Küçük RNA'ları Ölçmek için AQRNA-seq

Özet

Mutlak miktar tayini RNA dizilimi (AQRNA-seq), biyolojik karışımlardaki tüm küçük RNA'ların manzarasını ölçmek için geliştirilmiş bir teknolojidir. Burada, açlığın neden olduğu uyku hali sırasında Mycobacterium bovis BCG'deki transfer RNA (tRNA) havuzundaki değişiklikleri ölçen AQRNA-seq'nin hem kütüphane hazırlama hem de veri işleme adımları gösterilmektedir.

Özet

AQRNA-seq, biyolojik bir numunedeki sıralama okuma sayıları ile küçük RNA kopya sayıları arasında doğrudan doğrusal bir ilişki sağlar, böylece küçük RNA havuzunun doğru bir şekilde nicelleştirilmesini sağlar. Burada açıklanan AQRNA-seq kütüphanesi hazırlama prosedürü, özel olarak tasarlanmış dizileme bağlayıcılarının kullanımını ve ters transkripsiyon sürecini bloke eden metilasyon RNA modifikasyonlarını azaltmak için bir adımı içerir, bu da tam uzunlukta cDNA veriminin artmasıyla sonuçlanır. Ek olarak, eşlik eden biyoinformatik boru hattının ayrıntılı bir uygulaması sunulmaktadır. AQRNA-seq'in bu gösterimi, 20 günlük bir besin yoksunluğu ve 6 günlük resüsitasyon süreci boyunca seçilen 5 günde hasat edilen Mycobacterium bovis BCG'deki 45 tRNA'nın kantitatif bir analizi yoluyla gerçekleştirildi. AQRNA-seq'in verimliliğini ve titizliğini artırmaya yönelik devam eden çabalar da burada tartışılacaktır. Bu, PCR amplifikasyonundan sonra primer dimer sorunlarını azaltmak için jel saflaştırmasını ortadan kaldırmaya ve daha doğru okuma eşlemesi sağlamak için tam uzunlukta okumaların oranını artırmaya yönelik yöntemlerin araştırılmasını içerir. AQRNA-seq'te gelecekteki iyileştirmeler, çeşitli organizmalardan alınan hücre ve doku örneklerindeki tüm küçük RNA türlerinin miktarını belirlemek için bu teknolojinin otomasyonunu ve yüksek verimli uygulamasını kolaylaştırmaya odaklanacaktır.

Giriş

Büyük paralel dizileme olarak da bilinen yeni nesil dizileme (NGS), DNA parçalanmasını, adaptör oligonükleotidlerin bağlanmasını, polimeraz zincir reaksiyonu (PCR) tabanlı amplifikasyonu, DNA'nın dizilenmesini ve parça dizilerinin bir genomda yeniden birleştirilmesini içeren bir DNA dizileme teknolojisidir. NGS'nin RNA dizisine (RNA-dizilimi) adaptasyonu, RNA transkriptlerini ve varyantlarını tanımlamak ve ölçmek için güçlü bir yaklaşımdır¹. RNA kütüphanesi hazırlama iş akışlarındaki ve biyoinformatik analiz boru hatlarındaki yenilikçi gelişmeler, laboratuvar cihazlarındaki ilerlemelerle birleştiğinde, RNA-seq uygulamalarının repertuarını genişletti ve ekzom dizilemenin ötesine geçerek, kodlamayan RNA profillemesi², tek hücre analizi³, uzamsal transkriptomik ^4,5, alternatif birleştirme analizi⁶ gibi gelişmiş fonksiyonel omiklere ilerledi, diğerleri arasında. Bu gelişmiş RNA-seq yöntemleri, normal ve hastalıklı hücre ve dokudaki transkriptomun kantitatif analizi yoluyla karmaşık RNA fonksiyonlarını ortaya çıkarır.

RNA dizilimindeki bu ilerlemelere rağmen, birkaç temel teknik özellik yöntemin nicel gücünü sınırlamaktadır. Çoğu RNA-seq yöntemi, deneysel değişkenler (yani biyolojik numuneler ve/veya fizyolojik durumlar) arasındaki RNA seviyelerindeki değişikliklerin kesin ve doğru bir şekilde ölçülmesine izin verirken, bir numune içindeki RNA moleküllerinin seviyelerinin nicel karşılaştırmalarını sağlayamazlar. Örneğin, çoğu RNA-seq yöntemi, eksprese edilen tRNA'ların hücresel bir havuzundaki tek tek tRNA izoseptör moleküllerinin nispi kopya sayısını doğru bir şekilde ölçemez. Eşlik eden yayın^7'de vurgulandığı gibi, RNA-seq ile ilgili bu sınırlama, RNA yapısının çeşitli özelliklerinden ve kütüphane hazırlığının biyokimyasından kaynaklanmaktadır. Örneğin, 3' ve 5' uçlu dizileme bağlayıcılarını RNA moleküllerine bağlamak için kullanılan ligasyon enzimlerinin aktivitesi, RNA'nın terminal nükleotidlerinin ve dizileme bağlayıcılarının kimliğinden güçlü bir şekilde etkilenir. Bu, bağlayıcı ligasyonlarının verimliliğinde büyük farklılıklara ve sıralama okumalarında derin artefaktal artışlara yol açar ^8,9,10.

İkinci bir sınırlama seti, RNA moleküllerinin doğal yapısal özelliklerinden kaynaklanmaktadır. Spesifik olarak, RNA ikincil yapı oluşumu ve epitranskriptomun düzinelerce transkripsiyon sonrası RNA modifikasyonundaki dinamik değişiklikler, ters transkripsiyon sırasında polimeraz düşmesine veya mutasyonuna neden olabilir. Bu hatalar, eksik veya kesilmiş cDNA sentezi veya değişmiş RNA dizisi ile sonuçlanır. Bu fenomenlerin her ikisi de ikincil yapıları veya bazı modifikasyonları haritalamak için kullanılabilse de, sonraki kütüphane hazırlama adımları kesilmiş cDNA'ları yakalayamazsa veya veri işleme, bir referans veri kümesiyle eşleşmeyen mutasyona uğramış dizileri atarsa, RNA-seq'in nicel doğruluğunu düşürür^11,12. Ayrıca, RNA transkriptlerinin muazzam kimyasal, uzunluk ve yapısal çeşitliliğinin yanı sıra uzun RNA'ları düzgün bir şekilde parçalamak için araçların olmaması, çoğu RNA-seq yönteminin tüm RNA türlerine^{uygulanabilirliğini azaltır 13}.

