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Method Article
* 这些作者具有相同的贡献
小菌落在念珠菌属耐药性中的意义尚未得到充分探索。抗菌光动力疗法 (aPDT) 提供了一种对抗耐药性真菌感染的有前途的策略。这项研究表明,孟加拉玫瑰介导的 aPDT 可有效灭活 光滑念珠菌 并诱导小菌落,呈现出独特的过程。
面对念珠菌血症患者40%的死亡率,耐药念珠菌及其娇小的突变体仍然是一个主要的治疗挑战。与抗生素/抗真菌药不同,抗菌光动力疗法 (aPDT) 针对多种真菌结构,可能会阻碍耐药性。诱导小菌落的传统方法依赖于溴化乙锭或氟康唑,它们会影响药物敏感性和应激反应。本研究调查了绿光(峰值 520 nm)和孟加拉玫瑰 (RB) 光敏剂在对抗耐药性光滑念珠菌分离株中的应用。研究结果显示,aPDT处理显著抑制细胞生长(减少99.9%≥)并有效诱导小集落形成,如线粒体氧化还原指示剂染色尺寸减小和丢失所证明的那样。这项研究提供了初步证据,表明 aPDT 可以在体外诱导多重耐药光滑念珠菌菌株中的小菌落,为对抗耐药性真菌感染提供了一种潜在的变革性方法。
真菌感染,特别是由白色念珠菌和日益耐药的光滑念珠菌引起的真菌感染,构成了严重的全球威胁1.这些感染可能是致命的,特别是对于住院患者和免疫系统较弱的患者。抗真菌耐药性的上升威胁到侵袭性念珠菌病的控制,侵袭性念珠菌病是一种严重的真菌感染,死亡率很高,尤其是白色念珠菌 2。耐药菌株阻碍了有效的治疗,可能会增加复杂性和死亡率。在美国加利福尼亚州阿拉米达县,C. glabrata 已成为最普遍的入侵物种3.念珠菌属流行率和分布的这种变化可能受到当地医疗保健实践、患者人口统计学、抗真菌药物的使用以及念珠菌感染危险因素的流行率的影响。
念珠菌中的娇小突变体缺乏功能性线粒体,揭示了这种细胞器如何影响药物反应、毒力和抗逆性 4,5。C. glabrata 很容易形成这些菌落,对多烯敏感,而对唑类6 失去敏感性。唑类药物敏感性和呼吸功能有着错综复杂的联系,呼吸减弱会通过线粒体 DNA 丢失导致抵抗7。已从接受氟康唑治疗的骨髓移植受者8 和血流感染患者的血培养瓶9 中分离出具有唑类耐药性的 C. glabrata 小菌落。它们在耐药性、毒力和应激反应方面的潜在影响凸显了其临床意义。此外,它们的独特特性使它们成为研究线粒体生物学基本问题的宝贵工具5。随着对娇小突变体研究的继续,它们在临床和基础研究中的应用可能会扩大。
这项研究发现,光动力疗法(PDT)可以诱导 光滑梭菌中的小菌落,扩大了 将光滑梭 菌暴露于溴化乙锭或氟康唑的传统技术之外的方法范围。
1. 光滑梭菌的培养
注:对大多数抗真菌剂(包括氟康唑)具有耐药性的多重耐药 光滑念珠菌 (C2-1000907)用于实验。实验条件可能需要根据特定菌株进行调整,因为不同菌株之间可能存在差异。所有实验都使用在25°C下生长的对数期念珠菌(模拟自然感染)以确保一致性。与白色念珠菌相比, 光滑念珠菌缺乏菌丝简化了定量, 白色念珠菌在37°C时形成菌丝10。
2. 通过溴化乙锭、氟康唑和光动力疗法诱导小菌落
3.线粒体功能分析(TCC染色试验)
注意:TTC 是一种氧化还原指示剂和电子受体。当白色化合物被电子11 破坏时,它会变成红色。请注意,并非所有细胞都必须在琼脂平板上培养后 24 小时内形成可见的菌落。具有功能性线粒体的菌落变成红色,而具有非功能性线粒体的菌落保持白色。这使得区分具有不同线粒体功能的菌落。
4. 正常和娇小的光滑梭菌的生长动力学
注:比较了三种酵母菌株: 光滑念珠菌 C2-1000907 T0(未经 PDT 处理的临床分离物)、T3n(连续 3 次 RB-PDT 后光滑念 珠菌 C2-1000907 表现出平均直径为 1.5 ± 0.8 mm 与亲本细胞相似)和 T3p(连续 3 次 RB-PDT 后 光滑念珠菌 C2-1000907 的小型菌落)。
数据以平均值表示,标准误差±,来自三个独立实验,每组至少一式三份。实验数据,包括菌落计数、OD600 测量值和 TTC 染色结果,使用绘图和统计软件进行绘图和统计分析(参见 材料表)。使用单因素方差分析或 t 检验 来分析数据, p 值 <0.05 被认为是显著的。使用 48 位全彩光学扫描仪以 1200 dpi 的分辨率进行扫描,随后使用 ImageJ 软件进行菌落直径的测量。
