AQRNA-seq per la quantificazione di piccoli RNA

Riepilogo

Il sequenziamento dell'RNA a quantificazione assoluta (AQRNA-seq) è una tecnologia sviluppata per quantificare il panorama di tutti i piccoli RNA nelle miscele biologiche. Qui, vengono dimostrate sia le fasi di preparazione della libreria che quelle di elaborazione dei dati di AQRNA-seq, quantificando i cambiamenti nel pool di RNA di trasferimento (tRNA) in Mycobacterium bovis BCG durante la dormienza indotta dalla fame.

Abstract

AQRNA-seq fornisce una relazione lineare diretta tra i conteggi delle letture di sequenziamento e i piccoli numeri di copie di RNA in un campione biologico, consentendo così una quantificazione accurata del pool di piccoli RNA. La procedura di preparazione della libreria AQRNA-seq qui descritta prevede l'uso di linker di sequenziamento progettati su misura e un passaggio per ridurre le modifiche dell'RNA di metilazione che bloccano la processività della trascrizione inversa, con conseguente aumento della resa di cDNA a lunghezza intera. Inoltre, viene presentata un'implementazione dettagliata della pipeline bioinformatica di accompagnamento. Questa dimostrazione di AQRNA-seq è stata condotta attraverso un'analisi quantitativa dei 45 tRNA in Mycobacterium bovis BCG raccolti in 5 giorni selezionati in un corso di 20 giorni di privazione di nutrienti e 6 giorni di rianimazione. In questa sede verranno discussi anche gli sforzi in corso per migliorare l'efficienza e il rigore di AQRNA-seq. Ciò include l'esplorazione di metodi per ovviare alla purificazione del gel per mitigare i problemi del dimero del primer dopo l'amplificazione della PCR e per aumentare la percentuale di letture a lunghezza intera per consentire una mappatura delle letture più accurata. I futuri miglioramenti di AQRNA-seq si concentreranno sulla facilitazione dell'automazione e dell'implementazione ad alto rendimento di questa tecnologia per quantificare tutte le piccole specie di RNA in campioni di cellule e tessuti provenienti da diversi organismi.

Introduzione

Il sequenziamento di nuova generazione (NGS), noto anche come sequenziamento massivamente parallelo, è una tecnologia di sequenziamento del DNA che prevede la frammentazione del DNA, la legatura degli oligonucleotidi adattatori, l'amplificazione basata sulla reazione a catena della polimerasi (PCR), il sequenziamento del DNA e il riassemblaggio delle sequenze di frammenti in un genoma. L'adattamento dell'NGS all'RNA di sequenza (RNA-seq) è un approccio potente per identificare e quantificare i trascritti di RNA e le loro varianti¹. Gli sviluppi innovativi nei flussi di lavoro per la preparazione delle librerie di RNA e nelle pipeline di analisi....

Protocollo

NOTA: La Figura 1 fornisce un'illustrazione grafica delle procedure coinvolte nella preparazione della libreria AQRNA-seq. Informazioni dettagliate sui reagenti, le sostanze chimiche e le colonne/kit utilizzati nella procedura sono disponibili nella Tabella dei materiali. Si raccomanda di eseguire una valutazione completa della purezza, dell'integrità e della quantità dei campioni di RNA in ingresso utilizzando (i) l'elettroforesi su gel di agarosio al 3%, (ii) strumenti di elettroforesi automatizzati per il controllo della qualità dei campioni di biomolecole (vedere la Tabella dei materiali) e (iii) la s....

Discussione

Il flusso di lavoro di preparazione della libreria AQRNA-seq è progettato per massimizzare la cattura di RNA all'interno di un campione e ridurre al minimo la caduta della polimerasi durante la trascrizione inversa⁷. Attraverso una legatura del linker in due fasi, i nuovi oligo di DNA (Linker 1 e Linker 2) vengono legati in eccesso per completare completamente l'RNA all'interno del campione. I linker in eccesso possono essere rimossi in modo efficiente con RecJf, un'esonucleasi da 5' a 3' specifi.......