AQRNA-seq (mutlak miktar tayini RNA dizileme) yöntemi, kantitatif doğruluğu sınırlayan bu teknik ve biyolojik kısıtlamaların birçoğunu ortadan kaldırmak için geliştirilmiştir⁷. RNA dizileme kütüphanesi hazırlığı sırasında yakalama, ligasyon ve amplifikasyonda diziye bağlı önyargıları en aza indiren AQRNA-seq, diğer yöntemlere kıyasla üstün doğrusallık elde eder ve 963 miRNA'dan oluşan bir referans kütüphanesinin %75'ini 2 kat doğrulukla doğru bir şekilde ölçer. Dizileme okuma sayısı ve RNA bolluğunun bu doğrusal korelasyonu, RNA oligonükleotid standartlarının değişken uzunluklu bir havuzunun analizinde ve kuzey blotlama gibi ortogonal yöntemlere atıfta bulunulduğunda da gözlenir. Dizileme okuma sayısı ve RNA bolluğu arasında doğrusallık oluşturmak, AQRNA-seq'in bir numune içindeki tüm RNA türlerinin doğru ve mutlak miktar tayinini elde etmesini sağlar.

Burada, AQRNA-seq kitaplığı hazırlama iş akışı ve beraberindeki aşağı akış veri analizi işlem hattı için protokolün bir açıklaması yer almaktadır. Yöntem, Mycobacterium bovis bacilli de Calmette et Guérin (BCG) tüberküloz modelinde açlığa bağlı uyku hali ve ardından resüsitasyon sırasında tRNA bolluğunun dinamiklerini aydınlatmak için uygulandı. Dizileme verilerinin keşifsel görselleştirilmesi için sonuçlar, çeşitli fenotiplerle ilişkili tRNA bolluğundaki fark edilebilir kalıpları ortaya çıkaran müteakip kümeleme ve diferansiyel ifade analizleriyle birlikte sunuldu.

Protokol

NOT: Şekil 1 , AQRNA-seq kitaplığının hazırlanmasında yer alan prosedürlerin grafiksel bir gösterimini sağlar. Prosedürde kullanılan reaktifler, kimyasallar ve kolonlar/kitler ile ilgili ayrıntılı bilgi Malzeme Tablosunda bulunabilir. (i) %3 agaroz jel elektroforezi, (ii) biyomoleküllerin numune kalite kontrolü için otomatik elektroforez araçları (Malzeme Tablosuna bakınız) ve (iii) UV-Görünür spektrofotometri ve/veya florometrik miktar tayini kullanılarak giriş RNA numunelerinin saflığı, bütünlüğü ve miktarının kapsamlı bir değerlendirmesinin yapılması önerilir. Aksi belirtilmedikçe tüm reaksiyonların ve ana karışımların buz üzerinde tutulması zorunludur. Raf ömürlerini korumak ve kütüphane ara ürünlerinin çoklu donma-çözülme döngülerini önlemek için reaktifleri (örn. enzimler) soğuk kutularda -20 ° C'lik depolamaya ve bu sıcaklıktan taşıyın.

1. RNA'ların defosforilasyonu

NOT: 5'-fosfatın (P; verici) çıkarılması, RNA'ların 3'-hidroksil'ine (OH; alıcı) kendi kendine bağlanmayı önler. Bağlayıcılar, 3' uçları bir dideoksisitidin (Bağlayıcı 1) veya bir ara parça (Bağlayıcı 2) içerecek şekilde değiştirildiğinden kendi kendini bağlamaz. Bağlayıcılar sadece 5'-P'lerini RNA'ların veya cDNA'ların 3'-OH'sine birleştirerek bağlanabilir.

1. Defosforilasyon reaksiyonunu steril bir PCR tüpünde hazırlayın (ör., 200 μL veya 500 μL tüp) 2 μL'ye kadar RNA örneği, 0.5 μL 40 U/μL RNaz inhibitörü, 1 μL 0.5 μM dahili standart (Tablo 1), 0.5 μL 10x T4 RNA ligaz reaksiyon tamponu, 1 μL 1 U/μL Karides alkalin fosfataz, ve toplam hacmi 5 μL'ye getirmek için yeterli RNaz içermeyen su.
   NOT: Tipik numuneler için, bu protokolü kullanarak küçük RNA'ların miktar tayini için 75 ng RNA (veya 80 nt RNA için yaklaşık 2 pmol) yeterli kabul edilir.
2. RNA'ları fosforile etmek için 37 ° C'de 30 dakika ve daha sonra enzimi inaktive etmek ve RNA'ları denatüre etmek için 65 ° C'de 5 dakika inkübe edin. Renatürasyonu önlemek için numuneleri en az 10 dakika 4 °C'de tutun.

