AQRNA-seq לכימות רנ"א קטן

Summary

ריצוף RNA לכימות מוחלט (AQRNA-seq) היא טכנולוגיה שפותחה כדי לכמת את הנוף של כל הרנ"א הקטן בתערובות ביולוגיות. כאן, הן שלבי הכנת הספרייה והן שלבי עיבוד הנתונים של AQRNA-seq מודגמים, המכמתים שינויים במאגר RNA העברה (tRNA) ב- Mycobacterium bovis BCG במהלך תרדמה הנגרמת מרעב.

Abstract

AQRNA-seq מספק קשר ליניארי ישיר בין ריצוף ספירות קריאה לבין מספרי העתקי RNA קטנים בדגימה ביולוגית, ובכך מאפשר כימות מדויק של מאגר הרנ"א הקטן. הליך הכנת ספריית AQRNA-seq המתואר כאן כולל שימוש במקשרי ריצוף שתוכננו בהתאמה אישית וצעד להפחתת שינויי RNA מתילציה החוסמים את תהליך השעתוק ההפוך, מה שמביא לתפוקה מוגברת של cDNA באורך מלא. בנוסף, מוצג יישום מפורט של צנרת הביואינפורמטיקה הנלווית. הדגמה זו של AQRNA-seq נערכה באמצעות ניתוח כמותי של 45 tRNAs ב- Mycobacterium bovis BCG שנקטפו ב -5 ימים נבחרים במהלך זמן של 20 יום של מחסור בחומרים מזינים ו -6 ימי החייאה. מאמצים מתמשכים לשיפור היעילות והקפדנות של AQRNA-seq יידונו גם כאן. זה כולל בחינת שיטות למייתר טיהור ג'ל להקלה על בעיות דימר פריימר לאחר הגברת PCR ולהגדיל את שיעור הקריאות באורך מלא כדי לאפשר מיפוי קריאה מדויק יותר. שיפורים עתידיים ב-AQRNA-seq יתמקדו בהקלה על אוטומציה ויישום בתפוקה גבוהה של טכנולוגיה זו לכימות כל מיני הרנ"א הקטנים בדגימות תאים ורקמות מאורגניזמים מגוונים.

Introduction

ריצוף הדור הבא (באנגלית: Next generation sequencing או בקיצור NGS) היא טכנולוגיית ריצוף DNA הכוללת פיצול DNA, קשירת אוליגונוקלאוטידים מתאמים, הגברה מבוססת תגובת שרשרת פולימראז (PCR), ריצוף הדנ"א והרכבה מחדש של רצפי המקטעים לגנום. ההתאמה של NGS לרצף RNA (RNA-seq) היא גישה רבת עוצמה לזיהוי וכימות תעתיקי RNA וגרסאותיהם¹. התפתחויות חדשניות בתהליכי עבודה של הכנת ספריות RNA וצינורות ניתוח ביואינפורמטיקה, יחד עם התקדמות במכשור מעבדתי, הרחיבו את הרפרטואר של יישומי RNA-seq, והתקדמו מעבר לריצוף אקסומי לאומיקה פונקציונלית מתקדמת כמו פרופיל RNA לא מקודד², אנליזה של תא בודד³, תעתיק מרחבי ^4,5, ניתוח שחבור חלופי⁶בין היתר., שיטות RNA-seq מתקדמות אלה חושפות תפקודי RNA מורכבים באמצעות ניתוח כמותי של השעתוק בתאים ורקמות נורמליים וחולים.

למרות התקדמות זו ב- RNA-seq, מספר תכונות טכניות מרכזיות מגבילות את הכוח הכמותי של השיטה. בעוד שרוב שיטות ה-RNA-seq מאפשרות כימות מדויק ומדויק של שינויים ברמות ה-RNAs בין משתני ניסוי (כלומר, דגימות ביולוגיות ו/או מצבים פיזיולוגיים), הן אינן יכולות לספק השוואה כמותית של רמות מולקולות ה-RNA בתוך דגימה. לדוגמה, רוב שיטות ה-RNA-seq אינן יכולות לכמת במדויק את המספר היחסי של עותקים של מולקולות איזו-מקובלות tRNA בודדות במאגר תאי של tRNA מבוטא. כפי שמודגש בפרסום הנלווה⁷, מגבלה זו ל-RNA-seq נובעת ממספר תכונות של מבנה הרנ"א והביוכימיה של הכנת ספריות. לדוגמה, פעילותם של אנזימי הקשירה המשמשים לחיבור מקשרי הריצוף מקצה 3' ו-5' למולקולות RNA מושפעת מאוד מזהות הנוקלאוטידים הסופיים של הרנ"א ומקשרי הריצוף. זה מוביל לשינויים גדולים ביעילות של קשירת המקשרים ולעלייה מלאכותית עמוקה ברצף קריאות ^8,9,10.

קבוצה שנייה של מגבלות נובעת מהתכונות המבניות הטבועות במולקולות RNA. באופן ספציפי, היווצרות מבנה משני של RNA ושינויים דינמיים בעשרות שינויי RNA שלאחר שעתוק של האפיטרנסקריפטום יכולים לגרום לנפילה או מוטציה של פולימראז במהלך שעתוק הפוך. שגיאות אלה גורמות לסינתזה חלקית או קטועה של cDNA או לשינוי ברצף הרנ"א. בעוד שניתן לנצל את שתי התופעות הללו כדי למפות מבנים משניים או שינויים מסוימים, הן פוגעות בדיוק הכמותי של RNA-seq אם שלבי הכנת הספרייה הבאים נכשלים בלכידת cDNA קטוע או אם עיבוד נתונים זורק רצפים מוטנטים שאינם תואמים למערך נתוני ייחוס^11,12. יתר על כן, המגוון הכימי, האורך והמבני העצום של תעתיקי רנ"א, כמו גם היעדר כלים לשבר אחיד של רנ"א ארוך, מקטין את התחולה של רוב שיטות הרנ"א-seq על כל מיני הרנ"א¹³.

