL)	Store at -20 °C
SeqAMP DNA Polymerase	TaKaRa	638509	TaKaRa 638509 contains SeqAMP DNA Polymerase and SeqAMP PCR Buffer (2X)
SeqAMP PCR Buffer (2X)	TaKaRa	638509	TaKaRa 638509 contains SeqAMP DNA Polymerase and SeqAMP PCR Buffer (2X)
Shrimp Alkaline Phosphatase (1 U/μL)	New England Biolabs	M0371L (component #: M0371LVIAL)
Sodium hydroxide (NaOH)	Sigma-Aldrich	S5881	Prepare a working solution (5 M) and store it at ambient temperature
T4 DNA Ligase (400 U/μL)	New England Biolabs	M0202L (component #: M0202LVIAL)	NEB M0202L contains T4 DNA Ligase (400 U/μL) and T4 DNA Ligase Reaction Buffer (10X)
T4 DNA Ligase Reaction Buffer (10X)	New England Biolabs	M0202L (component #: B0202SVIAL)	NEB M0202L contains T4 DNA Ligase (400 U/μL) and T4 DNA Ligase Reaction Buffer (10X)
T4 RNA Ligase 1 (30 U/μL)	New England Biolabs	M0437M (component #: M0437MVIAL)	NEB M0437M contains T4 RNA Ligase 1 (30 U/μL), T4 RNA Ligase Reaction Buffer (10X), PEG 8000 (1X), and ATP (100 mM)
T4 RNA Ligase Reaction Buffer (10X)	New England Biolabs	M0437M (component #: B0216SVIAL)	NEB M0437M contains T4 RNA Ligase 1 (30 U/μL), T4 RNA Ligase Reaction Buffer (10X), PEG 8000 (1X), and ATP (100 mM)