2. Bağlayıcı 1'in RNA'ların 3' ucuna bağlanması

1. 5 μL fosforile edilmiş RNA'lar (adım 1'den ürünler), 0.5 μL 40 U/μL RNaz inhibitörü, 1 μL 100 μM Bağlayıcı 1 (Tablo 1), 3 μL 10 mM ATP, 2.5 μL 10x T4 RNA ligaz reaksiyon tamponu, 15 μL PEG8000 (%50 çözelti), 2 μL 30 U/μL T4 RNA ligaz 1 ve 1 μL RNaz içermeyen su.
   NOT: Numunelerin işlenmesini kolaylaştırmak için reaktifler ana karışım haline getirilebilir. Ana karışıma PEG8000 ve T4 RNA ligaz 1'i dahil etmeyin.
2. Bağlayıcı 1'i RNA'lara bağlamak için 25 ° C'de 2 saat ve daha sonra 16 ° C'de 16 saat inkübe edin.
3. Bağlayıcı-1 bağlı RNA'ları kolonla saflaştırın. DNA/RNA geri kazanımı ve temizliği için bir kit kullanın (Malzeme Tablosuna bakınız).
   NOT: Bu kolon saflaştırma protokolü, aynı kiti kullanan sonraki tüm kolon saflaştırması için geçerlidir. Boya sonlandırıcıları sıralama reaksiyonlarından çıkarmak için jel filtrasyon teknolojisini kullanan kitler (Malzeme Tablosuna bakınız), bu tür kitlerin jel filtreleriyle uyumlu olmadığı PEG8000 burada kullanılamaz. Saflaştırmadan sonra her numuneden bir alikot (1.2 μL) tasarruf edilmesi önerilir. Gerektiğinde, bu alikotlar, ticari bir nükleik asit analizörü çalıştırarak ligasyon verimliliğini kontrol etmek için kullanılabilir. Kalan saflaştırılmış numuneleri daha sonraki adımlara kadar buz üzerinde veya -20 °C'de tutun.
   1. 50 μL'< numune hacmi için, 50 μL'ye getirmek için RNaz içermeyen su ekleyin. Numunenin 1 hacmine 2 hacim oligo bağlayıcı tampon (kitte verilir) ekleyin. Numunenin 1 hacmine 8 hacim %100 etanol ekleyin.
   2. Numuneyi (bir seferde 750 μL'ye kadar) 2 mL'lik bir toplama tüpünün (kitte verilir) içine yerleştirilmiş bir kolona yükleyin. RNA'ları kolona bağlamak için, 30 saniye boyunca 10.000 x g'da santrifüjleyin ve akışı (yani toplama tüpündeki sıvıyı) atın. Sütunu tekrar toplama tüpüne yerleştirin.
   3. Kolondaki yabancı maddeleri yıkamak için, kolona 750 μL DNA yıkama tamponu (kitte verilir) ekleyin. 30 saniye boyunca 10.000 x g'da santrifüjleyin ve akışı atın. Sütunu tekrar toplama tüpüne yerleştirin.
   4. Artık DNA yıkama tamponunu çıkarmak için 1 dakika daha maksimum hızda (örneğin, tezgah üstü mikrosantrifüj için 16.000 x g ) santrifüjleyin.
   5. RNA'ları elüte etmek için, sütunu dikkatlice steril 1.5 mL'lik bir tüpe taşıyın, sütuna RNaz içermeyen su ekleyin. Elüsyon işlemi sırasında potansiyel hacim kaybını hesaba katmak için RNA'ları ayrıştırırken gerekenden daha büyük bir hacim kullanın. Örneğin, bir sonraki adım için 15 μL gerekiyorsa, elüsyon için 17 μL RNaz içermeyen su ekleyin. 30 saniye boyunca 10.000 x g'da santrifüjleyin.

3. Transkripsiyon sonrası metilasyonların AlkB demetilaz ile uzaklaştırılması

NOT: AlkB, DNA ve RNA'daki metillenmiş nükleotidlerin hepsinden olmasa da bazılarından metil gruplarını uzaklaştıran bakteriyel bir enzimdir. RNA'daki çeşitli metillenmiş ribonükleotid türlerinin çıkarılması, daha tam uzunlukta okumalara ve modifikasyon bölgelerinin tanımlanmasına izin vermek için ters transkriptazın düşmesini önler. RNA'ların beklenmedik şekilde bozulmasını önlemek için bu adımın düşük bir pH'da kontrol edilmesi gerekir.

1. 1.4611 g 2-ketoglutarat (M başına 146.11 g) 10 mL RNaz içermeyen suda çözerek 1 M 2-ketoglutarat stok çözeltisi hazırlayın. Filtre, çözeltiyi 0.2 μm'lik bir şırınga filtresinden sterilize eder. Stok solüsyonunu 2 mL steril tüplere alın ve -20 °C'de saklayın.
2. 0.88 g L-askorbik asidi (M başına 176.12 g) 10 mL RNaz içermeyen suda çözerek 0.5 M L-askorbik asitten oluşan bir stok çözeltisi hazırlayın. Filtre, çözeltiyi 0.2 μm'lik bir şırınga filtresinden sterilize eder. Stok solüsyonunu 2 mL steril tüplere alın ve -20 °C'de saklayın.
3. 0.9835 g amonyum demir sülfat hekzahidratı (M başına 392.14 g) 10 mL RNaz içermeyen suda çözerek 0.25 M amonyum demir sülfat hekzahidrattan oluşan bir stok çözeltisi hazırlayın. Filtre, çözeltiyi 0.2 μm'lik bir şırınga filtresinden sterilize eder. Stok solüsyonunu 2 mL steril tüplere alın ve -20 °C'de saklayın.
4. 2.383 g HEPE'yi (M başına 238.30 g) 10 mL RNaz içermeyen suda çözerek 1 M HECES'lik bir stok çözeltisi hazırlayın. NaOH kullanarak çözeltinin pH'ını 8'e ayarlayın ve çözeltiyi 0.2 μm'lik bir şırınga filtresinden filtreyle sterilize edin. Stok solüsyonunu 2 mL steril tüplere alın ve -20 °C'de saklayın.
5. 2x AlkB reaksiyon tamponu hazırlayın. 10 mL tampon yapmak için, 1.5 μL 1 M 2-ketoglutarat (adım 3.1'de yapılır), 80 μL 0.5 M L-askorbik asit (adım 3.2'de yapılır), 6 μL 0.25 M amonyum demir sülfat hekzahidrat (adım 3.3'te yapılır), 100 μL 10 mg / mL BSA, 1000 μL 1 M HEPES (adım 3.4'te yapılır; sonuncu ekleyin), ve 8812.5 μL RNaz içermeyen su. Filtre: tamponu 0,2 μm'lik bir şırınga filtresinden sterilize edin.
   NOT: 2x AlkB reaksiyon tamponu, bileşenlerin kimyasal olarak akışkan olması nedeniyle her deneyden hemen önce taze olarak hazırlanmalıdır.
6. 20 μL Linker-1-bağlı RNA'lar (adım 2'den ürünler), 50 μL 2x AlkB reaksiyon tamponu (adım 3.5'te yapılır), 2 μL AlkB demetilaz, 1 μL RNaz inhibitörü ve 27 μL RNaz içermeyen su ekleyerek steril bir PCR tüpünde AlkB sindirim reaksiyonunu hazırlayın.
7. RNA'lardan transkripsiyon sonrası metilasyonları çıkarmak için oda sıcaklığında 2 saat inkübe edin.
8. AlkB'yi reaksiyondan çıkarmak için aşağıda açıklanan adımları izleyin.
   1. Temiz bir faz ayrımı için, AlkB reaksiyonuna 50 μL RNaz içermeyen su ekleyin ve ardından 100 μL fenol: kloroform: izoamil alkol 25: 24: 1 (pH = 5.2) ekleyin.
   2. Elle 10 saniye çalkalayın ve ardından 16.000 x g'da 10 dakika santrifüjleyin. Tezgah üstü santrifüjün rotorunun PCR tüpleriyle uyumlu olduğundan emin olun. Gerekirse adaptör kullanın.
   3. RNA'ları (yani üstteki sulu tabaka; yaklaşık 140 μL) steril 1.5 mL'lik bir tüpe aktarın. Kloroform (yani alt tabaka) sulu tabakaya karıştırılırsa, aynı ayarlarla tekrar santrifüjleyin.
   4. Artık fenolü uzaklaştırmak için ekstrakte edilen RNA'lara 100 μL kloroform ekleyin. Elle 10 saniye çalkalayın ve ardından 16.000 x g'da 10 dakika santrifüjleyin.
   5. RNA'ları (yani üstteki sulu tabaka; yaklaşık 120 μL) steril 1.5 mL'lik bir tüpe aktarın.
9. Ekstrakte edilen RNA'ları kolonla saflaştırın. DNA/RNA geri kazanımı ve temizliği için bir kit kullanın (Malzeme Tablosuna bakınız). Sütun saflaştırmasını gerçekleştirmek için adım 2.3'te ayrıntılı olarak açıklanan protokolü izleyin.