שיטת AQRNA-seq (ריצוף RNA לכימות מוחלט) פותחה כדי להסיר כמה מהאילוצים הטכניים והביולוגיים הללו המגבילים את הדיוק הכמותי⁷. על ידי מזעור הטיות תלויות רצף בלכידה, קשירה והגברה במהלך הכנת ספריית ריצוף RNA, AQRNA-seq משיג ליניאריות מעולה בהשוואה לשיטות אחרות, ומכמת במדויק 75% מספריית הייחוס של 963 miRNA בדיוק של פי 2. מתאם ליניארי זה של ריצוף, ספירת קריאה ושפע RNA נצפה גם בניתוח של מאגר אורך משתנה של תקני RNA אוליגונוקלאוטידים ובהתייחסות לשיטות אורתוגונליות כמו כתם צפוני. קביעת ליניאריות בין ריצוף ספירת הקריאה לבין שפע הרנ"א מאפשרת ל-AQRNA-seq להשיג כימות מדויק ומוחלט של כל מיני הרנ"א בדגימה.

להלן תיאור של הפרוטוקול עבור זרימת עבודה להכנת ספריית AQRNA-seq וצינור ניתוח הנתונים הנלווה במורד הזרם. השיטה יושמה כדי להבהיר את הדינמיקה של שפע tRNA במהלך תרדמה הנגרמת על ידי רעב ולאחר מכן החייאה במודל Mycobacterium bovis bacilli de Calmette et Guérin (BCG) של שחפת. הוצגו תוצאות להדמיה גישושית של נתוני הריצוף, יחד עם אשכולות וניתוחי ביטוי דיפרנציאליים שחשפו דפוסים ניתנים להבחנה בשפע tRNA הקשורים לפנוטיפים שונים.

Protocol

הערה: איור 1 מספק המחשה גרפית של ההליכים הכרוכים בהכנת ספריית AQRNA-seq. מידע מפורט לגבי ריאגנטים, כימיקלים ועמודות/ערכות המשמשים בהליך ניתן למצוא בטבלת החומרים. מומלץ לבצע הערכה מקיפה של טוהר, שלמות וכמות דגימות RNA קלט באמצעות (i) אלקטרופורזה ג'ל אגרוז 3%, (ii) כלי אלקטרופורזה אוטומטיים לבקרת איכות הדגימה של ביומולקולות (ראה טבלת חומרים), ו- (iii) ספקטרופוטומטריה UV-Visible ו / או כימות פלואורומטרי. חובה לשמור את כל התגובות ואת תערובות המאסטר על קרח, אלא אם כן צוין אחרת. שינוע ריאגנטים (למשל, אנזימים) בקופסאות קירור אל אחסון של -20°C וממנו כדי לשמור על חיי המדף שלהם ולהימנע ממחזורי הקפאה-הפשרה מרובים של מתווכי ספריות.

1. דה-פוספורילציה של RNA

הערה: הסרת 5'-פוספט (P; תורם) מונעת קשירה עצמית ל-3'-הידרוקסיל (OH; מקבל) של RNAs. המקשרים לא יעשו קשר עצמי מכיוון שקצה ה-3' שלהם שונה כך שיכלול דידאוקסיציטידין (לינקר 1) או ספייסר (לינקר 2). ניתן לקשור את המקשרים רק על ידי חיבור ה-5'-P שלהם ל-3'-OH של הרנ"א או cDNA.

1. הכן את תגובת הזרחן בצינור PCR סטרילי (למשל, 200 μL או 500 μL צינור) על ידי הוספת עד 2 μL של דגימת RNA, 0.5 μL של 40 U/μL מעכב RNase, 1 μL של 0.5 μM תקן פנימי (טבלה 1), 0.5 μL של 10x T4 RNA ligase מאגר תגובה, 1 μL של 1 U/μL שרימפס אלקליין phosphatase, ומים נטולי RNase מספיקים כדי להביא את הנפח הכולל ל -5 μL.
   הערה: עבור דגימות טיפוסיות, 75 ננוגרם של RNA (או בערך 2 pmol עבור RNA 80 nt) נחשב מספיק לכימות של RNA קטן באמצעות פרוטוקול זה.
2. יש לדגור בטמפרטורה של 37°C למשך 30 דקות כדי לדה-פוספורילט RNAs ולאחר מכן ב-65°C למשך 5 דקות כדי להשבית את האנזים ולנטרל את ה-RNAs. יש לשמור את הדגימות בטמפרטורה של 4°C למשך 10 דקות לפחות כדי למנוע רטיורה.