Materiali

Name	Company	Catalog Number	Comments
2-ketoglutarate	Sigma-Aldrich	75890	Prepare a working solution (1 M) and store it at -20ºC
2100 Bioanalyzer Instrument	Agilent	G2938C
5'-deadenylase (50 U/μL)	New England Biolabs	M0331S (component #: M0331SVIAL)	Store at -20 °C
Adenosine 5'-Triphosphate (ATP)	New England Biolabs	M0437M (component #: N0437AVIAL)	NEB M0437M contains T4 RNA Ligase 1 (30 U/μL), T4 RNA Ligase Reaction Buffer (10X), PEG 8000 (1X), and ATP (100 mM); prepare a working solution (10 mM) and store it at -20ºC
AGAROSE GPG/LE	AmericanBio	AB00972-00500	Store at ambient temperature
Ammonium iron(II) sulfate hexahydrate	Sigma-Aldrich	F2262	Prepare a working solution (0.25 M) and store it at -20 °C
Bioanalyzer Small RNA Analysis	Agilent	5067-1548	The Small RNA Analysis is used for checking the quality of input RNAs and the efficiency of enzymatic reactions (e.g., Linker 1 ligation)
Bovine Serum Albumin (BSA; 10 mg/mL)	New England Biolabs	B9000	This product was discontinued on 12/15/2022 and is replaced with Recombinant Albumin, Molecular Biology Grade (NEB B9200).
Chloroform	Macron Fine Chemicals	4441-10
Demethylase	ArrayStar	AS-FS-004	Demethylase comes with the rtStar tRNA Pretreatment & First-Strand cDNA Synthesis Kit (AS-FS-004)
Deoxynucleotide (dNTP) Solution Mix	New England Biolabs	N0447L (component #: N0447LVIAL)	This dNTP Solution Mix contains equimolar concentrations of dATP, dCTP, dGTP and dTTP (10 mM each)
Digital Dual Heat Block	VWR Scientific Products	13259-052	Heating block is used with the QIAquick Gel Extraction Kit
DyeEx 2.0 Spin Kit	Qiagen	63204	Effective at removing short remnants (e.g., oligos less than 10 bp in length)
Electrophoresis Power Supply	Bio-Rad Labrotories	PowerPac 300
Eppendorf PCR Tubes (0.5 mL)	Eppendorf	0030124537
Eppendorf Safe-Lock Tubes (0.5 mL)	Eppendorf	022363611
Eppendorf Safe-Lock Tubes (1.5 mL)	Eppendorf	022363204
Eppendorf Safe-Lock Tubes (2 mL)	Eppendorf	022363352
Ethyl alcohol (Ethanol), Pure	Sigma-Aldrich	E7023	The pure ethanol is used with the Oligo Clean and Concentrator Kit from Zymo Research
Gel Imaging System	Alpha Innotech	FluorChem 8900
Gel Loading Dye, Purple (6X), no SDS	New England Biolabs	N0556S (component #: B7025SVIAL)	NEB N0556S contains Quick-Load Purple 50 bp DNA Ladder and Gel Loading Dye, Purple (6X), no SDS
GENESYS 180 UV-Vis Spectrophotometer	Thermo Fisher Scientific	840-309000	The spectrophotometer is used for measuring the oligo concentrations using the Beer's law
HEPES	Sigma-Aldrich	H4034	Prepare a working solution (1 M; pH = 8 with NaOH) and store it at -20 °C
Hydrochloric acid (HCl)	VWR Scientific Products	BDH3028	Prepare a working solution (5 M) and store it at ambient temperature
Isopropyl Alcohol (Isopropanol), Pure	Macron Fine Chemicals	3032-16	Isopropanol is used with the QIAquick Gel Extraction Kit