4. Fazla Bağlayıcının Kaldırılması 1

NOT: Saflaştırmadan sonra her numuneden bir alikot (1.2 μL) saklanması önerilir. Gerektiğinde, bu alikotlar, ticari bir nükleik asit analizörü çalıştırarak RecJf sindiriminin verimliliğini kontrol etmek için kullanılabilir. Transkripsiyonu tersine çevirmek için saflaştırılmış numunelerle hemen devam edin.

1. 15 μL Linker-1 bağlı RNA (adım 3'ten ürünler), 1 μL 40 U/μL RNaz inhibitörü, 2 μL 10x kit tamponu 2 (bkz . Malzeme Tablosu) ve 2 μL 50 U/μL 5'-deadenilaz ekleyerek steril bir PCR tüpünde deadenilasyon reaksiyonunu hazırlayın.
2. Bağlayıcı 1'in 5' ucundaki adenini çıkarmak için 30 ° C'de 1 saat inkübe edin. Deadenilasyon reaksiyonuna 2 μL 30 U/μL RecJf ekleyin.
3. Fazla Bağlayıcı 1'i sindirmek için 37 °C'de 30 dakika inkübe edin. Reaksiyona 2 μL daha 30 U/μL RecJf ekleyin.
4. Fazla Bağlayıcı 1'in sindirimine devam etmek için 37 ° C'de 30 dakika ve ardından enzimi denatüre etmek için 20 dakika boyunca 65 ° C'de inkübe edin.
5. Bağlayıcı-1 bağlı RNA'ları kolonla saflaştırın. Kısa kalıntıları (örneğin, 2 ila 10 bp uzunluğunda oligonükleotidler) uzaklaştırmada etkili olduğundan, boya sonlandırıcılarını sıralama reaksiyonlarından çıkarmak için jel filtreleme teknolojisini kullanan bir kit kullanın (Malzeme Tablosuna bakınız). Arıtma için aşağıda açıklanan adımları izleyin.
   1. Jel filtre kolonlarını üreticinin protokolüne göre hazırlayın. Bir sütunu 1,5 mL'lik steril bir tüpe yerleştirin ve sütuna 24 μL numune yükleyin.
   2. RNA'ları saflaştırmak için, 3 dakika boyunca 800 x g'da santrifüjleyin ve sütunu atın. Saflaştırılmış RNA'lar eluentin içindedir.

5. Ters transkripsiyon (RT) reaksiyonu

NOT: Aşağıdaki RT (Malzeme Tablosuna bakınız) reaksiyon kurulumu, AQRNA-seq uyumluluğuna izin vermek için küçük değişikliklerle üreticinin protokolünü takip eder.

1. 24 μL şablon RNA (adım 4'ten ürünler), 1 μL 2 μM RT primeri (Tablo 1) ve 1 μL dNTP (her nükleotid tipinden 10 mM) ekleyerek RT primer tavlama reaksiyonunu steril bir PCR tüpünde hazırlayın.
2. RT primerlerini şablon RNA'lara tavlamak için 80 ° C'de 2 dakika inkübe edin ve ardından hemen 2 dakika buz üzerinde soğutun.
3. Tavlama reaksiyonu tüpüne 6 μL 5x RT reaksiyon tamponu, 1 μL 40 U/μL RNaz inhibitörü ve 1 μL ters transkriptaz ekleyerek RT reaksiyonunu hazırlayın.
4. RNA şablonlarını ters kopyalamak için 50 ° C'de 2 saat inkübe edin ve ardından enzimi inaktive etmek için 15 dakika boyunca 70 ° C'de inkübe edin. RT ürünleri (yani RNA-cDNA hibritleri) gece boyunca 4 °C veya -20 °C'de saklanabilir.