2. קשירת לינקר 1 עד קצה ה-3' של RNAs

1. הכן את תגובת הקשירה Linker 1 בצינור PCR סטרילי על ידי הוספת 5 μL של RNA dephosphorylated (מוצרים משלב 1), 0.5 μL של 40 U/μL מעכב RNase, 1 μL של 100 μM Linker 1 (טבלה 1), 3 μL של 10 mM ATP, 2.5 μL של 10x T4 RNA ligase מאגר תגובה, 15 μL של PEG8000 (50% פתרון), 2 μL של 30 U/μL T4 RNA ligase 1, ו-1 μL של מים נטולי RNase.
   הערה: ניתן להפוך ריאגנטים לתערובת מאסטר כדי להקל על עיבוד הדגימות. אין לכלול PEG8000 ו-T4 RNA ligase 1 בתערובת המאסטר.
2. יש לדגור ב-25°C למשך שעתיים ולאחר מכן ב-16°C למשך 16 שעות כדי לקשור את Linker 1 ל-RNAs.
3. לטהר את ה-RNA בעל ליגת Linker-1. השתמש בערכה לשחזור וניקוי DNA/RNA (ראה טבלת חומרים).
   הערה: פרוטוקול טיהור עמודות זה חל על כל טיהור העמודות הבאות באמצעות אותה ערכה. לא ניתן להשתמש כאן בערכות המשתמשות בטכנולוגיית סינון ג'ל כדי להסיר מסופי צבע מתגובות ריצוף (ראו טבלת חומרים), מכיוון PEG8000 אינו תואם למסנני הג'ל של ערכות כאלה. מומלץ לשמור aliquot (1.2 μL) של כל דגימה לאחר טיהור. במידת הצורך, aliquots אלה יכולים לשמש לבדיקת יעילות הקשירה על ידי הפעלת מנתח חומצת גרעין מסחרי. שמור את הדגימות המטוהרות הנותרות על קרח או בטמפרטורה של -20 מעלות צלזיוס עד לשלבים נוספים.
   1. לנפח הדגימה < 50 μL, הוסיפו מים נטולי RNase כדי להביא אותו ל-50 μL. הוסיפו 2 כרכים של חיץ הקישור של אוליגו (שסופק בערכה) לנפח אחד של הדגימה. הוסף 8 כרכים של 100% אתנול לנפח אחד של הדגימה.
   2. טען את הדגימה (עד 750 μL בכל פעם) לעמודה הממוקמת בתוך צינור איסוף של 2 מ"ל (מסופק בערכה). כדי לקשור רנ"א לעמודה, צנטריפוגה במהירות של 10,000 x גרם למשך 30 שניות ולהשליך את הזרימה (כלומר, את הנוזל בצינור האיסוף). החזירו את העמוד לצינור האיסוף.
   3. כדי לשטוף את הזיהומים מהעמודה, הוסף 750 μL של מאגר שטיפת ה- DNA (המסופק בערכה) לעמודה. צנטריפוגה ב 10,000 x גרם במשך 30 שניות ולבטל את הזרימה. החזירו את העמוד לצינור האיסוף.
   4. צנטריפוגה במהירות מרבית (למשל, 16,000 x גרם עבור מיקרו-צנטריפוגה על ספסל) למשך דקה אחת נוספת כדי להסיר שאריות של מאגר שטיפת DNA.
   5. כדי ללוטש את RNAs, בזהירות להעביר את העמודה לצינור סטרילי 1.5 מ"ל, להוסיף מים ללא RNase לעמודה. השתמש בנפח גדול יותר מהנדרש בעת פליטת הרנ"א כדי לקחת בחשבון אובדן נפח פוטנציאלי במהלך תהליך האלוציה. לדוגמה, אם 15 μL נדרש לשלב הבא, להוסיף 17 μL של מים נטולי RNase עבור elution. צנטריפוגה ב 10,000 x גרם במשך 30 שניות.

3. הסרת מתילציות שלאחר שעתוק על ידי AlkB demethylase

הערה: AlkB הוא אנזים חיידקי המסיר קבוצות מתיל מחלק מהנוקלאוטידים שעברו מתילציה, אך לא מכולם, בדנ"א וב-RNA. הסרה של מספר סוגים של ריבונוקלאוטידים מתילטיים ב-RNA מונעת נפילה של התעתיק ההפוך כדי לאפשר יותר קריאות באורך מלא וזיהוי של אתרי שינוי. שלב זה צריך להיות נשלט ב- pH נמוך כדי למנוע השפלה בלתי צפויה של RNAs.

1. הכינו תמיסת מלאי של 1 M 2-ketoglutarate על ידי המסת 1.4611 גרם של 2-ketoglutarate (146.11 גרם למטר) ב 10 מ"ל של מים נטולי RNase. סנן לעקר את התמיסה באמצעות מסנן מזרק 0.2 מיקרומטר. Aliquot את פתרון המניות לתוך 2 מ"ל צינורות סטריליים ולאחסן ב -20 ° C.
2. הכינו תמיסת מלאי של 0.5 M חומצה L-אסקורבית על ידי המסת 0.88 גרם של חומצה L-אסקורבית (176.12 גרם ל-M) ב-10 מ"ל מים נטולי RNase. סנן לעקר את התמיסה באמצעות מסנן מזרק 0.2 מיקרומטר. Aliquot את פתרון המניות לתוך 2 מ"ל צינורות סטריליים ולאחסן ב -20 ° C.
3. הכינו תמיסת מלאי של 0.25 M אמוניום ברזל סולפט hexahydrate על ידי המסת 0.9835 גרם של אמוניום ברזל סולפט hexahydrate (392.14 גרם לכל M) ב 10 מ"ל של מים ללא RNase. סנן לעקר את התמיסה באמצעות מסנן מזרק 0.2 מיקרומטר. Aliquot את פתרון המניות לתוך 2 מ"ל צינורות סטריליים ולאחסן ב -20 ° C.
4. הכינו תמיסת מלאי של 1 M HEPES על ידי המסת 2.383 גרם HEPES (238.30 גרם למטר) ב -10 מ"ל של מים נטולי RNase. התאם את רמת החומציות של התמיסה ל-8 באמצעות NaOH וסנן את התמיסה באמצעות מסנן מזרקים של 0.2 מיקרומטר. Aliquot את פתרון המניות לתוך 2 מ"ל צינורות סטריליים ולאחסן ב -20 ° C.
5. הכינו מאגר תגובה 2x AlkB. כדי לייצר 10 מ"ל של החיץ, לשלב 1.5 μL של 1 M 2-ketoglutarate (עשה בשלב 3.1), 80 μL של 0.5 M L-חומצה אסקורבית (עשה בשלב 3.2), 6 μL של 0.25 M אמוניום ברזל סולפט hexahydrate (עשה בשלב 3.3), 100 μL של 10 מ"ג / מ"ל BSA, 1000 μL של 1 M HEPES (עשה בשלב 3.4; להוסיף אחרון), ו-8812.5 מיקרוליטר מים נטולי RNase. סנן לעקר את המאגר באמצעות מסנן מזרק 0.2 מיקרומטר.
   הערה: יש להכין את חיץ התגובה 2x AlkB טרי מיד לפני כל ניסוי בשל היכולת הכימית של הרכיבים.
6. הכן את תגובת העיכול AlkB בצינור PCR סטרילי על ידי הוספת 20 μL של RNA Linker-1-ligated RNA (מוצרים משלב 2), 50 μL של 2x AlkB reaction buffer (מיוצר בשלב 3.5), 2 μL של AlkB demethylase, 1 μL של מעכב RNase, ו 27 μL של מים נטולי RNase.
7. יש לדגור בטמפרטורת החדר למשך שעתיים כדי להסיר מתילציות שלאחר שעתוק מהרנ"א.
8. כדי להסיר את AlkB מהתגובה, בצע את השלבים המתוארים להלן.
   1. להפרדת פאזה נקייה, הוסף 50 μL של מים נטולי RNase לתגובת AlkB, ולאחר מכן הוסף 100 μL פנול: כלורופורם: אלכוהול איזואמיל 25:24:1 (pH = 5.2).
   2. נער ביד במשך 10 שניות, ולאחר מכן צנטריפוגה ב 16,000 x גרם במשך 10 דקות. ודא כי הרוטור של צנטריפוגת הספסל תואם צינורות PCR. השתמש במתאמים במידת הצורך.
   3. מעבירים את הרנ"א (כלומר, השכבה המימית למעלה; בערך 140 μL) לתוך צינור סטרילי של 1.5 מ"ל. אם מערבבים כלורופורם (כלומר, השכבה התחתונה) לתוך השכבה המימית, הצנטריפוגה שוב עם אותן הגדרות.
   4. הוסף 100 μL של כלורופורם לרנ"א שחולץ כדי להסיר שאריות פנול. נער ביד במשך 10 שניות, ולאחר מכן צנטריפוגה ב 16,000 x גרם במשך 10 דקות.
   5. מעבירים את הרנ"א (כלומר, השכבה המימית למעלה; בערך 120 μL) לתוך צינור סטרילי של 1.5 מ"ל.
9. לטהר את הרנ"א שחולץ. השתמש בערכה לשחזור וניקוי DNA/RNA (ראה טבלת חומרים). בצע את הפרוטוקול המפורט בשלב 2.3 כדי לבצע את טיהור העמודות.

