Inducción de pequeñas colonias en Candida glabrate a través de la terapia fotodinámica mediada por Rose Bengal

Resumen

La importancia de las colonias pequeñas en la resistencia a los medicamentos de Candida spp. no se ha explorado completamente. La terapia fotodinámica antimicrobiana (aPDT) ofrece una estrategia prometedora contra las infecciones fúngicas resistentes a los medicamentos. Este estudio demuestra que la aPDT mediada por rosa de bengala desactiva eficazmente la Candida glabrata e induce colonias pequeñas, presentando un procedimiento único.

Resumen

Frente a una tasa de mortalidad del 40% en pacientes con candidemia, la Candida resistente a los medicamentos y sus pequeños mutantes siguen siendo un desafío importante para el tratamiento. La terapia fotodinámica antimicrobiana (aPDT) se dirige a múltiples estructuras fúngicas, a diferencia de los antibióticos/antifúngicos, lo que puede frustrar la resistencia. Los métodos tradicionales para inducir colonias pequeñas se basan en el bromuro de etidio o el fluconazol, que pueden influir en la susceptibilidad a los medicamentos y en las respuestas al estrés. Este estudio investigó la aplicación de luz verde (pico 520 nm) y fotosensibilizador de rosa bengala (RB) para combatir un aislado de Candida glabrata resistente a los medicamentos. Los hallazgos revelaron que el tratamiento con aPDT inhibió significativamente el crecimiento celular (reducción del ≥99,9%) e indujo eficazmente la formación de colonias pequeñas, como lo demuestra la reducción del tamaño y la pérdida de la tinción del indicador redox mitocondrial. Este estudio proporciona evidencia inicial de que aPDT puede inducir colonias pequeñas en una cepa de C. glabrata multirresistente in vitro, ofreciendo un enfoque potencialmente transformador para combatir las infecciones fúngicas resistentes.

Introducción

Las infecciones fúngicas, en particular las causadas por Candida albicans y Candida glabrata, cada vez más resistente a los medicamentos, representan una grave amenaza mundial¹. Estas infecciones pueden ser mortales, especialmente para los pacientes hospitalizados y aquellos con sistemas inmunitarios debilitados. El aumento de la resistencia a los antifúngicos amenaza el control de la candidiasis invasiva, una infección fúngica grave con alta mortalidad, especialmente de Candida albicans². Las cepas resistentes dificultan el tratamiento eficaz, lo que puede aumentar tanto la complejidad como las tasas de mortalidad. En el condado de Alameda, California, EE.UU ., C. glabrata se ha convertido en la especie invasora más prevalente³. Este cambio en la prevalencia y distribución de las especies de Candida puede estar influenciado por las prácticas de atención médica locales, la demografía de los pacientes, la utilización de agentes antifúngicos y la prevalencia de factores de riesgo para las infecciones por Candida.

Pequeños mutantes en Candida, que carecen de mitocondrias funcionales, revelan cómo este orgánulo afecta la respuesta a los medicamentos, la virulencia y la resistencia al estrés ^4,5. C. glabrata forma fácilmente estas colonias, ganando sensibilidad a los polienos mientras la pierde ante los azoles⁶. La sensibilidad a los azoles y la función respiratoria están estrechamente relacionadas, y la disminución de la respiración conduce a la resistencia a través de la pérdida de ADN mitocondrial⁷. Se han aislado pequeñas colonias de C. glabrata con resistencia a los azoles a partir de muestras de heces humanas de un receptor de trasplante de médula ósea sometido a tratamiento con fluconazol⁸ y de frascos de hemocultivo de pacientes con infecciones del torrente sanguíneo⁹. Sus posibles implicaciones en la resistencia a los fármacos, la virulencia y la respuesta al estrés ponen de manifiesto su importancia clínica. Además, sus propiedades distintivas los convierten en herramientas valiosas para investigar cuestiones fundamentales en la biología mitocondrial⁵. A medida que continúa la investigación sobre mutantes pequeños, es probable que se amplíen sus aplicaciones tanto en la investigación clínica como en la básica.

Este estudio descubrió que la terapia fotodinámica (TFD) puede inducir colonias pequeñas en C. glabrata, ampliando la gama de métodos más allá de las técnicas tradicionales de exposición de C. glabrata al bromuro de etidio o fluconazol.

Protocolo

1. Cultivo de C. glabrata

NOTA: Para los experimentos se utiliza un C. glabrata multirresistente (C2-1000907) que es resistente a la mayoría de los agentes antifúngicos, incluido el fluconazol. Es posible que sea necesario adaptar las condiciones experimentales a la cepa específica, ya que pueden existir variaciones entre las diferentes cepas. Todos los experimentos utilizaron Candida en fase logarítmica cultivada a 25 °C (imitando la infección natural) para obtener consistencia. La falta de hifas de C. glabrata simplifica la cuantificación en comparación con C. albicans, que forma hifas a 37 °C¹⁰.

