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摘要

小菌落在念珠菌属耐药性中的意义尚未得到充分探索。抗菌光动力疗法 (aPDT) 提供了一种对抗耐药性真菌感染的有前途的策略。这项研究表明,孟加拉玫瑰介导的 aPDT 可有效灭活 光滑念珠菌 并诱导小菌落,呈现出独特的过程。

摘要

面对念珠菌血症患者40%的死亡率,耐药念珠菌及其娇小的突变体仍然是一个主要的治疗挑战。与抗生素/抗真菌药不同,抗菌光动力疗法 (aPDT) 针对多种真菌结构,可能会阻碍耐药性。诱导小菌落的传统方法依赖于溴化乙锭或氟康唑,它们会影响药物敏感性和应激反应。本研究调查了绿光(峰值 520 nm)和孟加拉玫瑰 (RB) 光敏剂在对抗耐药性光滑念珠菌分离株中的应用。研究结果显示,aPDT处理显著抑制细胞生长(减少99.9%≥)并有效诱导小集落形成,如线粒体氧化还原指示剂染色尺寸减小和丢失所证明的那样。这项研究提供了初步证据,表明 aPDT 可以在体外诱导多重耐药光滑念珠菌菌株中的小菌落,为对抗耐药性真菌感染提供了一种潜在的变革性方法。

引言

真菌感染,特别是由白色念珠菌和日益耐药的光滑念珠菌引起的真菌感染,构成了严重的全球威胁1.这些感染可能是致命的,特别是对于住院患者和免疫系统较弱的患者。抗真菌耐药性的上升威胁到侵袭性念珠菌病的控制,侵袭性念珠菌病是一种严重的真菌感染,死亡率很高,尤其是白色念珠2。耐药菌株阻碍了有效的治疗,可能会增加复杂性和死亡率。在美国加利福尼亚州阿拉米达县,C. glabrata 已成为最普遍的入侵物种3.念珠菌属流行率和分布的这种变化可能受到当地医疗保健实践、患者人口统计学、抗真菌药物的使用以及念珠菌感染危险因素的流行率的影响。

念珠菌中的娇小突变体缺乏功能性线粒体,揭示了这种细胞器如何影响药物反应、毒力和抗逆性 4,5C. glabrata 很容易形成这些菌落,对多烯敏感,而对唑类6 失去敏感性。唑类药物敏感性和呼吸功能有着错综复杂的联系,呼吸减弱会通过线粒体 DNA 丢失导致抵抗7。已从接受氟康唑治疗的骨髓移植受者8 和血流感染患者的血培养瓶9 中分离出具有唑类耐药性的 C. glabrata 小菌落。它们在耐药性、毒力和应激反应方面的潜在影响凸显了其临床意义。此外,它们的独特特性使它们成为研究线粒体生物学基本问题的宝贵工具5。随着对娇小突变体研究的继续,它们在临床和基础研究中的应用可能会扩大。

这项研究发现,光动力疗法(PDT)可以诱导 光滑梭菌中的小菌落,扩大了 将光滑梭 菌暴露于溴化乙锭或氟康唑的传统技术之外的方法范围。

研究方案

1. 光滑梭菌的培养

注:对大多数抗真菌剂(包括氟康唑)具有耐药性的多重耐药 光滑念珠菌 (C2-1000907)用于实验。实验条件可能需要根据特定菌株进行调整,因为不同菌株之间可能存在差异。所有实验都使用在25°C下生长的对数期念珠菌(模拟自然感染)以确保一致性。与白色念珠菌相比, 光滑念珠菌缺乏菌丝简化了定量, 白色念珠菌在37°C时形成菌丝10

  1. 为了制备 光滑念珠菌的对数期培养物,从琼脂平板中挑选一个菌落,并将其转移到装有 3 mL 无菌酵母蛋白胨葡萄糖 (YPD) 培养基的玻璃试管中(参见 材料表)。在25°C下振荡孵育14-16小时(155rpm,45°角以增加对介质的空气传输)。
  2. 孵育后,使用无菌技术将新鲜 YPD 培养物稀释至 OD600 为 0.1。在25°C孵育6小时,以155rpm振荡。通过测量 OD600 来验证 C. glabrata 的对数阶段。目标为 0.65-1.00,相当于 1 × 10 7-1.5 × 10 7 个细胞/mL。