4. הסרת מקשר עודף 1

הערה: מומלץ לשמור aliquot (1.2 μL) של כל דגימה לאחר טיהור. במידת הצורך, aliquots אלה יכולים לשמש לבדיקת היעילות של עיכול RecJf על ידי הפעלת מנתח חומצות גרעין מסחרי. המשך עם הדגימות המטוהרות באופן מיידי כדי להפוך את התעתיק לאחור.

1. הכינו את תגובת ה-deadenylation בצינור PCR סטרילי על ידי הוספת 15 μL של RNA מסוג Linker-1-ligated RNA (מוצרים משלב 3), 1 μL של 40 U/μL RNase inhibitor, 2 μL של 10x kit buffer 2 (ראה טבלת חומרים), ו-2 μL של 50 U/μL 5'-deadenylase.
2. יש לדגור בטמפרטורה של 30°C למשך שעה אחת כדי להסיר את האדנין בקצה 5' של Linker 1. הוסף 2 μL של 30 U/μL RecJf לתגובת deadenylation.
3. יש לדגור בטמפרטורה של 37°C למשך 30 דקות כדי לעכל עודפי Linker 1. הוסף עוד 2 μL של 30 U/μL RecJf לתוך התגובה.
4. יש לדגור בטמפרטורה של 37°C למשך 30 דקות כדי להמשיך בעיכול של עודפי Linker 1 ולאחר מכן בטמפרטורה של 65°C למשך 20 דקות כדי לנטרל את האנזים.
5. לטהר את ה-RNA בעל ליגת Linker-1. השתמש בערכה המשתמשת בטכנולוגיית סינון ג'ל כדי להסיר טרמינטורים של צבע מתגובות ריצוף (ראה טבלת חומרים), מכיוון שהיא יעילה בהסרת שאריות קצרות (למשל, אוליגונוקלאוטידים באורך של 2 עד 10 bp). בצע את השלבים המתוארים להלן לטיהור.
   1. הכינו עמודות מסנן ג'ל בהתאם לפרוטוקול היצרן. מניחים עמודה לתוך צינור סטרילי של 1.5 מ"ל וטוענים את העמודה עם 24 μL של הדגימה.
   2. כדי לטהר את RNAs, צנטריפוגה ב 800 x גרם במשך 3 דקות ולהשליך את העמודה. הרנ"א המטוהר נמצא באלוונט.

5. תגובת שעתוק לאחור (RT)

הערה: הגדרת התגובה הבאה של RT (ראה טבלת חומרים) עוקבת אחר פרוטוקול היצרן, עם שינויים קלים כדי לאפשר תאימות AQRNA-seq.

1. הכינו את תגובת החישול של פריימר RT בצינור PCR סטרילי על ידי הוספת 24 μL של RNA תבנית (מוצרים משלב 4), 1 μL של פריימר RT 2 μM (טבלה 1), ו-1 μL של dNTP (10 מילימטר מכל סוג של נוקלאוטידים).
2. יש לדגור בטמפרטורה של 80°C למשך 2 דקות כדי לחבר פריימרים RT ל-RNA של התבנית, ולאחר מכן מצננים על קרח מיד למשך 2 דקות.
3. הכן את תגובת RT על ידי הוספת 6 μL של 5x RT reaction buffer, 1 μL של 40 U/μL RNase inhibitor, ו 1 μL של transcriptase הפוך לתוך צינור התגובה חישול.
4. יש לדגור ב-50°C למשך שעתיים כדי לתמלל לאחור את תבניות ה-RNA, ולאחר מכן ב-70°C למשך 15 דקות כדי להשבית את האנזים. מוצרי RT (כלומר, היברידים RNA-cDNA) ניתן לאחסן ב 4 ° C או -20 ° C במשך הלילה.

