AQRNA-seq pour la quantification de petits ARN

Résumé

Le séquençage de l’ARN par quantification absolue (AQRNA-seq) est une technologie développée pour quantifier le paysage de tous les petits ARN dans les mélanges biologiques. Ici, les étapes de préparation de la bibliothèque et de traitement des données d’AQRNA-seq sont démontrées, quantifiant les changements dans le pool d’ARN de transfert (ARNt) chez Mycobacterium bovis BCG pendant la dormance induite par la famine.

Résumé

AQRNA-seq fournit une relation linéaire directe entre le nombre de lectures de séquençage et le petit nombre de copies d’ARN dans un échantillon biologique, permettant ainsi une quantification précise du pool de petits ARN. La procédure de préparation de la banque AQRNA-seq décrite ici implique l’utilisation de liaisons de séquençage conçues sur mesure et une étape pour réduire les modifications de l’ARN de méthylation qui bloquent la processivité de la transcription inverse, ce qui entraîne une augmentation du rendement d’ADNc de pleine longueur. En outre, une mise en œuvre détaillée du pipeline bioinformatique qui l’accompagne est présentée. Cette démonstration de l’AQRNA-seq a été réalisée au moyen d’une analyse quantitative des 45 ARNt de Mycobacterium bovis BCG récoltés pendant 5 jours choisis au cours d’une période de 20 jours de privation de nutriments et de 6 jours de réanimation. Les efforts en cours pour améliorer l’efficacité et la rigueur d’AQRNA-seq seront également abordés ici. Il s’agit notamment d’explorer des méthodes permettant d’éviter la purification sur gel afin d’atténuer les problèmes de dimères d’amorce après l’amplification par PCR et d’augmenter la proportion de lectures sur toute la longueur afin de permettre une cartographie de lecture plus précise. Les améliorations futures d’AQRNA-seq seront axées sur la facilitation de l’automatisation et de la mise en œuvre à haut débit de cette technologie pour quantifier toutes les petites espèces d’ARN dans des échantillons de cellules et de tissus provenant de divers organismes.

Introduction

Le séquençage de nouvelle génération (NGS), également connu sous le nom de séquençage massivement parallèle, est une technologie de séquençage de l’ADN qui implique la fragmentation de l’ADN, la ligature d’oligonucléotides adaptateurs, l’amplification basée sur la réaction en chaîne par polymérase (PCR), le séquençage de l’ADN et le réassemblage des séquences de fragments dans un génome. L’adaptation du NGS à l’ARN séquencé (RNA-seq) est une approche puissante pour identifier et quantifier les transcrits d’ARN et leurs variants¹. Des développements innovants dans les flux de travail de préparation de banques d’ARN et les pipelines d’analyse bio....

Protocole

REMARQUE : La figure 1 fournit une illustration graphique des procédures impliquées dans la préparation de la bibliothèque AQRNA-seq. Des informations détaillées concernant les réactifs, les produits chimiques et les colonnes/kits utilisés dans la procédure se trouvent dans la table des matériaux. Il est recommandé d’effectuer une évaluation complète de la pureté, de l’intégrité et de la quantité des échantillons d’ARN d’entrée à l’aide (i) d’une électrophorèse sur gel d’agarose à 3 %, (ii) d’outils d’électrophorèse automatisés pour le contrôle de la qualité des échantillons de biomolécules (voir le tableau des ma....

Discussion

Le flux de travail de préparation de la banque AQRNA-seq est conçu pour maximiser la capture d’ARN dans un échantillon et minimiser la chute de polymérase lors de la transcription inverse⁷. Grâce à une ligature de liaison en deux étapes, de nouveaux oligonucléotides d’ADN (Linker 1 et Linker 2) sont ligaturés en excès pour compléter pleinement l’ARN de l’échantillon. Les agents de liaison en excès peuvent être éliminés efficacement avec RecJf, une exonucléase de 5' à 3' s.......