2. 通过溴化乙锭、氟康唑和光动力疗法诱导小菌落

  1. 溴化乙锭小菌落诱导
    1. 将酵母悬浮液调节至 OD600 为 0.1 (5 × 106 个细胞/mL),使用 YPD 至终体积为 3 mL,然后加入 30 μL 溴化乙锭储备液 (10 mg/mL)(参见 材料表),终浓度为 100 μg/mL。
    2. 将酵母悬浮液在25°C,155rpm,45°角下孵育过夜(16-18小时)。调节至 OD600 为 0.65 (1 × 107 个细胞/mL)。通过在 96 孔板中进行 10 倍稀释系列,方法是将 20 μL 调整后的酵母悬浮液添加到每孔 180 μL 的 PBS 中。这会产生六种稀释度,范围从 10-110-5
    3. 选择 4 种稀释因子(例如,100、101、102 和 103),并在 YPD 琼脂平板的 4 个象限上各平板 3 滴 (20 μL)(一式三份)。
    4. 将板在37°C孵育过夜。 从先前选择的稀释液中选择具有 5-80 个菌落的象限,用于三苯基氯化四氮唑 (TTC) 染色11 (参见步骤 3)。使用 48 位全彩色光学扫描仪以 1200 dpi 扫描印版。
  2. 氟康唑小菌落诱导
    注意:为了加快该过程,使用T3细胞(3次RB-PDT处理后获得的正常细胞和小细胞的混合物;参见步骤2.3)进行氟康唑诱导的小型菌落形成。这是因为标准治疗通常会导致形成速度减慢。
    1. 按照步骤 2.1.1 中所述准备和调整酵母细胞悬浮液。
    2. 在25°C孵育过夜(16-18小时)。 再次将 OD600 调整到 0.1。
    3. 将 1 mL 调整后的悬浮液转移到无菌 5 mL 管中。
    4. 将无菌棉签(长 15 厘米,尖端为 0.9 厘米 x 2.6 厘米,参见 材料表)浸入酵母悬浮液中,确保与管底部接触并扭转以去除管壁上多余的液体。
    5. 使用Mueller-Hinton琼脂在罩中制备板(参见 材料表)。
    6. 将棉花在琼脂上来回擦拭,旋转 60° 两次,然后擦拭周边以均匀覆盖。
    7. 将镊子在火焰上灭菌 1-2 秒,让它们短暂冷却,然后用它们捡起空白的圆盘。
    8. 使用记号笔将板分成三个相等的扇区。将一个空白磁盘放在每个扇区的中心。
    9. 向每个圆盘(25μg/圆盘)中加入12.5μL氟康唑原液(2mg / mL,参见 材料表),充分混合以避免气泡,并在37°C下孵育20-24小时。
    10. 进行TTC染色(参见步骤3)。使用 48 位全彩色光学扫描仪以 1200 dpi 扫描印版。
  3. PDT小菌落诱导
    注意:不同的真菌在 PDT 后可能会产生不同数量的小菌落。有些菌株可能根本不会产生任何菌株。
    1. 准备 aPDT 系统。
      注意:aPDT 系统设备的设置程序遵循 Hung 等人12 报告的方法。简而言之,aPDT 系统由一个绿色 LED 阵列组成,其峰值为 520 nm(参见 材料表),从底部照射光线,与 96 孔板的每个孔均具有良好的对准性。
    2. 将YPD培养基中的酵母细胞悬浮液调节至OD600 为0.65(约1×107 个细胞/ mL)。
    3. 将 1 mL 酵母悬浮液与 111 μL 2% 孟加拉玫瑰(RB, 图 1)(参见 材料表)混合在圆盖管中,最终 RB 浓度为 0.2%。将混合物在25°C孵育15分钟,以155rpm以45°角旋转。
    4. 将混合物转移到 1.5 mL 微量离心管中,并以 16,100 x g 离心 2.5 分钟(室温)。
    5. 丢弃上清液,在引擎盖地板上轻轻刮试管五次,以重新悬浮沉淀。
    6. 用1x PBS洗涤悬浮液四次,以除去所有RB。每次洗涤后,通过短暂的涡旋或移液将颗粒重新悬浮以彻底重悬。
      1. 最终洗涤后,加入 1000 μL PBS。溶液是浅粉红色。将 200 μL 洗涤的负载 RB 的酵母悬浮液转移到 96 孔板(一式三份)中的三个孔中的每一个。
    7. 将 96 孔板放在光动力光系统上,LED 灯泡从下方发出绿光。关闭室内灯,确保照明均匀,防止干扰。激活 LED 灯系统以在 2 分钟内提供 4.38 J/cm 2 的 PDT 剂量;确保系统与孔正确对齐。
    8. 辐照后,在 96 孔板中稀释酵母悬浮液。将 20 μL 酵母悬浮液加入含有 180 μL PBS 的孔中,产生 10 倍稀释度。对剩余的稀释液重复上述步骤,以达到 10-110-5 的范围。
    9. 根据酵母细胞浓度调节选择四种稀释因子(例如,10-210-5)。
    10. 对于每种稀释因子,在YPD琼脂平板上每象限平板3滴(每滴20μL)。
    11. 酵母悬浮液完全吸收后,通过琼脂平板约10分钟,倒置并在37°C下孵育过夜。
    12. 将 T0 定义为未经 PDT 处理的对照亲本 C. glabrata 。如上所述,在对数生长阶段制备T0真菌,并在0.2%RB存在下将它们暴露于4.38J /cm 2 绿光下。这种 PDT 条件始终抑制 3 至 3.5 个对数的真菌生长。
      1. 将存活的真菌表示为 T1,并在它们在体外扩增到对数生长阶段后再次将它们暴露于相同的 PDT 剂量。第二次 PDT 后存活的真菌表示为 T2,依此类推。
    13. 第二天,选择菌落数量在 5 到 80 之间的象限。计算每个象限中的菌落数,并使用以下公式计算滴度:菌落形成单位 (CFU)/mL = 菌落数(一式三份的平均值) ×稀释因子 × 50。
    14. 进行TTC染色(参见步骤3)。如前所述扫描板(步骤 2.2)。