6. הידרוליזה RNA

1. הוסף 1 μL של 5 M NaOH להכלאה RNA-cDNA (מוצרים משלב 5). יש לדגור בטמפרטורה של 93°C למשך 3 דקות כדי לבצע הידרוליזה של גדיל ה-RNA של הכלאיים RNA-cDNA.
2. הוסף 0.77 μL של 5 M HCl כדי לנטרל את התגובה. לאחר הוספת HCl, יש לערבב ולסובב את הצינור. הנטרול הוא מיידי.
   הערה: מומלץ לבדוק את הכמות המדויקת של 5M HCl הדרושה לנטרול 1 μL של NaOH (למשל, באמצעות רצועות pH) בתנאי חיצוץ.
3. לטהר את ה-cDNA החד-גדילי. השתמש בערכה לשחזור וניקוי DNA/RNA (ראה טבלת חומרים). בצע את הפרוטוקול המפורט בשלב 2.3 כדי לבצע את טיהור העמודות.
   הערה: לא ניתן להשתמש כאן בערכות המשתמשות בטכנולוגיית סינון ג'ל כדי להסיר חומרים מסופי צבע מתגובות ריצוף (ראה טבלת חומרים) עקב שינוי ה- pH בשלבים קודמים.
4. יש לזרז את ה-cDNA המטוהר ל-< 5μL ולאחר מכן להוסיף מים נטולי RNase כדי להחזיר את הנפח ל-5 μL. היזהרו שלא לזרז את ה-cDNA כדי להשלים את היובש.
5. העבר את cDNA מטוהר לתוך צינור PCR סטרילי. cDNA מטוהרים ניתן לאחסן ב -20 ° C עד שבוע אחד.

7. קשירה של לינקר 2 לסוף 3' של cDNA

1. הכן את תגובת הקשירה Linker 2 בצינור PCR סטרילי על ידי הוספת 5 μL של cDNA (מוצרים משלב 6), 1 μL של 50 μM Linker 2 (טבלה 1), 2 μL של 10x T4 DNA ligase brafer, 1 μL של 10 mM ATP, 9 μL של PEG8000 (50% תמיסה), ו 2 μL של 400 U/μL T4 DNA ligase.
   הערה: ריאגנטים יכולים להפוך לתערובת מאסטר כדי להקל על עיבוד הדגימות. אין לכלול ליגאז DNA PEG8000 ו-T4 בתערובת האב.
2. יש לדגור בטמפרטורה של 16°C למשך 16 שעות כדי לקשור את Linker 2 ל-cDNAs.
3. לטהר את ה-cDNA של Linker-2-ligated. השתמש בערכה לשחזור וניקוי DNA/RNA (ראה טבלת חומרים). בצע את הפרוטוקול המפורט בשלב 2.3 כדי לבצע את טיהור העמודות.

8. הסרת מקשר עודף 2

1. הכן את תגובת deadenylation בצינור PCR סטרילי על ידי הוספת 16 μL של cDNA Linker-2-ligated, 2 μL של 10x kit buffer 2, ו 2 μL של 50 U/μL 5'-deadenylase. יש לדגור בטמפרטורה של 30°C למשך שעה אחת כדי להסיר את האדנין בקצה 5' של Linker 2.
2. הוסף 2 μL של 30 U/μL RecJf לתגובת deadenylation. יש לדגור בטמפרטורה של 37°C למשך 30 דקות כדי לעכל עודפי Linker 2. הוסף עוד 2 μL של 30 U/μL RecJf לתוך התגובה.
3. יש לדגור בטמפרטורה של 37°C למשך 30 דקות כדי להמשיך בעיכול של עודפי Linker 2 ולאחר מכן בטמפרטורה של 65°C למשך 20 דקות כדי לנטרל את האנזים.

9. הגברה PCR של cDNAs עם פריימרים ריצוף

1. הקצו פריימרים ל-PCR לדגימות. כל דגימה זקוקה לשילוב ייחודי של פריימרים קדימה ואחורה (טבלה 1) לריבוב יעיל.
2. הוסף מים נטולי RNase כדי להביא את נפח הדגימה ל -25 μL. שמור 5 μL מכל דגימה לתוך צינור PCR סטרילי כגיבוי למקרה PCR צורך לחזור על PCR.
3. הכן את תגובת ה-PCR (ראה טבלת חומרים עבור ערכת PCR) על-ידי הוספת 20 μL של cDNA (מוצרים משלב 8), 1 μL של פריימר קדמי של 2.5 μM, 1 μL של פריימר הפוך של 2.5 μM, 25 μL של 2x DNA פולימראז, 2 μL של מים נטולי RNase ו-1 μL של DNA פולימראז.
   הערה: ריאגנטים יכולים להפוך לתערובת מאסטר כדי להקל על עיבוד הדגימות. אין להוסיף DNA פולימראז לתערובת האב.
4. בצע PCR עם דנטורציה ראשונית ב 94 ° C למשך דקה אחת, ואחריה 18 מחזורים של דנטורציה ב 98 ° C במשך 20 s - חישול ב 58 ° C במשך 20 s - הארכה ב 68 ° C למשך דקה אחת.
   הערה: אין להגביר PCR מעבר לטווח הליניארי. סך של 18 מחזורים יהיה אופטימלי עבור רוב הניסויים, אבל זה עשוי להיות תלוי הקשר.
5. יש לחסן במהירות את מוצרי ה-PCR לפחות מ-25 μL ולאחר מכן להוסיף מים נטולי RNase כדי להחזיר את הנפח ל-25 μL. העבר 5 μL של מוצרי PCR לצינור סטרילי של 0.5 מ"ל לבדיקת התפלגות הגודל (ראה שלב 9.6). אחסן את 20 μL הנותרים של מוצרי PCR ב -20 ° C עד צעדים נוספים.
6. בדוק את התפלגות הגודל של מוצרי PCR כמתואר להלן.
   1. מכינים ג'ל אגרוז 3% במאגר TAE.
      הערה: בפרוטוקול זה, אתידיום ברומיד (EtBr) משמש לצביעת ג'ל לאחר אלקטרופורזה (ראה שלב 9.6.5). כתמי DNA מתאימים ניתן להוסיף לתמיסת הג'ל בשלב זה או להשתמש בהם לצביעת ג'ל מאוחר יותר.
   2. יש לערבב 1 μL של 6x צבע העמסה לתוך 5 μL של מוצרי PCR (משלב 9.5) ולטעון את הג'ל עם התערובת.
   3. טען 5 μL של סולמות DNA לתוך הבאר לפני הדגימה הראשונה ואת הבאר אחרי הדגימה האחרונה. השתמש בסולמות DNA של 50 bp או 100 bp כדי לאפשר אפליה משופרת בגודל של מוצרי PCR בין 150 bp ל -300 bp.
   4. הפעל אלקטרופורזה ג'ל כדי לאתר את מוצרי ה- PCR. מצב הריצה המתאים עשוי להיות תלוי הקשר. כאן, לרוץ ב 120 V, 400 mA במשך 75 דקות עבור 17.78 ס"מ (רוחב) x 10.16 ס"מ (גובה) x 1 ס"מ (עובי) לוח ג'ל.
   5. מניחים את הג'ל בקופסה וממלאים את הקופסה במים נטולי יונים, עד שהג'ל טובל לחלוטין. הוסף 10 μL של EtBr למי DI השריית הג'ל. עוטפים את הקופסה בנייר כסף ומניחים על שייקר. מכתימים את הג'ל למשך 30 דקות תוך כדי רעידה.
   6. השליכו את הפסולת המכילה EtBr לבקבוק פסולת שהונח במכסה אדים. שטפו את הג'ל במי DI פעם אחת והשליכו את המים המכילים EtBr לבקבוק הפסולת.
   7. ממלאים את הקופסה במי DI עד שהג'ל שקוע לחלוטין. עוטפים את הקופסה בנייר כסף ומניחים על שייקר. יש לשטוף את הג'ל במשך 10 דקות תוך כדי ניעור.
   8. השליכו את המים המכילים EtBr לבקבוק הפסולת שבמכסה האדים. השתמש במצלמת ג'ל כדי להמחיש את הפסים. לרכוש תמונה ברזולוציה גבוהה של הג'ל.

