A subscription to JoVE is required to view this content. Sign in or start your free trial.
ריצוף RNA לכימות מוחלט (AQRNA-seq) היא טכנולוגיה שפותחה כדי לכמת את הנוף של כל הרנ"א הקטן בתערובות ביולוגיות. כאן, הן שלבי הכנת הספרייה והן שלבי עיבוד הנתונים של AQRNA-seq מודגמים, המכמתים שינויים במאגר RNA העברה (tRNA) ב- Mycobacterium bovis BCG במהלך תרדמה הנגרמת מרעב.
AQRNA-seq מספק קשר ליניארי ישיר בין ריצוף ספירות קריאה לבין מספרי העתקי RNA קטנים בדגימה ביולוגית, ובכך מאפשר כימות מדויק של מאגר הרנ"א הקטן. הליך הכנת ספריית AQRNA-seq המתואר כאן כולל שימוש במקשרי ריצוף שתוכננו בהתאמה אישית וצעד להפחתת שינויי RNA מתילציה החוסמים את תהליך השעתוק ההפוך, מה שמביא לתפוקה מוגברת של cDNA באורך מלא. בנוסף, מוצג יישום מפורט של צנרת הביואינפורמטיקה הנלווית. הדגמה זו של AQRNA-seq נערכה באמצעות ניתוח כמותי של 45 tRNAs ב- Mycobacterium bovis BCG שנקטפו ב -5 ימים נבחרים במהלך זמן של 20 יום של מחסור בחומרים מזינים ו -6 ימי החייאה. מאמצים מתמשכים לשיפור היעילות והקפדנות של AQRNA-seq יידונו גם כאן. זה כולל בחינת שיטות למייתר טיהור ג'ל להקלה על בעיות דימר פריימר לאחר הגברת PCR ולהגדיל את שיעור הקריאות באורך מלא כדי לאפשר מיפוי קריאה מדויק יותר. שיפורים עתידיים ב-AQRNA-seq יתמקדו בהקלה על אוטומציה ויישום בתפוקה גבוהה של טכנולוגיה זו לכימות כל מיני הרנ"א הקטנים בדגימות תאים ורקמות מאורגניזמים מגוונים.
ריצוף הדור הבא (באנגלית: Next generation sequencing או בקיצור NGS) היא טכנולוגיית ריצוף DNA הכוללת פיצול DNA, קשירת אוליגונוקלאוטידים מתאמים, הגברה מבוססת תגובת שרשרת פולימראז (PCR), ריצוף הדנ"א והרכבה מחדש של רצפי המקטעים לגנום. ההתאמה של NGS לרצף RNA (RNA-seq) היא גישה רבת עוצמה לזיהוי וכימות תעתיקי RNA וגרסאותיהם1. התפתחויות חדשניות בתהליכי עבודה של הכנת ספריות RNA וצינורות ניתוח ביואינפורמטיקה, יחד עם התקדמות במכשור מעבדתי, הרחיבו את הרפרטואר של יישומי RNA-seq, והתקדמו מעבר לריצוף אקסומי לאומיקה פונקציונלית מתקדמת כמו פרופיל RNA לא מקודד2, אנליזה של תא בודד3, תעתיק מרחבי 4,5
הערה: איור 1 מספק המחשה גרפית של ההליכים הכרוכים בהכנת ספריית AQRNA-seq. מידע מפורט לגבי ריאגנטים, כימיקלים ועמודות/ערכות המשמשים בהליך ניתן למצוא בטבלת החומרים. מומלץ לבצע הערכה מקיפה של טוהר, שלמות וכמות דגימות RNA קלט באמצעות (i) אלקטרופורזה ג'ל אגרוז 3%, (ii) כלי אלקטרופורזה אוטומטיים לבקרת איכות הדגימה של ביומולקולות (ראה טבלת חומרים), ו- (iii) ספקטרופוטומטריה UV-Visible ו / או כימות פלואורומטרי. חובה לשמור את כל התגובות ואת תערובות המאסטר על קרח, אלא אם כן צוין אחרת. שינוע ריאגנטים (למשל, אנזימים) בקופסאות קירור אל אחסון של -20°C וממנו כדי לשמור על חיי המדף שלהם ולהימנע ממחזורי הקפאה-הפשרה מרובים של....
מיקובקטריום בוביס זן BCG (bacilli de Calmette et Guérin) 1173P2 שעבר גדילה אקספוננציאלית היה נתון לסדרת זמן (0, 4, 10 ו-20 יום) של רעב תזונתי, ואחריו החייאה של 6 ימים בתווך עשיר בחומרים מזינים כפי שהוצג קודם לכן בהו ואחרים.7. רנ"א קטן בודד מתרבית חיידקים, עם שלושה העתקים ביולוגיים, בכל אחת מחמש נקו?.......