6. RNA hidrolizi

1. RNA-cDNA hibritine 1 μL 5 M NaOH ekleyin (5. adımdaki ürünler). RNA-cDNA hibritinin RNA zincirini hidrolize etmek için 93 °C'de 3 dakika inkübe edin.
2. Reaksiyonu nötralize etmek için 0.77 μL 5 M HCl ekleyin. HCl ekledikten sonra, karıştırmak için hafifçe vurun ve tüpü aşağı doğru döndürün. Nötralizasyon anlıktır.
   NOT: Tamponlanmış koşullarda 1 μL NaOH'yi nötralize etmek için (örn. pH şeritleri kullanılarak) gerekli olan 5 M HCl'nin kesin miktarının test edilmesi önerilir.
3. Tek sarmallı cDNA'ları sütunla saflaştırın. DNA/RNA geri kazanımı ve temizliği için bir kit kullanın (Malzeme Tablosuna bakınız). Sütun saflaştırmasını gerçekleştirmek için adım 2.3'te ayrıntılı olarak açıklanan protokolü izleyin.
   NOT: Sıralama reaksiyonlarından boya sonlandırıcıları çıkarmak için jel filtreleme teknolojisini kullanan kitler ( Malzeme Tablosuna bakın), önceki adımlardaki pH değişimi nedeniyle burada kullanılamaz.
4. Saflaştırılmış cDNA'ları < 5 μL'ye kadar hızlandırın ve ardından hacmi 5 μL'ye geri getirmek için RNaz içermeyen su ekleyin. cDNA'ları tamamen kuruyana kadar hızlı vakumlamamaya dikkat edin.
5. Saflaştırılmış cDNA'ları steril bir PCR tüpüne aktarın. Saflaştırılmış cDNA'lar -20 °C'de 1 haftaya kadar saklanabilir.

7. Bağlayıcı 2'nin cDNA'ların 3' ucuna bağlanması

1. 5 μL cDNA (6. adımdan ürünler), 1 μL 50 μM Bağlayıcı 2 (Tablo 1), 2 μL 10x T4 DNA ligaz reaksiyon tamponu, 1 μL 10 mM ATP, 9 μL PEG8000 (%50 çözelti) ve 2 μL 400 U/μL T4 DNA ligaz.
   NOT: Numunelerin işlenmesini kolaylaştırmak için reaktifler ana karışım haline getirilebilir. Ana karışıma PEG8000 ve T4 DNA ligaz dahil etmeyin.
2. Bağlayıcı 2'yi cDNA'lara bağlamak için 16 ° C'de 16 saat inkübe edin.
3. Bağlayıcı-2 bağlı cDNA'ları kolonla saflaştırın. DNA/RNA geri kazanımı ve temizliği için bir kit kullanın (Malzeme Tablosuna bakınız). Sütun saflaştırmasını gerçekleştirmek için adım 2.3'te ayrıntılı olarak açıklanan protokolü izleyin.

8. Fazla Bağlayıcı 2'nin Kaldırılması

1. 16 μL Linker-2 ile bağlanmış cDNA, 2 μL 10x kit tamponu 2 ve 2 μL 50 U/μL 5'-deadenilaz ekleyerek steril bir PCR tüpünde deadenilasyon reaksiyonunu hazırlayın. Bağlayıcı 2'nin 5' ucundaki adenin'i çıkarmak için 30 ° C'de 1 saat inkübe edin.
2. Deadenilasyon reaksiyonuna 2 μL 30 U/μL RecJf ekleyin. Fazla Bağlayıcı 2'yi sindirmek için 37 ° C'de 30 dakika inkübe edin. Reaksiyona 2 μL daha 30 U/μL RecJf ekleyin.
3. Fazla Bağlayıcı 2'nin sindirimine devam etmek için 37 ° C'de 30 dakika ve ardından enzimi denatüre etmek için 20 dakika boyunca 65 ° C'de inkübe edin.

9. Dizileme primerleri ile cDNA'ların PCR amplifikasyonu

1. Numunelere PCR primerleri atayın. Her numune, etkili çoğullama için benzersiz bir ileri ve geri primer kombinasyonuna ihtiyaç duyar (Tablo 1).
2. Numune hacmini 25 μL'ye getirmek için RNaz içermeyen su ekleyin. PCR'nin tekrarlanması gerekmesi durumunda yedek olarak her numuneden 5 μL'yi steril bir PCR tüpüne kaydedin.
3. 20 μL cDNA (8. adımdaki ürünler), 1 μL 2.5 μM ileri astar, 1 μL 2.5 μM ters astar, 25 μL 2x DNA polimeraz tamponu, 2 μL RNaz içermeyen su ve 1 μL DNA polimeraz ekleyerek PCR reaksiyonunu hazırlayın (PCR kiti için Malzeme Tablosuna bakın).
   NOT: Numunelerin işlenmesini kolaylaştırmak için reaktifler ana karışım haline getirilebilir. Ana karışıma DNA polimeraz eklemeyin.
4. 1 dakika boyunca 94 ° C'de ilk denatürasyon ile PCR gerçekleştirin, ardından 20 saniye boyunca 98 ° C'de 18 döngü denatürasyon yapın - 20 saniye boyunca 58 ° C'de tavlama - 68 ° C'de 1 dakika uzatma.
   NOT: PCR'yi doğrusal aralığın ötesine yükseltmeyin. Çoğu deney için toplam 18 döngü en uygun olacaktır, ancak bu bağlama bağlı olabilir.
5. PCR ürünlerini 25 μL'nin altına hızlı bir şekilde vakumlayın ve ardından hacmi 25 μL'ye geri getirmek için RNaz içermeyen su ekleyin. Boyut dağılımını kontrol etmek için 5 μL PCR ürününü steril 0,5 mL'lik bir tüpe aktarın (bkz. adım 9.6). Kalan 20 μL PCR ürünlerini sonraki adımlara kadar -20 °C'de saklayın.
6. PCR ürünlerinin boyut dağılımını aşağıda açıklandığı gibi kontrol edin.
   1. TAE tamponunda% 3 agaroz jeli hazırlayın.
      NOT: Bu protokolde, elektroforez sonrası jel boyama için etidyum bromür (EtBr) kullanılır (bkz. adım 9.6.5). Bu aşamada jel çözeltisine uygun DNA boyaları eklenebilir veya daha sonra jel boyama için kullanılabilir.
   2. 1 μL 6x yükleme boyasını 5 μL PCR ürününe (adım 9.5'ten itibaren) karıştırın ve jeli karışımla doldurun.
   3. İlk numuneden önce kuyuya ve son numuneden sonra kuyuya 5 μL DNA merdiveni yükleyin. PCR ürünlerinin 150 bp ile 300 bp arasında daha iyi boyut ayrımına izin vermek için 50 bp veya 100 bp DNA merdivenleri kullanın.
   4. PCR ürünlerini bulmak için jel elektroforezini çalıştırın. Uygun çalışma koşulu bağlama bağlı olabilir. Burada, 17,78 cm (genişlik) x 10,16 cm (yükseklik) x 1 cm (kalınlık) jel levha için 120 V, 400 mA'da 75 dakika çalıştırın.
   5. Jeli bir kutuya yerleştirin ve jel tamamen daldırılana kadar kutuyu deiyonize (DI) su ile doldurun. Jeli ıslatarak DI suyuna 10 μL EtBr ekleyin. Kutuyu folyo ile sarın ve bir çalkalayıcı üzerine yerleştirin. Çalkalarken jeli 30 dakika boyunca boyayın.
   6. EtBr içeren atıkları çeker ocak içine yerleştirilmiş bir atık şişesine atın. Jeli DI suyla bir kez durulayın ve EtBr içeren suyu atık şişesine atın.
   7. Jel tamamen daldırılana kadar kutuyu DI suyla doldurun. Kutuyu folyo ile sarın ve bir çalkalayıcı üzerine yerleştirin. Jeli çalkalarken 10 dakika yıkayın.
   8. EtBr içeren suyu çeker ocaktaki atık şişesine atın. Bantları görselleştirmek için bir jel görüntüleyici kullanın. Jelin yüksek çözünürlüklü bir görüntüsünü elde edin.