10. טיהור ג'ל

1. מכינים ג'ל אגרוז 3% במאגר TAE. הכינו ג'ל בעובי 1 ס"מ עם מסרקים רחבים (1 מ"מ עובי; 5 מ"מ רוחב; 15 מ"מ עומק), כך שכל באר יכולה להכיל לפחות 25 מיקרוליטר של תערובת צבע להעמסת דגימות.
2. מערבבים 4 μL של צבע טעינה 6x עם 20 μL של מוצרי PCR (משלב 9.5) וטוענים את הג'ל בתערובת. השאירו נתיבים ריקים בין הדגימות כדי למזער זיהום צולב במהלך כריתת הג'ל.
3. טען סולמות DNA, הפעל אלקטרופורזה בג'ל, הכתים ושטוף את הג'ל, וצלם תמונות ג'ל כמתואר בשלב 9.6.
4. בלו בלוקים ג'ל המכילים מוצרי PCR בטווח גודל היעד. כדי למזער זיהום עם דימרים פריימר (175 bp linkers ללא תוספות), לחלץ מוצרי PCR בגודל מעל 195 bp (175 bp linkers + 20 bp miRNAs).
5. לטהר את מוצרי PCR באמצעות מיצוי ג'ל. השתמשו בערכת מיצוי ג'ל (ראו טבלת חומרים). פרוטוקול הטיהור מבוסס על פרוטוקול היצרן, עם שינויים קלים בתאימות AQRNA-seq. כל שלבי הצנטריפוגה צריכים להתבצע במהירות של 17,900 x גרם למשך דקה אחת באמצעות צנטריפוגה בטמפרטורת החדר, אלא אם כן צוין אחרת. בצע את השלבים המתוארים להלן.
   1. למדוד את המשקל של בלוקים ג'ל בתוך צינורות. הוסף 6 כרכים של Buffer QG (מסופק בערכה) לנפח אחד של בלוק ג'ל (1 מ"ג ג'ל הוא בערך 1 μL).
   2. יש לדגור ב-50°C למשך 10 דקות או עד להמסה מלאה של קוביות הג'ל. צינורות מערבולת כל 2 דקות כדי להקל על המסת ג'ל. לאחר המסת הג'ל, התערובת צריכה להידמות לצבע של Buffer QG ללא הג'ל המומס. אם הצבע כתום או סגול, להוסיף 10 μL של 3 M נתרן אצטט (pH = 5.0) ולערבב היטב.
   3. מוסיפים נפח ג'ל אחד של איזופרופנול לתערובת ומערבבים היטב. מניחים עמוד ספין בצינור איסוף של 2 מ"ל (מסופק בערכה).
   4. כדי לקשור DNA, יש למרוח את הדגימה (עד 750 μL בכל פעם) על העמוד והצנטריפוגה. מחק את הזרימה והחזיר את העמודה לאותו צינור איסוף. הכמות המקסימלית של ג'ל לכל עמוד ספין היא 400 מ"ג.
   5. הוסף 500 μL של Buffer QG לעמוד ולצנטריפוגה. מחק את הזרימה והחזיר את העמודה לאותו צינור איסוף.
   6. כדי לשטוף את הזיהומים, הוסף 750 μL של Buffer PE (מסופק בערכה) לעמודה, תן לעמוד במשך 5 דקות, וצנטריפוגה. מחק את הזרימה והחזיר את העמודה לאותו צינור איסוף. צנטריפוגה שוב כדי להסיר חיץ שטיפה שיורי.
   7. הכניסו את העמוד לצינור סטרילי בנפח 1.5 מ"ל. כדי לשלול DNA, הוסף 30 μL של Buffer EB (מסופק בערכה) למרכז קרום העמודה, תן לעמוד במשך 4 דקות, וצנטריפוגה.
   8. Speed-vac ולהשהות מחדש את מוצרי PCR מטוהרים בג'ל ב-12 μL של Buffer EB.
6. למדוד את ריכוז הספריות הבנויות על ידי ספקטרופוטומטריה UV-Visible ו / או כימות פלואורומטרי.