3.线粒体功能分析(TCC染色试验)

注意:TTC 是一种氧化还原指示剂和电子受体。当白色化合物被电子11 破坏时,它会变成红色。请注意,并非所有细胞都必须在琼脂平板上培养后 24 小时内形成可见的菌落。具有功能性线粒体的菌落变成红色,而具有非功能性线粒体的菌落保持白色。这使得区分具有不同线粒体功能的菌落。

  1. 处理后,根据所需的细胞密度在YPD琼脂平板上稀释念珠菌悬浮液,以获得不同的菌落,以便于观察和染色。
  2. 在37°C下生长24小时后,从单个细胞形成可见菌落。将 20 μL 20% TTC 直接移液到每个菌落的中心。
  3. 完全吸收后,菌落约10分钟的TTC,在37°C孵育30-40分钟。

4. 正常和娇小的光滑梭菌的生长动力学

注:比较了三种酵母菌株: 光滑念珠菌 C2-1000907 T0(未经 PDT 处理的临床分离物)、T3n(连续 3 次 RB-PDT 后光滑 珠菌 C2-1000907 表现出平均直径为 1.5 ± 0.8 mm 与亲本细胞相似)和 T3p(连续 3 次 RB-PDT 后 光滑念珠菌 C2-1000907 的小型菌落)。

  1. 在 3 mL 管中将 YPD 培养基中的酵母细胞悬浮液调节至 OD600 为 0.1 (5 × 106 个细胞/mL)。
  2. 使用多模式酶标仪(参见材料表)每20分钟自动测量静态培养物的OD600,持续24小时。

结果

数据以平均值表示,标准误差±,来自三个独立实验,每组至少一式三份。实验数据,包括菌落计数、OD600 测量值和 TTC 染色结果,使用绘图和统计软件进行绘图和统计分析(参见 材料表)。使用单因素方差分析或 t 检验 来分析数据, p 值 <0.05 被认为是显著的。使用 48 位全彩光学扫描仪以 1200 dpi 的分辨率进行扫描,随后使用 ImageJ 软件进行菌落直径的测量。

...

讨论

这项研究揭示了 PDT 是首次报道的诱导念珠菌中小群体形成的方法,超过了溴化乙锭和氟康唑的既定作用。这一新颖的观察结果需要进一步探索,以揭示其通过降低毒力和耐药机制的出现来根除真菌的影响。

RB 介导的 PDT 有效抑制 光滑念珠菌的生长,为念珠菌感染提供了一种潜在的替代治疗方法。作为一种光激活光敏剂,RB 在暴露于特定波长时会产生单线态氧和活性氧...

披露声明

作者声明没有利益冲突。

致谢

这项工作得到了台湾科学技术部[MOST 110-2314-B-006-086-MY3],国立成功大学[K111-B094],[K111-B095],台湾国立成功大学医院[NCKUH-11204031],[NCKUMCS2022057]的资助。

材料

NameCompanyCatalog NumberComments
0.22 μm filterMerck, Taipei, TaiwanMillex, SLGVR33RS
1.5 mL microfuge tubeNeptune, San Diego, USA#3745
20% Triphenyltetrazolium chloride (TTC)Sigma-Aldrich, MO, USAT8877
5 mL polypropylene round bottom tubeCorning, AZ, USA352059
5 mL round-bottom tube with cell strainer capCorning, AZ, USAFalcon, #352235
96-well plateAlpha plus, Taoyuan Hsien, Taiwan#16196
AgarBRS, Tainan, TaiwanAG012
Blank diskAdvantec, Tokyo, Japan49005040
CentrifugeEppendorf, UK5415R
Ethidium bromide solutionSigma-Aldrich, MO, USAE1510
Fluconazole, 2 mg/mLPfizer, NY, USABC18790248
GraphPad PrismGraphPad SoftwareVersion 7.0
Green light emitting diode (LED) stripNanyi electronics Co.,Ltd, Tainan, Taiwan5050Excitation wave: 500~550 nm
Low Temperature. shake IncubatorsYihder, Taipei, TaiwanLM-570D (R)
Mouth care cotton swabsGood Verita Enterprise, Taipei, Taiwan161357
Muller Hinton II agarBD biosciences, California, USA211438
Multimode microplate readerMolecular DevicesSpectraMax i3x
OD600 spectrophotometerBiochrom, London, UKUltrospec 10
Rose BengalSigma-Aldrich, USA330000stock concentration 40 mg/mL = 4%, prepare in PBS, stored at 4 °C
Sterilized glass tubeSunmei, Tainan, TaiwanAK45048-16100
Yeast Extract Peptone Dextrose MediumHIMEDIA, IndiaM1363

参考文献

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