10. Jel saflaştırma

1. TAE tamponunda% 3 agaroz jeli hazırlayın. Geniş taraklarla (1 mm kalınlık; 5 mm genişlik; 15 mm derinlik) 1 cm kalınlığında bir jel yapın, böylece her bir kuyucuk en az 25 μL numune yükleme boya karışımı içerebilir.
2. 4 μL 6x yükleme boyasını 20 μL PCR ürünleriyle (adım 9.5'ten itibaren) karıştırın ve jeli karışımla doldurun. Jel eksizyonu sırasında çapraz kontaminasyonu en aza indirmek için numuneler arasında boş şeritler bırakın.
3. DNA merdivenlerini yükleyin, jel elektroforezini çalıştırın, jeli boyayın ve yıkayın ve adım 9.6'da açıklandığı gibi jel görüntüleri alın.
4. Hedef boyut aralığında PCR ürünleri içeren jel bloklarını çıkarın. Astar dimerleri (insertsiz 175 bp bağlayıcılar) ile kontaminasyonu en aza indirmek için, boyutu 195 bp'nin üzerinde olan PCR ürünlerini çıkarın (175 bp bağlayıcılar + 20 bp miRNA).
5. Jel ekstraksiyonu kullanarak PCR ürünlerini saflaştırın. Bir jel ekstraksiyon kiti kullanın (Malzeme Tablosuna bakınız). Saflaştırma protokolü, AQRNA-seq uyumluluğu için küçük değişikliklerle birlikte üreticinin protokolüne dayanmaktadır. Tüm santrifüjleme adımları, aksi belirtilmedikçe, oda sıcaklığında bir tezgah üstü santrifüj kullanılarak 1 dakika boyunca 17.900 x g'da gerçekleştirilmelidir. Aşağıda açıklanan adımları izleyin.
   1. Tüplerin içindeki jel blokların ağırlığını ölçün. 1 hacim jel bloğa (1 mg jel yaklaşık 1 μL'dir) 6 hacim Tampon QG (kitte verilir) ekleyin.
   2. 50 ° C'de 10 dakika veya jel blokları tamamen çözünene kadar inkübe edin. Jel çözünmesini kolaylaştırmak için her 2 dakikada bir vorteks tüpleri. Jeli çözdükten sonra, karışım çözünmüş jel olmadan Buffer QG'nin rengine benzemelidir. Renk turuncu veya mor ise, 10 μL 3 M sodyum asetat (pH = 5.0) ekleyin ve iyice karıştırın.
   3. Karışıma 1 jel hacimde izopropanol ekleyin ve iyice karıştırın. 2 mL'lik bir toplama tüpüne (kitte verilir) bir döndürme sütunu yerleştirin.
   4. DNA'yı bağlamak için numuneyi (her seferinde 750 μL'ye kadar) kolona ve santrifüje uygulayın. Akışı atın ve sütunu aynı toplama tüpüne geri yerleştirin. Sıkma kolonu başına maksimum jel miktarı 400 mg'dır.
   5. Kolona ve santrifüje 500 μL Tampon QG ekleyin. Akışı atın ve sütunu aynı toplama tüpüne geri yerleştirin.
   6. Kirleri yıkamak için, kolona 750 μL Tampon PE (kitte verilir) ekleyin, kolonu 5 dakika bekletin ve santrifüjleyin. Akışı atın ve sütunu aynı toplama tüpüne geri yerleştirin. Kalan yıkama tamponunu çıkarmak için bir kez daha santrifüjleyin.
   7. Kolonu 1,5 mL'lik steril bir tüpe yerleştirin. DNA'yı elüte etmek için, kolon zarının ortasına 30 μL Tampon EB (kitte verilir) ekleyin, kolonun 4 dakika bekletilmesine izin verin ve santrifüjleyin.
   8. Jel ile saflaştırılmış PCR ürünlerini 12 μL Tampon EB içinde hızlandırın ve yeniden süspanse edin.
6. Oluşturulan kitaplıkların konsantrasyonunu UV-Görünür spektrofotometri ve/veya florometrik miktar tayini ile ölçün.

