A subscription to JoVE is required to view this content. Sign in or start your free trial.

In This Article

  • Summary
  • Abstract
  • Introduction
  • Protocol
  • תוצאות
  • Discussion
  • Disclosures
  • Acknowledgements
  • Materials
  • References
  • Reprints and Permissions

Summary

ריצוף RNA לכימות מוחלט (AQRNA-seq) היא טכנולוגיה שפותחה כדי לכמת את הנוף של כל הרנ"א הקטן בתערובות ביולוגיות. כאן, הן שלבי הכנת הספרייה והן שלבי עיבוד הנתונים של AQRNA-seq מודגמים, המכמתים שינויים במאגר RNA העברה (tRNA) ב- Mycobacterium bovis BCG במהלך תרדמה הנגרמת מרעב.

Abstract

AQRNA-seq מספק קשר ליניארי ישיר בין ריצוף ספירות קריאה לבין מספרי העתקי RNA קטנים בדגימה ביולוגית, ובכך מאפשר כימות מדויק של מאגר הרנ"א הקטן. הליך הכנת ספריית AQRNA-seq המתואר כאן כולל שימוש במקשרי ריצוף שתוכננו בהתאמה אישית וצעד להפחתת שינויי RNA מתילציה החוסמים את תהליך השעתוק ההפוך, מה שמביא לתפוקה מוגברת של cDNA באורך מלא. בנוסף, מוצג יישום מפורט של צנרת הביואינפורמטיקה הנלווית. הדגמה זו של AQRNA-seq נערכה באמצעות ניתוח כמותי של 45 tRNAs ב- Mycobacterium bovis BCG שנקטפו ב -5 ימים נבחרים במהלך זמן של 20 יום של מחסור בחומרים מזינים ו -6 ימי החייאה. מאמצים מתמשכים לשיפור היעילות והקפדנות של AQRNA-seq יידונו גם כאן. זה כולל בחינת שיטות למייתר טיהור ג'ל להקלה על בעיות דימר פריימר לאחר הגברת PCR ולהגדיל את שיעור הקריאות באורך מלא כדי לאפשר מיפוי קריאה מדויק יותר. שיפורים עתידיים ב-AQRNA-seq יתמקדו בהקלה על אוטומציה ויישום בתפוקה גבוהה של טכנולוגיה זו לכימות כל מיני הרנ"א הקטנים בדגימות תאים ורקמות מאורגניזמים מגוונים.

Introduction

ריצוף הדור הבא (באנגלית: Next generation sequencing או בקיצור NGS) היא טכנולוגיית ריצוף DNA הכוללת פיצול DNA, קשירת אוליגונוקלאוטידים מתאמים, הגברה מבוססת תגובת שרשרת פולימראז (PCR), ריצוף הדנ"א והרכבה מחדש של רצפי המקטעים לגנום. ההתאמה של NGS לרצף RNA (RNA-seq) היא גישה רבת עוצמה לזיהוי וכימות תעתיקי RNA וגרסאותיהם1. התפתחויות חדשניות בתהליכי עבודה של הכנת ספריות RNA וצינורות ניתוח ביואינפורמטיקה, יחד עם התקדמות במכשור מעבדתי, הרחיבו את הרפרטואר של יישומי RNA-seq, והתקדמו מעבר לריצוף אקסומי לאומיקה פונקציונלית מתקדמת כמו פרופיל RNA לא מקודד2, אנליזה של תא בודד3, תעתיק מרחבי 4,5

Protocol

הערה: איור 1 מספק המחשה גרפית של ההליכים הכרוכים בהכנת ספריית AQRNA-seq. מידע מפורט לגבי ריאגנטים, כימיקלים ועמודות/ערכות המשמשים בהליך ניתן למצוא בטבלת החומרים. מומלץ לבצע הערכה מקיפה של טוהר, שלמות וכמות דגימות RNA קלט באמצעות (i) אלקטרופורזה ג'ל אגרוז 3%, (ii) כלי אלקטרופורזה אוטומטיים לבקרת איכות הדגימה של ביומולקולות (ראה טבלת חומרים), ו- (iii) ספקטרופוטומטריה UV-Visible ו / או כימות פלואורומטרי. חובה לשמור את כל התגובות ואת תערובות המאסטר על קרח, אלא אם כן צוין אחרת. שינוע ריאגנטים (למשל, אנזימים) בקופסאות קירור אל אחסון של -20°C וממנו כדי לשמור על חיי המדף שלהם ולהימנע ממחזורי הקפאה-הפשרה מרובים של....