11. רצף הספרייה

1. הגש את הספריות שנבנו למרכז ריצוף חיצוני להערכת איכות וריצוף Illumina. כדי להבטיח רגישות מספקת במיפוי כמותי של נופי רנ"א קטנים, בחרו בריצוף זוגי עם קריאות של 75 bp מכל כיוון (כלומר, PE75), תוך שאיפה לקריאות רצף גולמי של לפחות 1.5 M לכל כיוון עבור כל דגימה. השתמש פריימרים מותאמים אישית (טבלה 1) עבור ריצוף NextSeq, אבל זה אופציונלי עבור רצף על MiSeq.
   הערה: ניתן לבצע ריצוף באמצעות פלטפורמות MiSeq או NextSeq500. בחירת הפלטפורמה עשויה להיות תלויה באופי הדגימות ובספירת המדגם הכוללת.

12. צינור ניתוח נתונים

הערה: איור 2 מספק המחשה גרפית של פרוצדורות פשוטות המעורבות בצינור ניתוח הנתונים, אשר לוקח קריאות רצף גולמיות (בתבנית FASTQ) כקלט ויוצר מטריצת שפע עם שורות המייצגות חברים של מיני RNA קטנים בעלי עניין ועמודות המייצגות דגימות. עבור ריצוף משויך, כל דגימה מתאימה לשני קובצי FASTQ, אחד עבור הקריאות קדימה והשני עבור הקריאות ההפוכות. צינור ניתוח הנתונים המלא, עם כל הסקריפטים המשויכים ומדריך עם ביאורים נרחבים לכל שלב, זמין ב- GitHub (https://github.com/Chenrx9293/AQRNA-seq-JoVE.git).

1. אחזר קריאות רצף גולמיות ממרכז הרצף החיצוני והערך את איכות הרצף באמצעות תוכניות קוד פתוח כגון FastQC¹⁴ או Fastp¹⁵.
2. צור ספריית רצפי הפניות בתבנית FASTA.
   הערה: המפתח ליכולת ההסתגלות של הצינור למגוון מחלקות RNA קטנות הוא ספריית רצפי ייחוס מתאימה. כדי להשיג הערכות שפע מדויקות של חברים במחלקות RNA ספציפיות המעניינות (למשל, miRNA), המשתמשים צפויים לאצור בקפידה ספריית רצפי ייחוס לשימוש עם הצינור. כל ההוראות האחרות לביצוע צנרת נשארות עקביות בין מחלקות RNA קטנות שונות.
3. צור ספריה בשם AQRNA-seq ליישום צינור ניתוח הנתונים ומקם את כל קבצי ה- Script, קריאות הרצף המסוננות באיכות וספריית רצפי ההפניות לספריה זו. בצע את ההוראות המפורטות ב- GitHub (https://github.com/Chenrx9293/AQRNA-seq-JoVE.git) כדי להכין ספריות משנה ולבצע שינויים חיוניים בקבצים למיקוד אורגניזמים שונים ו / או מיני RNA קטנים, כמו גם תאימות של מערכת ההפעלה ו / או מתזמן העבודה.
4. יישם את צינור ניתוח הנתונים בהתאם לשלבים המתוארים במדריך ב- GitHub (https://github.com/Chenrx9293/AQRNA-seq-JoVE.git), המכיל תיאורים, קבצי קלט ופלט, וכן שורות פקודה עבור כל שלב. לסיכום, הצינור כולל (i) חיתוך רצפי מקשרים ונוקלאוטידים אקראיים מהקריאות, (ii) סינון קריאות על פי אורכן, (iii) מיפוי הקריאות לרצפי הייחוס, (iv) פתרון מיפויים דו-משמעיים, ו-(v) יצירת מטריצת השפע.

תוצאות

מיקובקטריום בוביס זן BCG (bacilli de Calmette et Guérin) 1173P2 שעבר גדילה אקספוננציאלית היה נתון לסדרת זמן (0, 4, 10 ו-20 יום) של רעב תזונתי, ואחריו החייאה של 6 ימים בתווך עשיר בחומרים מזינים כפי שהוצג קודם לכן בהו ^{ואחרים.7}. רנ"א קטן בודד מתרבית חיידקים, עם שלושה העתקים ביולוגיים, בכל אחת מחמש נקו?...

Discussion

תהליך העבודה להכנת ספריית AQRNA-seq נועד למקסם את לכידת הרנ"א בתוך דגימה ולמזער את נפילת הפולימראז במהלך שעתוק לאחור⁷. באמצעות קשירת מקשר דו-שלבית, אוליגוס DNA חדש (Linker 1 ו-Linker 2) נקשר בעודף כדי להשלים באופן מלא את ה-RNA שבתוך הדגימה. ניתן להסיר ביעילות קישורים עודפים באמצעות RecJf, אקסונוק...