תהליך העבודה להכנת ספריית AQRNA-seq נועד למקסם את לכידת הרנ"א בתוך דגימה ולמזער את נפילת הפולימראז במהלך שעתוק לאחור7. באמצעות קשירת מקשר דו-שלבית, אוליגוס DNA חדש (Linker 1 ו-Linker 2) נקשר בעודף כדי להשלים באופן מלא את ה-RNA שבתוך הדגימה. ניתן להסיר ביעילות קישורים עודפים באמצעות RecJf, אקסונוק.......
P.C.D. הוא ממציא של שני פטנטים (PCT/US2019/013714, US 2019/0284624 A1) הנוגעים לעבודה שפורסמה.
מחברי העבודה הנוכחית אסירי תודה למחברי המאמר המקורי המתאר את טכנולוגיית AQRNA-seq7. עבודה זו נתמכה על ידי מענקים מהמכונים הלאומיים לבריאות (ES002109, AG063341, ES031576, ES031529, ES026856) וקרן המחקר הלאומית של סינגפור באמצעות הברית סינגפור-MIT למחקר וטכנולוגיה עמידות מיקרוביאלית IRG.
....Name | Company | Catalog Number | Comments |
2-ketoglutarate | Sigma-Aldrich | 75890 | Prepare a working solution (1 M) and store it at -20ºC |
2100 Bioanalyzer Instrument | Agilent | G2938C | |
5'-deadenylase (50 U/μL) | New England Biolabs | M0331S (component #: M0331SVIAL) | Store at -20 °C |
Adenosine 5'-Triphosphate (ATP) | New England Biolabs | M0437M (component #: N0437AVIAL) | NEB M0437M contains T4 RNA Ligase 1 (30 U/μL), T4 RNA Ligase Reaction Buffer (10X), PEG 8000 (1X), and ATP (100 mM); prepare a working solution (10 mM) and store it at -20ºC |
AGAROSE GPG/LE | AmericanBio | AB00972-00500 | Store at ambient temperature |
Ammonium iron(II) sulfate hexahydrate | Sigma-Aldrich | F2262 | Prepare a working solution (0.25 M) and store it at -20 °C |
Bioanalyzer Small RNA Analysis | Agilent | 5067-1548 | The Small RNA Analysis is used for checking the quality of input RNAs and the efficiency of enzymatic reactions (e.g., Linker 1 ligation) |
Bovine Serum Albumin (BSA; 10 mg/mL) | New England Biolabs | B9000 | This product was discontinued on 12/15/2022 and is replaced with Recombinant Albumin, Molecular Biology Grade (NEB B9200). |
Chloroform | Macron Fine Chemicals | 4441-10 | |
Demethylase | ArrayStar | AS-FS-004 | Demethylase comes with the rtStar tRNA Pretreatment & First-Strand cDNA Synthesis Kit (AS-FS-004) |
Deoxynucleotide (dNTP) Solution Mix | New England Biolabs | N0447L (component #: N0447LVIAL) | This dNTP Solution Mix contains equimolar concentrations of dATP, dCTP, dGTP and dTTP (10 mM each) |
Digital Dual Heat Block | VWR Scientific Products | 13259-052 | Heating block is used with the QIAquick Gel Extraction Kit |
DyeEx 2.0 Spin Kit | Qiagen | 63204 | Effective at removing short remnants (e.g., oligos less than 10 bp in length) |
Electrophoresis Power Supply | Bio-Rad Labrotories | PowerPac 300 | |
Eppendorf PCR Tubes (0.5 mL) | Eppendorf | 0030124537 | |
Eppendorf Safe-Lock Tubes (0.5 mL) | Eppendorf | 022363611 | |
Eppendorf Safe-Lock Tubes (1.5 mL) | Eppendorf | 022363204 | |
Eppendorf Safe-Lock Tubes (2 mL) | Eppendorf | 022363352 | |
Ethyl alcohol (Ethanol), Pure | Sigma-Aldrich | E7023 | The pure ethanol is used with the Oligo Clean and Concentrator Kit from Zymo Research |
Gel Imaging System | Alpha Innotech | FluorChem 8900 | |
Gel Loading Dye, Purple (6X), no SDS | New England Biolabs | N0556S (component #: B7025SVIAL) | NEB N0556S contains Quick-Load Purple 50 bp DNA Ladder and Gel Loading Dye, Purple (6X), no SDS |
GENESYS 180 UV-Vis Spectrophotometer | Thermo Fisher Scientific | 840-309000 | The spectrophotometer is used for measuring the oligo concentrations using the Beer's law |
HEPES | Sigma-Aldrich | H4034 | Prepare a working solution (1 M; pH = 8 with NaOH) and store it at -20 °C |