תוצאות

מיקובקטריום בוביס זן BCG (bacilli de Calmette et Guérin) 1173P2 שעבר גדילה אקספוננציאלית היה נתון לסדרת זמן (0, 4, 10 ו-20 יום) של רעב תזונתי, ואחריו החייאה של 6 ימים בתווך עשיר בחומרים מזינים כפי שהוצג קודם לכן בהו ואחרים.7. רנ"א קטן בודד מתרבית חיידקים, עם שלושה העתקים ביולוגיים, בכל אחת מחמש נקו?.......

Discussion

תהליך העבודה להכנת ספריית AQRNA-seq נועד למקסם את לכידת הרנ"א בתוך דגימה ולמזער את נפילת הפולימראז במהלך שעתוק לאחור7. באמצעות קשירת מקשר דו-שלבית, אוליגוס DNA חדש (Linker 1 ו-Linker 2) נקשר בעודף כדי להשלים באופן מלא את ה-RNA שבתוך הדגימה. ניתן להסיר ביעילות קישורים עודפים באמצעות RecJf, אקסונוק.......

Disclosures

P.C.D. הוא ממציא של שני פטנטים (PCT/US2019/013714, US 2019/0284624 A1) הנוגעים לעבודה שפורסמה.

Acknowledgements

מחברי העבודה הנוכחית אסירי תודה למחברי המאמר המקורי המתאר את טכנולוגיית AQRNA-seq7. עבודה זו נתמכה על ידי מענקים מהמכונים הלאומיים לבריאות (ES002109, AG063341, ES031576, ES031529, ES026856) וקרן המחקר הלאומית של סינגפור באמצעות הברית סינגפור-MIT למחקר וטכנולוגיה עמידות מיקרוביאלית IRG.

....