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
2-ketoglutarate	Sigma-Aldrich	75890	Prepare a working solution (1 M) and store it at -20ºC
2100 Bioanalyzer Instrument	Agilent	G2938C
Adenosine 5'-Triphosphate (ATP)	New England Biolabs	M0437M (component #: N0437AVIAL)	NEB M0437M contains T4 RNA Ligase 1 (30 U/μL), T4 RNA Ligase Reaction Buffer (10X), PEG 8000 (1X), and ATP (100 mM); prepare a working solution (10 mM) and store it at -20ºC
AGAROSE GPG/LE	AmericanBio	AB00972-00500	Store at ambient temperature
Ammonium iron(II) sulfate hexahydrate	Sigma-Aldrich	F2262	Prepare a working solution (0.25 M) and store it at -20 °C
Bioanalyzer Small RNA Analysis	Agilent	5067-1548	The Small RNA Analysis is used for checking the quality of input RNAs and the efficiency of enzymatic reactions (e.g., Linker 1 ligation)
Bovine Serum Albumin (BSA; 10 mg/mL)	New England Biolabs	B9000	This product was discontinued on 12/15/2022 and is replaced with Recombinant Albumin, Molecular Biology Grade (NEB B9200).
Chloroform	Macron Fine Chemicals	4441-10
Demethylase	ArrayStar	AS-FS-004	Demethylase comes with the rtStar tRNA Pretreatment & First-Strand cDNA Synthesis Kit (AS-FS-004)
Deoxynucleotide (dNTP) Solution Mix	New England Biolabs	N0447L (component #: N0447LVIAL)	This dNTP Solution Mix contains equimolar concentrations of dATP, dCTP, dGTP and dTTP (10 mM each)
Digital Dual Heat Block	VWR Scientific Products	13259-052	Heating block is used with the QIAquick Gel Extraction Kit
DyeEx 2.0 Spin Kit	Qiagen	63204	Effective at removing short remnants (e.g., oligos less than 10 bp in length)
Electrophoresis Power Supply	Bio-Rad Labrotories	PowerPac 300
Eppendorf PCR Tubes (0.5 mL)	Eppendorf	0030124537
Eppendorf Safe-Lock Tubes (0.5 mL)	Eppendorf	022363611
Eppendorf Safe-Lock Tubes (1.5 mL)	Eppendorf	022363204
Eppendorf Safe-Lock Tubes (2 mL)	Eppendorf	022363352
Ethyl alcohol (Ethanol), Pure	Sigma-Aldrich	E7023	The pure ethanol is used with the Oligo Clean and Concentrator Kit from Zymo Research
Gel Imaging System	Alpha Innotech	FluorChem 8900
Gel Loading Dye, Purple (6X), no SDS	New England Biolabs	N0556S (component #: B7025SVIAL)	NEB N0556S contains Quick-Load Purple 50 bp DNA Ladder and Gel Loading Dye, Purple (6X), no SDS
GENESYS 180 UV-Vis Spectrophotometer	Thermo Fisher Scientific	840-309000	The spectrophotometer is used for measuring the oligo concentrations using the Beer's law
HEPES	Sigma-Aldrich	H4034	Prepare a working solution (1 M; pH = 8 with NaOH) and store it at -20 °C
Hydrochloric acid (HCl)	VWR Scientific Products	BDH3028	Prepare a working solution (5 M) and store it at ambient temperature
Isopropyl Alcohol (Isopropanol), Pure	Macron Fine Chemicals	3032-16	Isopropanol is used with the QIAquick Gel Extraction Kit
L-Ascorbic acid	Sigma-Aldrich	A5960	Prepare a working solution (0.5 M) and store it at -20ºC
Microcentrifuge	Eppendorf	5415D
NanoDrop 2000 Spectrophotometer	Thermo Fisher Scientific	ND-2000
NEBuffer 2 (10X)	New England Biolabs	M0264L (component #: B7002SVIAL)	NEB M0264L contains RecJf (30 U/μL) and NEBuffer 2 (10X); store at -20 °C
Nuclease-Free Water (not DEPC-Treated)	Thermo Fisher Scientific	AM9938
Oligo Clean & Concentrator Kit	Zymo Research	D4061	Store at ambient temperature
PEG 8000 (50% solution)	New England Biolabs	M0437M (component #: B1004SVIAL)	NEB M0437M contains T4 RNA Ligase 1 (30 U/μL), T4 RNA Ligase Reaction Buffer (10X), PEG 8000 (1X), and ATP (100 mM); prepare a working solution (10 mM) and store it at -20ºC
Peltier Thermal Cycler	MJ Research	PTC-200
Phenol:choloroform:isoamyl alcohol 25:24:1 pH = 5.2	Thermo Fisher Scientific	J62336
PrimeScript Buffer (5X)	TaKaRa	2680A
PrimeScript Reverse Transcriptase	TaKaRa	2680A
QIAquick Gel Extraction Kit	Qiagen	28704	This kit requires a heating block and isopropanol to work with
Quick-Load Purple 100 bp DNA Ladder	New England Biolabs	N0551S (component #: N0551SVIAL)
Quick-Load Purple 50 bp DNA Ladder	New England Biolabs	N0556S (component #: N0556SVIAL)	NEB N0556S contains Quick-Load Purple 50 bp DNA Ladder and Gel Loading Dye, Purple (6X), no SDS
RecJf (30 U/μL)	New England Biolabs	M0264L (component #: M0264LVIAL)	NEB M0264L contains RecJf (30 U/μL) and NEBuffer 2 (10X); store at -20 °C
RNase Inhibitor (murine; 40 U/μL)	New England Biolabs	M0314L (component #: M0314LVIAL)	Store at -20 °C
SeqAMP DNA Polymerase	TaKaRa	638509	TaKaRa 638509 contains SeqAMP DNA Polymerase and SeqAMP PCR Buffer (2X)
SeqAMP PCR Buffer (2X)	TaKaRa	638509	TaKaRa 638509 contains SeqAMP DNA Polymerase and SeqAMP PCR Buffer (2X)
Shrimp Alkaline Phosphatase (1 U/μL)	New England Biolabs	M0371L (component #: M0371LVIAL)
Sodium hydroxide (NaOH)	Sigma-Aldrich	S5881	Prepare a working solution (5 M) and store it at ambient temperature
T4 DNA Ligase (400 U/μL)	New England Biolabs	M0202L (component #: M0202LVIAL)	NEB M0202L contains T4 DNA Ligase (400 U/μL) and T4 DNA Ligase Reaction Buffer (10X)
T4 DNA Ligase Reaction Buffer (10X)	New England Biolabs	M0202L (component #: B0202SVIAL)	NEB M0202L contains T4 DNA Ligase (400 U/μL) and T4 DNA Ligase Reaction Buffer (10X)
T4 RNA Ligase 1 (30 U/μL)	New England Biolabs	M0437M (component #: M0437MVIAL)	NEB M0437M contains T4 RNA Ligase 1 (30 U/μL), T4 RNA Ligase Reaction Buffer (10X), PEG 8000 (1X), and ATP (100 mM)
T4 RNA Ligase Reaction Buffer (10X)	New England Biolabs	M0437M (component #: B0216SVIAL)	NEB M0437M contains T4 RNA Ligase 1 (30 U/μL), T4 RNA Ligase Reaction Buffer (10X), PEG 8000 (1X), and ATP (100 mM)