11. Kütüphane sıralaması

1. Oluşturulan kitaplıkları kalite değerlendirmesi ve Illumina dizilemesi için harici bir sıralama merkezine gönderin. Küçük RNA manzaralarının kantitatif haritalanmasında yeterli hassasiyeti sağlamak için, her yönden 75 bp okumalı (yani PE75) eşleştirilmiş uçlu dizilemeyi tercih edin ve her numune için her yönde en az 1,5 M ham dizi okumasını hedefleyin. NextSeq dizilimi için özel astarlar (Tablo 1) kullanın, ancak bu, MiSeq'te sıralama için isteğe bağlıdır.
   NOT: Sıralama, MiSeq veya NextSeq500 platformları kullanılarak gerçekleştirilebilir. Platform seçimi, numunelerin doğasına ve toplam numune sayısına bağlı olabilir.

12. Veri analizi boru hattı

NOT: Şekil 2 , ham dizi okumalarını (FASTQ biçiminde) girdi olarak alan ve ilgilenilen küçük RNA türlerinin üyelerini temsil eden satırlar ve örnekleri temsil eden sütunlar içeren bir bolluk matrisi oluşturan veri analitiği boru hattında yer alan basitleştirilmiş prosedürlerin grafiksel bir gösterimini sağlar. Eşleştirilmiş uç sıralaması için her örnek, biri ileri okumalar ve diğeri geri okumalar için olmak üzere iki FASTQ dosyasına karşılık gelir. Tüm ilişkili komut dosyaları ve her adım için kapsamlı ek açıklamalar içeren bir kılavuzla birlikte eksiksiz veri analizi işlem hattı GitHub'da (https://github.com/Chenrx9293/AQRNA-seq-JoVE.git) mevcuttur.

1. Harici sıralama merkezinden ham dizi okumalarını alın ve FastQC¹⁴ veya fastp¹⁵ gibi açık kaynaklı programları kullanarak sıralama kalitesini değerlendirin.
2. FASTA formatında bir referans dizisi kitaplığı oluşturun.
   NOT: Boru hattının çeşitli küçük RNA sınıflarına uyarlanabilirliğinin anahtarı, uygun bir referans dizisi kitaplığıdır. Belirli RNA ilgili sınıflarının (örneğin, miRNA) üyelerinin doğru bolluk tahminlerini elde etmek için, kullanıcıların boru hattıyla kullanılmak üzere bir referans dizisi kitaplığını titizlikle seçmeleri beklenir. Boru hattı yürütme için diğer tüm talimatlar, farklı küçük RNA sınıfları arasında tutarlı kalır.
3. Veri analizi işlem hattını uygulamak için AQRNA-seq adlı bir dizin oluşturun ve tüm komut dosyalarını, kalite filtrelenmiş dizi okumalarını ve referans dizisi kitaplığını bu dizine yerleştirin. Farklı organizmaları ve/veya küçük RNA türlerini hedeflemek için alt dizinler hazırlamak ve dosyalarda önemli değişiklikler yapmak için GitHub'daki (https://github.com/Chenrx9293/AQRNA-seq-JoVE.git) ayrıntılı talimatları izleyin, ayrıca işletim sistemi ve/veya iş zamanlayıcının uyumluluğunu izleyin.
4. Açıklamaları, giriş ve çıkış dosyalarını ve her adım için komut satırlarını içeren GitHub'daki (https://github.com/Chenrx9293/AQRNA-seq-JoVE.git) kılavuzda özetlenen adımları izleyerek veri analizi işlem hattını uygulayın. Özetle, boru hattı (i) okumalardan bağlayıcı dizilerinin ve rastgele nükleotidlerin kırpılmasını, (ii) uzunluklarına göre okumaların filtrelenmesini, (iii) okumaların referans dizileriyle eşlenmesini, (iv) belirsiz eşlemelerin çözülmesini ve (v) bolluk matrisinin oluşturulmasını kapsar.

Sonuçlar

Mikobakteri bovis Üstel büyüme geçiren BCG (bacilli de Calmette et Guérin) suşu 1173P2, bir zaman serisine (0, 4, 10 ve 20 gün) besin açlığına tabi tutuldu, ardından daha önce Hu ve ^ark.7'de sunulduğu gibi besin açısından zengin ortamda 6 günlük bir resüsitasyon izledi. Küçük RNA'lar, belirlenen beş zaman noktasının her birinde üç biyolojik kopya ile bakteri kültüründen izole edildi. Illumina kütüphaneleri, yukarıda açıklanan AQRNA-seq kütüphane hazı...

Tartışmalar

AQRNA-seq kütüphanesi hazırlama iş akışı, bir numune içindeki RNA'ların yakalanmasını en üst düzeye çıkarmak ve ters transkripsiyon 7 sırasında polimeraz düşüşünü en aza indirmek için^{tasarlanmıştır.} İki aşamalı bir bağlayıcı ligasyonu yoluyla, yeni DNA oligoları (Bağlayıcı 1 ve Bağlayıcı 2), numune içindeki RNA'yı tam olarak tamamlamak için fazla miktarda bağlanır. Fazla bağlayıcılar, tek sarmallı DNA'lara özgü 5' ila 3' eksonükleaz olan RecJf il...