L-Ascorbic acid	Sigma-Aldrich	A5960	Prepare a working solution (0.5 M) and store it at -20ºC
Microcentrifuge	Eppendorf	5415D
NanoDrop 2000 Spectrophotometer	Thermo Fisher Scientific	ND-2000
NEBuffer 2 (10X)	New England Biolabs	M0264L (component #: B7002SVIAL)	NEB M0264L contains RecJf (30 U/μL) and NEBuffer 2 (10X); store at -20 °C
Nuclease-Free Water (not DEPC-Treated)	Thermo Fisher Scientific	AM9938
Oligo Clean & Concentrator Kit	Zymo Research	D4061	Store at ambient temperature
PEG 8000 (50% solution)	New England Biolabs	M0437M (component #: B1004SVIAL)	NEB M0437M contains T4 RNA Ligase 1 (30 U/μL), T4 RNA Ligase Reaction Buffer (10X), PEG 8000 (1X), and ATP (100 mM); prepare a working solution (10 mM) and store it at -20ºC
Peltier Thermal Cycler	MJ Research	PTC-200
Phenol:choloroform:isoamyl alcohol 25:24:1 pH = 5.2	Thermo Fisher Scientific	J62336
PrimeScript Buffer (5X)	TaKaRa	2680A
PrimeScript Reverse Transcriptase	TaKaRa	2680A
QIAquick Gel Extraction Kit	Qiagen	28704	This kit requires a heating block and isopropanol to work with
Quick-Load Purple 100 bp DNA Ladder	New England Biolabs	N0551S (component #: N0551SVIAL)
Quick-Load Purple 50 bp DNA Ladder	New England Biolabs	N0556S (component #: N0556SVIAL)	NEB N0556S contains Quick-Load Purple 50 bp DNA Ladder and Gel Loading Dye, Purple (6X), no SDS
RecJf (30 U/μL)	New England Biolabs	M0264L (component #: M0264LVIAL)	NEB M0264L contains RecJf (30 U/μL) and NEBuffer 2 (10X); store at -20 °C
RNase Inhibitor (murine; 40 U/μL)	New England Biolabs	M0314L (component #: M0314LVIAL)	Store at -20 °C
SeqAMP DNA Polymerase	TaKaRa	638509	TaKaRa 638509 contains SeqAMP DNA Polymerase and SeqAMP PCR Buffer (2X)
SeqAMP PCR Buffer (2X)	TaKaRa	638509	TaKaRa 638509 contains SeqAMP DNA Polymerase and SeqAMP PCR Buffer (2X)
Shrimp Alkaline Phosphatase (1 U/μL)	New England Biolabs	M0371L (component #: M0371LVIAL)
Sodium hydroxide (NaOH)	Sigma-Aldrich	S5881	Prepare a working solution (5 M) and store it at ambient temperature
T4 DNA Ligase (400 U/μL)	New England Biolabs	M0202L (component #: M0202LVIAL)	NEB M0202L contains T4 DNA Ligase (400 U/μL) and T4 DNA Ligase Reaction Buffer (10X)
T4 DNA Ligase Reaction Buffer (10X)	New England Biolabs	M0202L (component #: B0202SVIAL)	NEB M0202L contains T4 DNA Ligase (400 U/μL) and T4 DNA Ligase Reaction Buffer (10X)
T4 RNA Ligase 1 (30 U/μL)	New England Biolabs	M0437M (component #: M0437MVIAL)	NEB M0437M contains T4 RNA Ligase 1 (30 U/μL), T4 RNA Ligase Reaction Buffer (10X), PEG 8000 (1X), and ATP (100 mM)
T4 RNA Ligase Reaction Buffer (10X)	New England Biolabs	M0437M (component #: B0216SVIAL)	NEB M0437M contains T4 RNA Ligase 1 (30 U/μL), T4 RNA Ligase Reaction Buffer (10X), PEG 8000 (1X), and ATP (100 mM)