Materials

NameCompanyCatalog NumberComments
2-ketoglutarate Sigma-Aldrich75890Prepare a working solution (1 M) and store it at -20ºC
2100 Bioanalyzer InstrumentAgilentG2938C
5'-deadenylase (50 U/μL) New England BiolabsM0331S (component #: M0331SVIAL)Store at -20 °C
Adenosine 5'-Triphosphate (ATP) New England BiolabsM0437M (component #: N0437AVIAL)NEB M0437M contains T4 RNA Ligase 1 (30 U/μL), T4 RNA Ligase Reaction Buffer (10X), PEG 8000 (1X), and ATP (100 mM); prepare a working solution (10 mM) and store it at -20ºC
AGAROSE GPG/LEAmericanBioAB00972-00500Store at ambient temperature
Ammonium iron(II) sulfate hexahydrateSigma-AldrichF2262Prepare a working solution (0.25 M) and store it at -20 °C
Bioanalyzer Small RNA AnalysisAgilent5067-1548 The Small RNA Analysis is used for checking the quality of input RNAs and the efficiency of enzymatic reactions (e.g., Linker 1 ligation)
Bovine Serum Albumin (BSA; 10 mg/mL) New England BiolabsB9000This product was discontinued on 12/15/2022 and is replaced with Recombinant Albumin, Molecular Biology Grade (NEB B9200).
Chloroform Macron Fine Chemicals4441-10
Demethylase ArrayStarAS-FS-004Demethylase comes with the rtStar tRNA Pretreatment & First-Strand cDNA Synthesis Kit (AS-FS-004)
Deoxynucleotide (dNTP) Solution MixNew England BiolabsN0447L (component #: N0447LVIAL)This dNTP Solution Mix contains equimolar concentrations of dATP, dCTP, dGTP and dTTP (10 mM each)
Digital Dual Heat BlockVWR Scientific Products13259-052Heating block is used with the QIAquick Gel Extraction Kit 
DyeEx 2.0 Spin Kit Qiagen63204 Effective at removing short remnants (e.g., oligos less than 10 bp in length)
Electrophoresis Power SupplyBio-Rad LabrotoriesPowerPac 300
Eppendorf PCR Tubes (0.5 mL)Eppendorf0030124537
Eppendorf Safe-Lock Tubes (0.5 mL)Eppendorf022363611
Eppendorf Safe-Lock Tubes (1.5 mL)Eppendorf022363204
Eppendorf Safe-Lock Tubes (2 mL)Eppendorf022363352
Ethyl alcohol (Ethanol), PureSigma-AldrichE7023 The pure ethanol is used with the Oligo Clean and Concentrator Kit from Zymo Research
Gel Imaging SystemAlpha InnotechFluorChem 8900
Gel Loading Dye, Purple (6X), no SDSNew England BiolabsN0556S (component #: B7025SVIAL)NEB N0556S contains Quick-Load Purple 50 bp DNA Ladder and Gel Loading Dye, Purple (6X), no SDS
GENESYS 180 UV-Vis SpectrophotometerThermo Fisher Scientific840-309000The spectrophotometer is used for measuring the oligo concentrations using the Beer's law
HEPESSigma-AldrichH4034Prepare a working solution (1 M; pH = 8 with NaOH) and store it at -20 °C
Hydrochloric acid (HCl) VWR Scientific ProductsBDH3028 Prepare a working solution (5 M) and store it at ambient temperature
Isopropyl Alcohol (Isopropanol), PureMacron Fine Chemicals3032-16Isopropanol is used with the QIAquick Gel Extraction Kit 
L-Ascorbic acidSigma-AldrichA5960Prepare a working solution (0.5 M) and store it at -20ºC
MicrocentrifugeEppendorf5415D
NanoDrop 2000 SpectrophotometerThermo Fisher ScientificND-2000
NEBuffer 2 (10X)New England BiolabsM0264L (component #: B7002SVIAL)NEB M0264L contains RecJf (30 U/μL) and NEBuffer 2 (10X); store at -20 °C
Nuclease-Free Water (not DEPC-Treated)Thermo Fisher ScientificAM9938 
Oligo Clean & Concentrator Kit Zymo ResearchD4061 Store at ambient temperature
PEG 8000 (50% solution) New England BiolabsM0437M (component #: B1004SVIAL)NEB M0437M contains T4 RNA Ligase 1 (30 U/μL), T4 RNA Ligase Reaction Buffer (10X), PEG 8000 (1X), and ATP (100 mM); prepare a working solution (10 mM) and store it at -20ºC
Peltier Thermal CyclerMJ ResearchPTC-200
Phenol:choloroform:isoamyl alcohol 25:24:1 pH = 5.2 Thermo Fisher ScientificJ62336 
PrimeScript Buffer (5X)TaKaRa2680A 
PrimeScript Reverse TranscriptaseTaKaRa2680A 
QIAquick Gel Extraction Kit Qiagen28704This kit requires a heating block and isopropanol to work with
Quick-Load Purple 100 bp DNA LadderNew England BiolabsN0551S (component #: N0551SVIAL)
Quick-Load Purple 50 bp DNA LadderNew England BiolabsN0556S (component #: N0556SVIAL)NEB N0556S contains Quick-Load Purple 50 bp DNA Ladder and Gel Loading Dye, Purple (6X), no SDS
RecJf (30 U/μL) New England BiolabsM0264L (component #: M0264LVIAL)NEB M0264L contains RecJf (30 U/μL) and NEBuffer 2 (10X); store at -20 °C
RNase Inhibitor (murine; 40 U/μL) New England BiolabsM0314L (component #: M0314LVIAL)Store at -20 °C
SeqAMP DNA Polymerase TaKaRa638509 TaKaRa 638509 contains SeqAMP DNA Polymerase and SeqAMP PCR Buffer (2X)
SeqAMP PCR Buffer (2X) TaKaRa638509 TaKaRa 638509 contains SeqAMP DNA Polymerase and SeqAMP PCR Buffer (2X)
Shrimp Alkaline Phosphatase (1 U/μL) New England BiolabsM0371L (component #: M0371LVIAL)
Sodium hydroxide (NaOH)Sigma-Aldrich S5881Prepare a working solution (5 M) and store it at ambient temperature
T4 DNA Ligase (400 U/μL) New England BiolabsM0202L (component #: M0202LVIAL)NEB M0202L contains T4 DNA Ligase (400 U/μL) and T4 DNA Ligase Reaction Buffer (10X)
T4 DNA Ligase Reaction Buffer (10X) New England BiolabsM0202L (component #: B0202SVIAL)NEB M0202L contains T4 DNA Ligase (400 U/μL) and T4 DNA Ligase Reaction Buffer (10X)
T4 RNA Ligase 1 (30 U/μL) New England BiolabsM0437M (component #: M0437MVIAL)NEB M0437M contains T4 RNA Ligase 1 (30 U/μL), T4 RNA Ligase Reaction Buffer (10X), PEG 8000 (1X), and ATP (100 mM)
T4 RNA Ligase Reaction Buffer (10X) New England BiolabsM0437M (component #: B0216SVIAL)NEB M0437M contains T4 RNA Ligase 1 (30 U/μL), T4 RNA Ligase Reaction Buffer (10X), PEG 8000 (1X), and ATP (100 mM)

References

  1. Byron, S. A., Van Keuren-Jensen, K. R., Engelthaler, D. M., Carpten, J. D., Craig, D. W. Translating RNA sequencing into clinical diagnostics: opportunities and challenges. Nat Rev Gen. 17 (5), 257-271 (2016).
  2. Grillone, K., et al.

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Explore More Articles

AQRNA seqRNARNATRNABCG

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Privacy

Terms of Use

Policies

Research

Education

ABOUT JoVE

Copyright © 2025 MyJoVE Corporation. All rights reserved