通过 Rose Bengal 介导的光动力疗法诱导念珠菌中的小菌落

摘要

小菌落在念珠菌属耐药性中的意义尚未得到充分探索。抗菌光动力疗法 （aPDT） 提供了一种对抗耐药性真菌感染的有前途的策略。这项研究表明，孟加拉玫瑰介导的 aPDT 可有效灭活 光滑念珠菌 并诱导小菌落，呈现出独特的过程。

摘要

面对念珠菌血症患者40%的死亡率，耐药念珠菌及其娇小的突变体仍然是一个主要的治疗挑战。与抗生素/抗真菌药不同，抗菌光动力疗法 （aPDT） 针对多种真菌结构，可能会阻碍耐药性。诱导小菌落的传统方法依赖于溴化乙锭或氟康唑，它们会影响药物敏感性和应激反应。本研究调查了绿光（峰值 520 nm）和孟加拉玫瑰 （RB） 光敏剂在对抗耐药性光滑念珠菌分离株中的应用。研究结果显示，aPDT处理显著抑制细胞生长（减少99.9%≥）并有效诱导小集落形成，如线粒体氧化还原指示剂染色尺寸减小和丢失所证明的那样。这项研究提供了初步证据，表明 aPDT 可以在体外诱导多重耐药光滑念珠菌菌株中的小菌落，为对抗耐药性真菌感染提供了一种潜在的变革性方法。

引言

真菌感染，特别是由白色念珠菌和日益耐药的光滑念珠菌引起的真菌感染，构成了严重的全球威胁¹.这些感染可能是致命的，特别是对于住院患者和免疫系统较弱的患者。抗真菌耐药性的上升威胁到侵袭性念珠菌病的控制，侵袭性念珠菌病是一种严重的真菌感染，死亡率很高，尤其是白色念珠菌 ²。耐药菌株阻碍了有效的治疗，可能会增加复杂性和死亡率。在美国加利福尼亚州阿拉米达县，C. glabrata 已成为最普遍的入侵物种³.念珠菌属流行率和分布的这种变化可能受到当地医疗保健实践、患者人口统计学、抗真菌药物的使用以及念珠菌感染危险因素的流行率的影响。

念珠菌中的娇小突变体缺乏功能性线粒体，揭示了这种细胞器如何影响药物反应、毒力和抗逆性 ^4,5。C. glabrata 很容易形成这些菌落，对多烯敏感，而对唑类⁶ 失去敏感性。唑类药物敏感性和呼吸功能有着错综复杂的联系，呼吸减弱会通过线粒体 DNA 丢失导致抵抗⁷。已从接受氟康唑治疗的骨髓移植受者

研究方案

1. 光滑梭菌的培养

注：对大多数抗真菌剂（包括氟康唑）具有耐药性的多重耐药 光滑念珠菌 （C2-1000907）用于实验。实验条件可能需要根据特定菌株进行调整，因为不同菌株之间可能存在差异。所有实验都使用在25°C下生长的对数期念珠菌（模拟自然感染）以确保一致性。与白色念珠菌相比， 光滑念珠菌缺乏菌丝简化了定量， 白色念珠菌在37°C时形成菌丝¹⁰。

1. 为了制备 光滑念珠菌的对数期培养物，从琼脂平板中挑选一个菌落，并将其转移到装有 3 mL 无菌酵母蛋白胨葡萄糖 （YPD） 培养基的玻璃试管中（参见 材料表）。在25°C下振荡孵育14-16小时（155rpm，45°角以增加对介质的空气传输）。
2. 孵育后，使用无菌技术将新鲜 YPD 培养物稀释至 OD₆₀₀ 为 0.1。在25°C孵育6小时，以155rpm振荡。通过测量 OD₆₀₀ 来验证 C. glabrata 的对数阶段。目标为 0.65-1.00，相当于 1 × 10 7-1.5 × 10 ⁷ 个细胞/mL。

讨论

这项研究揭示了 PDT 是首次报道的诱导念珠菌中小群体形成的方法，超过了溴化乙锭和氟康唑的既定作用。这一新颖的观察结果需要进一步探索，以揭示其通过降低毒力和耐药机制的出现来根除真菌的影响。

RB 介导的 PDT 有效抑制 光滑念珠菌的生长，为念珠菌感染提供了一种潜在的替代治疗方法。作为一种光激活光敏剂，RB 在暴露于特定波长时会产生单线态氧和活性氧.......

材料

Name	Company	Catalog Number	Comments
0.22 μm filter	Merck, Taipei, Taiwan	Millex, SLGVR33RS
1.5 mL microfuge tube	Neptune, San Diego, USA	#3745
20% Triphenyltetrazolium chloride (TTC)	Sigma-Aldrich, MO, USA	T8877
5 mL polypropylene round bottom tube	Corning, AZ, USA	352059
5 mL round-bottom tube with cell strainer cap	Corning, AZ, USA	Falcon, #352235
96-well plate	Alpha plus, Taoyuan Hsien, Taiwan	#16196
Agar	BRS, Tainan, Taiwan	AG012
Blank disk	Advantec, Tokyo, Japan	49005040
Centrifuge	Eppendorf, UK	5415R
Ethidium bromide solution	Sigma-Aldrich, MO, USA	E1510
Fluconazole, 2 mg/mL	Pfizer, NY, USA	BC18790248
GraphPad Prism	GraphPad Software	Version 7.0
Green light emitting diode (LED) strip	Nanyi electronics Co.,Ltd, Tainan, Taiwan	5050	Excitation wave: 500~550 nm
Low Temperature. shake Incubators	Yihder, Taipei, Taiwan	LM-570D (R)
Mouth care cotton swabs	Good Verita Enterprise, Taipei, Taiwan	161357
Muller Hinton II agar	BD biosciences, California, USA	211438
Multimode microplate reader	Molecular Devices	SpectraMax i3x
OD600 spectrophotometer	Biochrom, London, UK	Ultrospec 10
Rose Bengal	Sigma-Aldrich, USA	330000	stock concentration 40 mg/mL = 4%, prepare in PBS, stored at 4 °C
Sterilized glass tube	Sunmei, Tainan, Taiwan	AK45048-16100
Yeast Extract Peptone Dextrose Medium	HIMEDIA, India	M1363