Malzemeler

Name	Company	Catalog Number	Comments
2-ketoglutarate	Sigma-Aldrich	75890	Prepare a working solution (1 M) and store it at -20ºC
2100 Bioanalyzer Instrument	Agilent	G2938C
Adenosine 5'-Triphosphate (ATP)	New England Biolabs	M0437M (component #: N0437AVIAL)	NEB M0437M contains T4 RNA Ligase 1 (30 U/μL), T4 RNA Ligase Reaction Buffer (10X), PEG 8000 (1X), and ATP (100 mM); prepare a working solution (10 mM) and store it at -20ºC
AGAROSE GPG/LE	AmericanBio	AB00972-00500	Store at ambient temperature
Ammonium iron(II) sulfate hexahydrate	Sigma-Aldrich	F2262	Prepare a working solution (0.25 M) and store it at -20 °C
Bioanalyzer Small RNA Analysis	Agilent	5067-1548	The Small RNA Analysis is used for checking the quality of input RNAs and the efficiency of enzymatic reactions (e.g., Linker 1 ligation)
Bovine Serum Albumin (BSA; 10 mg/mL)	New England Biolabs	B9000	This product was discontinued on 12/15/2022 and is replaced with Recombinant Albumin, Molecular Biology Grade (NEB B9200).
Chloroform	Macron Fine Chemicals	4441-10
Demethylase	ArrayStar	AS-FS-004	Demethylase comes with the rtStar tRNA Pretreatment & First-Strand cDNA Synthesis Kit (AS-FS-004)
Deoxynucleotide (dNTP) Solution Mix	New England Biolabs	N0447L (component #: N0447LVIAL)	This dNTP Solution Mix contains equimolar concentrations of dATP, dCTP, dGTP and dTTP (10 mM each)
Digital Dual Heat Block	VWR Scientific Products	13259-052	Heating block is used with the QIAquick Gel Extraction Kit
DyeEx 2.0 Spin Kit	Qiagen	63204	Effective at removing short remnants (e.g., oligos less than 10 bp in length)
Electrophoresis Power Supply	Bio-Rad Labrotories	PowerPac 300
Eppendorf PCR Tubes (0.5 mL)	Eppendorf	0030124537
Eppendorf Safe-Lock Tubes (0.5 mL)	Eppendorf	022363611
Eppendorf Safe-Lock Tubes (1.5 mL)	Eppendorf	022363204
Eppendorf Safe-Lock Tubes (2 mL)	Eppendorf	022363352
Ethyl alcohol (Ethanol), Pure	Sigma-Aldrich	E7023	The pure ethanol is used with the Oligo Clean and Concentrator Kit from Zymo Research
Gel Imaging System	Alpha Innotech	FluorChem 8900
Gel Loading Dye, Purple (6X), no SDS	New England Biolabs	N0556S (component #: B7025SVIAL)	NEB N0556S contains Quick-Load Purple 50 bp DNA Ladder and Gel Loading Dye, Purple (6X), no SDS
GENESYS 180 UV-Vis Spectrophotometer	Thermo Fisher Scientific	840-309000	The spectrophotometer is used for measuring the oligo concentrations using the Beer's law
HEPES	Sigma-Aldrich	H4034	Prepare a working solution (1 M; pH = 8 with NaOH) and store it at -20 °C
Hydrochloric acid (HCl)	VWR Scientific Products	BDH3028	Prepare a working solution (5 M) and store it at ambient temperature
Isopropyl Alcohol (Isopropanol), Pure	Macron Fine Chemicals	3032-16	Isopropanol is used with the QIAquick Gel Extraction Kit
L-Ascorbic acid	Sigma-Aldrich	A5960	Prepare a working solution (0.5 M) and store it at -20ºC
Microcentrifuge	Eppendorf	5415D
NanoDrop 2000 Spectrophotometer	Thermo Fisher Scientific	ND-2000
NEBuffer 2 (10X)	New England Biolabs	M0264L (component #: B7002SVIAL)	NEB M0264L contains RecJf (30 U/μL) and NEBuffer 2 (10X); store at -20 °C
Nuclease-Free Water (not DEPC-Treated)	Thermo Fisher Scientific	AM9938
Oligo Clean & Concentrator Kit	Zymo Research	D4061	Store at ambient temperature
PEG 8000 (50% solution)	New England Biolabs	M0437M (component #: B1004SVIAL)	NEB M0437M contains T4 RNA Ligase 1 (30 U/μL), T4 RNA Ligase Reaction Buffer (10X), PEG 8000 (1X), and ATP (100 mM); prepare a working solution (10 mM) and store it at -20ºC
Peltier Thermal Cycler	MJ Research	PTC-200
Phenol:choloroform:isoamyl alcohol 25:24:1 pH = 5.2	Thermo Fisher Scientific	J62336
PrimeScript Buffer (5X)	TaKaRa	2680A
PrimeScript Reverse Transcriptase	TaKaRa	2680A
QIAquick Gel Extraction Kit	Qiagen	28704	This kit requires a heating block and isopropanol to work with
Quick-Load Purple 100 bp DNA Ladder	New England Biolabs	N0551S (component #: N0551SVIAL)
Quick-Load Purple 50 bp DNA Ladder	New England Biolabs	N0556S (component #: N0556SVIAL)	NEB N0556S contains Quick-Load Purple 50 bp DNA Ladder and Gel Loading Dye, Purple (6X), no SDS
RecJf (30 U/μL)	New England Biolabs	M0264L (component #: M0264LVIAL)	NEB M0264L contains RecJf (30 U/μL) and NEBuffer 2 (10X); store at -20 °C
RNase Inhibitor (murine; 40 U/μL)	New England Biolabs	M0314L (component #: M0314LVIAL)	Store at -20 °C
SeqAMP DNA Polymerase	TaKaRa	638509	TaKaRa 638509 contains SeqAMP DNA Polymerase and SeqAMP PCR Buffer (2X)
SeqAMP PCR Buffer (2X)	TaKaRa	638509	TaKaRa 638509 contains SeqAMP DNA Polymerase and SeqAMP PCR Buffer (2X)
Shrimp Alkaline Phosphatase (1 U/μL)	New England Biolabs	M0371L (component #: M0371LVIAL)
Sodium hydroxide (NaOH)	Sigma-Aldrich	S5881	Prepare a working solution (5 M) and store it at ambient temperature
T4 DNA Ligase (400 U/μL)	New England Biolabs	M0202L (component #: M0202LVIAL)	NEB M0202L contains T4 DNA Ligase (400 U/μL) and T4 DNA Ligase Reaction Buffer (10X)
T4 DNA Ligase Reaction Buffer (10X)	New England Biolabs	M0202L (component #: B0202SVIAL)	NEB M0202L contains T4 DNA Ligase (400 U/μL) and T4 DNA Ligase Reaction Buffer (10X)
T4 RNA Ligase 1 (30 U/μL)	New England Biolabs	M0437M (component #: M0437MVIAL)	NEB M0437M contains T4 RNA Ligase 1 (30 U/μL), T4 RNA Ligase Reaction Buffer (10X), PEG 8000 (1X), and ATP (100 mM)
T4 RNA Ligase Reaction Buffer (10X)	New England Biolabs	M0437M (component #: B0216SVIAL)	NEB M0437M contains T4 RNA Ligase 1 (30 U/μL), T4 RNA Ligase Reaction Buffer (10X), PEG 8000 (1X), and ATP (100 mM)