Hydrochloric acid (HCl) | VWR Scientific Products | BDH3028 | Prepare a working solution (5 M) and store it at ambient temperature |
Isopropyl Alcohol (Isopropanol), Pure | Macron Fine Chemicals | 3032-16 | Isopropanol is used with the QIAquick Gel Extraction Kit |
L-Ascorbic acid | Sigma-Aldrich | A5960 | Prepare a working solution (0.5 M) and store it at -20ºC |
Microcentrifuge | Eppendorf | 5415D | |
NanoDrop 2000 Spectrophotometer | Thermo Fisher Scientific | ND-2000 | |
NEBuffer 2 (10X) | New England Biolabs | M0264L (component #: B7002SVIAL) | NEB M0264L contains RecJf (30 U/μL) and NEBuffer 2 (10X); store at -20 °C |
Nuclease-Free Water (not DEPC-Treated) | Thermo Fisher Scientific | AM9938 | |
Oligo Clean & Concentrator Kit | Zymo Research | D4061 | Store at ambient temperature |
PEG 8000 (50% solution) | New England Biolabs | M0437M (component #: B1004SVIAL) | NEB M0437M contains T4 RNA Ligase 1 (30 U/μL), T4 RNA Ligase Reaction Buffer (10X), PEG 8000 (1X), and ATP (100 mM); prepare a working solution (10 mM) and store it at -20ºC |
Peltier Thermal Cycler | MJ Research | PTC-200 | |
Phenol:choloroform:isoamyl alcohol 25:24:1 pH = 5.2 | Thermo Fisher Scientific | J62336 | |
PrimeScript Buffer (5X) | TaKaRa | 2680A | |
PrimeScript Reverse Transcriptase | TaKaRa | 2680A | |
QIAquick Gel Extraction Kit | Qiagen | 28704 | This kit requires a heating block and isopropanol to work with |
Quick-Load Purple 100 bp DNA Ladder | New England Biolabs | N0551S (component #: N0551SVIAL) | |
Quick-Load Purple 50 bp DNA Ladder | New England Biolabs | N0556S (component #: N0556SVIAL) | NEB N0556S contains Quick-Load Purple 50 bp DNA Ladder and Gel Loading Dye, Purple (6X), no SDS |
RecJf (30 U/μL) | New England Biolabs | M0264L (component #: M0264LVIAL) | NEB M0264L contains RecJf (30 U/μL) and NEBuffer 2 (10X); store at -20 °C |
RNase Inhibitor (murine; 40 U/μL) | New England Biolabs | M0314L (component #: M0314LVIAL) | Store at -20 °C |
SeqAMP DNA Polymerase | TaKaRa | 638509 | TaKaRa 638509 contains SeqAMP DNA Polymerase and SeqAMP PCR Buffer (2X) |
SeqAMP PCR Buffer (2X) | TaKaRa | 638509 | TaKaRa 638509 contains SeqAMP DNA Polymerase and SeqAMP PCR Buffer (2X) |
Shrimp Alkaline Phosphatase (1 U/μL) | New England Biolabs | M0371L (component #: M0371LVIAL) | |
Sodium hydroxide (NaOH) | Sigma-Aldrich | S5881 | Prepare a working solution (5 M) and store it at ambient temperature |
T4 DNA Ligase (400 U/μL) | New England Biolabs | M0202L (component #: M0202LVIAL) | NEB M0202L contains T4 DNA Ligase (400 U/μL) and T4 DNA Ligase Reaction Buffer (10X) |
T4 DNA Ligase Reaction Buffer (10X) | New England Biolabs | M0202L (component #: B0202SVIAL) | NEB M0202L contains T4 DNA Ligase (400 U/μL) and T4 DNA Ligase Reaction Buffer (10X) |
T4 RNA Ligase 1 (30 U/μL) | New England Biolabs | M0437M (component #: M0437MVIAL) | NEB M0437M contains T4 RNA Ligase 1 (30 U/μL), T4 RNA Ligase Reaction Buffer (10X), PEG 8000 (1X), and ATP (100 mM) |
T4 RNA Ligase Reaction Buffer (10X) | New England Biolabs | M0437M (component #: B0216SVIAL) | NEB M0437M contains T4 RNA Ligase 1 (30 U/μL), T4 RNA Ligase Reaction Buffer (10X), PEG 8000 (1X), and ATP (100 mM) |
Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article
Request PermissionThis article has been published
Video Coming Soon
Copyright © 2025 MyJoVE Corporation. All rights reserved