...这项研究揭示了 PDT 是首次报道的诱导念珠菌中小群体形成的方法,超过了溴化乙锭和氟康唑的既定作用。这一新颖的观察结果需要进一步探索,以揭示其通过降低毒力和耐药机制的出现来根除真菌的影响。
RB 介导的 PDT 有效抑制 光滑念珠菌的生长,为念珠菌感染提供了一种潜在的替代治疗方法。作为一种光激活光敏剂,RB 在暴露于特定波长时会产生单线态氧和活性氧...
作者声明没有利益冲突。
这项工作得到了台湾科学技术部[MOST 110-2314-B-006-086-MY3],国立成功大学[K111-B094],[K111-B095],台湾国立成功大学医院[NCKUH-11204031],[NCKUMCS2022057]的资助。
Name | Company | Catalog Number | Comments |
0.22 μm filter | Merck, Taipei, Taiwan | Millex, SLGVR33RS | |
1.5 mL microfuge tube | Neptune, San Diego, USA | #3745 | |
20% Triphenyltetrazolium chloride (TTC) | Sigma-Aldrich, MO, USA | T8877 | |
5 mL polypropylene round bottom tube | Corning, AZ, USA | 352059 | |
5 mL round-bottom tube with cell strainer cap | Corning, AZ, USA | Falcon, #352235 | |
96-well plate | Alpha plus, Taoyuan Hsien, Taiwan | #16196 | |
Agar | BRS, Tainan, Taiwan | AG012 | |
Blank disk | Advantec, Tokyo, Japan | 49005040 | |
Centrifuge | Eppendorf, UK | 5415R | |
Ethidium bromide solution | Sigma-Aldrich, MO, USA | E1510 | |
Fluconazole, 2 mg/mL | Pfizer, NY, USA | BC18790248 | |
GraphPad Prism | GraphPad Software | Version 7.0 | |
Green light emitting diode (LED) strip | Nanyi electronics Co.,Ltd, Tainan, Taiwan | 5050 | Excitation wave: 500~550 nm |
Low Temperature. shake Incubators | Yihder, Taipei, Taiwan | LM-570D (R) | |
Mouth care cotton swabs | Good Verita Enterprise, Taipei, Taiwan | 161357 | |
Muller Hinton II agar | BD biosciences, California, USA | 211438 | |
Multimode microplate reader | Molecular Devices | SpectraMax i3x | |
OD600 spectrophotometer | Biochrom, London, UK | Ultrospec 10 | |
Rose Bengal | Sigma-Aldrich, USA | 330000 | stock concentration 40 mg/mL = 4%, prepare in PBS, stored at 4 °C |
Sterilized glass tube | Sunmei, Tainan, Taiwan | AK45048-16100 | |
Yeast Extract Peptone Dextrose Medium | HIMEDIA, India | M1363 |
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