matériels

Name	Company	Catalog Number	Comments
2-ketoglutarate	Sigma-Aldrich	75890	Prepare a working solution (1 M) and store it at -20ºC
2100 Bioanalyzer Instrument	Agilent	G2938C
5'-deadenylase (50 U/μL)	New England Biolabs	M0331S (component #: M0331SVIAL)	Store at -20 °C
Adenosine 5'-Triphosphate (ATP)	New England Biolabs	M0437M (component #: N0437AVIAL)	NEB M0437M contains T4 RNA Ligase 1 (30 U/μL), T4 RNA Ligase Reaction Buffer (10X), PEG 8000 (1X), and ATP (100 mM); prepare a working solution (10 mM) and store it at -20ºC
AGAROSE GPG/LE	AmericanBio	AB00972-00500	Store at ambient temperature
Ammonium iron(II) sulfate hexahydrate	Sigma-Aldrich	F2262	Prepare a working solution (0.25 M) and store it at -20 °C
Bioanalyzer Small RNA Analysis	Agilent	5067-1548	The Small RNA Analysis is used for checking the quality of input RNAs and the efficiency of enzymatic reactions (e.g., Linker 1 ligation)
Bovine Serum Albumin (BSA; 10 mg/mL)	New England Biolabs	B9000	This product was discontinued on 12/15/2022 and is replaced with Recombinant Albumin, Molecular Biology Grade (NEB B9200).
Chloroform	Macron Fine Chemicals	4441-10
Demethylase	ArrayStar	AS-FS-004	Demethylase comes with the rtStar tRNA Pretreatment & First-Strand cDNA Synthesis Kit (AS-FS-004)
Deoxynucleotide (dNTP) Solution Mix	New England Biolabs	N0447L (component #: N0447LVIAL)	This dNTP Solution Mix contains equimolar concentrations of dATP, dCTP, dGTP and dTTP (10 mM each)
Digital Dual Heat Block	VWR Scientific Products	13259-052	Heating block is used with the QIAquick Gel Extraction Kit
DyeEx 2.0 Spin Kit	Qiagen	63204	Effective at removing short remnants (e.g., oligos less than 10 bp in length)
Electrophoresis Power Supply	Bio-Rad Labrotories	PowerPac 300
Eppendorf PCR Tubes (0.5 mL)	Eppendorf	0030124537
Eppendorf Safe-Lock Tubes (0.5 mL)	Eppendorf	022363611
Eppendorf Safe-Lock Tubes (1.5 mL)	Eppendorf	022363204
Eppendorf Safe-Lock Tubes (2 mL)	Eppendorf	022363352
Ethyl alcohol (Ethanol), Pure	Sigma-Aldrich	E7023	The pure ethanol is used with the Oligo Clean and Concentrator Kit from Zymo Research
Gel Imaging System	Alpha Innotech	FluorChem 8900
Gel Loading Dye, Purple (6X), no SDS	New England Biolabs	N0556S (component #: B7025SVIAL)	NEB N0556S contains Quick-Load Purple 50 bp DNA Ladder and Gel Loading Dye, Purple (6X), no SDS
GENESYS 180 UV-Vis Spectrophotometer	Thermo Fisher Scientific	840-309000	The spectrophotometer is used for measuring the oligo concentrations using the Beer's law
HEPES	Sigma-Aldrich	H4034	Prepare a working solution (1 M; pH = 8 with NaOH) and store it at -20 °C
Hydrochloric acid (HCl)	VWR Scientific Products	BDH3028	Prepare a working solution (5 M) and store it at ambient temperature
Isopropyl Alcohol (Isopropanol), Pure	Macron Fine Chemicals	3032-16	Isopropanol is used with the QIAquick Gel Extraction Kit
L-Ascorbic acid	Sigma-Aldrich	A5960	Prepare a working solution (0.5 M) and store it at -20ºC
Microcentrifuge	Eppendorf	5415D
NanoDrop 2000 Spectrophotometer	Thermo Fisher Scientific	ND-2000
NEBuffer 2 (10X)	New England Biolabs	M0264L (component #: B7002SVIAL)	NEB M0264L contains RecJf (30 U/μL) and NEBuffer 2 (10X); store at -20 °C
Nuclease-Free Water (not DEPC-Treated)	Thermo Fisher Scientific	AM9938
Oligo Clean & Concentrator Kit	Zymo Research	D4061	Store at ambient temperature
PEG 8000 (50% solution)	New England Biolabs	M0437M (component #: B1004SVIAL)	NEB M0437M contains T4 RNA Ligase 1 (30 U/μL), T4 RNA Ligase Reaction Buffer (10X), PEG 8000 (1X), and ATP (100 mM); prepare a working solution (10 mM) and store it at -20ºC
Peltier Thermal Cycler	MJ Research	PTC-200
Phenol:choloroform:isoamyl alcohol 25:24:1 pH = 5.2	Thermo Fisher Scientific	J62336
PrimeScript Buffer (5X)	TaKaRa	2680A
PrimeScript Reverse Transcriptase	TaKaRa	2680A
QIAquick Gel Extraction Kit	Qiagen	28704	This kit requires a heating block and isopropanol to work with
Quick-Load Purple 100 bp DNA Ladder	New England Biolabs	N0551S (component #: N0551SVIAL)
Quick-Load Purple 50 bp DNA Ladder	New England Biolabs	N0556S (component #: N0556SVIAL)	NEB N0556S contains Quick-Load Purple 50 bp DNA Ladder and Gel Loading Dye, Purple (6X), no SDS
RecJf (30 U/μL)	New England Biolabs	M0264L (component #: M0264LVIAL)	NEB M0264L contains RecJf (30 U/μL) and NEBuffer 2 (10X); store at -20 °C
RNase Inhibitor (murine; 40 U/μL)	New England Biolabs	M0314L (component #: M0314LVIAL)	Store at -20 °C
SeqAMP DNA Polymerase	TaKaRa	638509	TaKaRa 638509 contains SeqAMP DNA Polymerase and SeqAMP PCR Buffer (2X)
SeqAMP PCR Buffer (2X)	TaKaRa	638509	TaKaRa 638509 contains SeqAMP DNA Polymerase and SeqAMP PCR Buffer (2X)
Shrimp Alkaline Phosphatase (1 U/μL)	New England Biolabs	M0371L (component #: M0371LVIAL)
Sodium hydroxide (NaOH)	Sigma-Aldrich	S5881	Prepare a working solution (5 M) and store it at ambient temperature
T4 DNA Ligase (400 U/μL)	New England Biolabs	M0202L (component #: M0202LVIAL)	NEB M0202L contains T4 DNA Ligase (400 U/μL) and T4 DNA Ligase Reaction Buffer (10X)
T4 DNA Ligase Reaction Buffer (10X)	New England Biolabs	M0202L (component #: B0202SVIAL)	NEB M0202L contains T4 DNA Ligase (400 U/μL) and T4 DNA Ligase Reaction Buffer (10X)
T4 RNA Ligase 1 (30 U/μL)	New England Biolabs	M0437M (component #: M0437MVIAL)	NEB M0437M contains T4 RNA Ligase 1 (30 U/μL), T4 RNA Ligase Reaction Buffer (10X), PEG 8000 (1X), and ATP (100 mM)
T4 RNA Ligase Reaction Buffer (10X)	New England Biolabs	M0437M (component #: B0216SVIAL)	NEB M0437M contains T4 RNA Ligase 1 (30 U/μL), T4 RNA Ligase Reaction Buffer (10X), PEG 8000 (1X), and ATP (100 mM)