1. Para preparar un cultivo de C. glabrata en fase logarítmica, elija una sola colonia de una placa de agar y transfiérala a un tubo de ensayo de vidrio con 3 mL de medio estéril de levadura peptona dextrosa (YPD) (ver Tabla de Materiales). Incubar durante 14-16 h a 25 °C con agitación (155 rpm, ángulo de 45° para aumentar la transmisión de aire al medio).
2. Después de la incubación, diluir el cultivo con YPD fresco hasta un OD₆₀₀ de 0,1 utilizando una técnica estéril. Incubar a 25 °C durante 6 h con agitación a 155 rpm. Verifique la fase logarítmica de C. glabrata midiendo el OD₆₀₀. Apunte a 0,65-1,00, que corresponde a 1 × 10 7-1,5 × 10⁷ células/mL.

2. Inducción de colonias pequeñas mediante bromuro de etidio, fluconazol y terapia fotodinámica

1. Inducción de colonias pequeñas de bromuro de etidio
   1. Ajustar una suspensión de levadura a un diámetro exterior de₆₀₀ de 0,1 (5 × 10⁶ células/mL) con YPD hasta un volumen final de 3 mL, luego añadir 30 μL de caldo de bromuro de etidio (10 mg/mL) (véase la Tabla de Materiales) para una concentración final de 100 μg/mL.
   2. Incubar la suspensión de levadura durante la noche (16-18 h) a 25 °C, 155 rpm, ángulo de 45°. Ajuste a un diámetro exterior de₆₀₀ de 0,65 (1 × 10⁷ células/mL). Realice una serie de dilución de 10 veces en una placa de 96 pocillos agregando 20 μL de la suspensión de levadura ajustada a 180 μL de PBS por pocillo. Esto crea seis diluciones que van de ^10-1 a ^10-5.
   3. Seleccione 4 factores de dilución (por ejemplo, 10⁰, 10¹, 10² y 10³) y coloque 3 gotas (20 μL) cada una en 4 cuadrantes de placas de agar YPD (triplicado).
   4. Incubar las placas durante la noche a 37 °C. Seleccione cuadrantes con 5-80 colonias de las diluciones previamente elegidas para la tinción con cloruro de trifeniltetrazolio (TTC)¹¹ (ver paso 3). Escanee placas a 1200 ppp con un escáner óptico a todo color de 48 bits.
2. Inducción de colonias pequeñas de fluconazol
   NOTA: Para acelerar el proceso, utilice células T3 (una mezcla de células normales y pequeñas obtenidas después de 3 tratamientos con RB-PDT; consulte el paso 2.3) para la formación de colonias pequeñas inducidas por fluconazol. Esto se debe a que el tratamiento estándar suele dar lugar a una formación más lenta.
   1. Prepare y ajuste una suspensión de células de levadura como se describe en el paso 2.1.1.
   2. Incubar durante la noche (16-18 h) a 25 °C. Vuelva a ajustar el OD₆₀₀ a 0,1.
   3. Transfiera 1 mL de la suspensión ajustada a un tubo estéril de 5 mL.
   4. Sumerja un bastoncillo de algodón estéril (15 cm de largo, con una punta de 0,9 cm x 2,6 cm, consulte la tabla de materiales) en la suspensión de levadura, asegurando el contacto con el fondo del tubo y girándolo para eliminar el exceso de líquido de la pared del tubo.
   5. Prepare las placas en la campana con agar Mueller-Hinton (consulte la tabla de materiales).
   6. Frote el algodón de un lado a otro en el agar, gírelo 60° dos veces, luego frote el perímetro para obtener una cobertura uniforme.
   7. Esterilice las pinzas sobre una llama durante 1 o 2 segundos, dejándolas enfriar brevemente, luego úselas para recoger los discos en blanco.
   8. Divida la placa en tres sectores iguales con un marcador. Coloque un disco en blanco en el centro de cada sector.
   9. Añadir 12,5 μL de caldo de fluconazol (2 mg/mL, ver Tabla de Materiales) a cada disco (25 μg/disco), mezclar bien para evitar burbujas e incubar a 37 °C durante 20-24 h.
   10. Realice la tinción TTC (consulte el paso 3). Escanee placas a 1200 ppp con un escáner óptico a todo color de 48 bits.
3. Inducción de colonias pequeñas PDT
   NOTA: Diferentes hongos pueden producir diferentes números de colonias pequeñas después de la PDT. Es posible que algunas cepas no produzcan nada en absoluto.
   1. Prepare el sistema aPDT.
      NOTA: El procedimiento de configuración para el dispositivo del sistema aPDT sigue el método informado por Hung et al¹². En resumen, el sistema aPDT consiste en una matriz de LED verdes con un pico a 520 nm (consulte la Tabla de materiales), que ilumina desde la parte inferior con una buena alineación con cada pocillo de una placa de 96 pocillos.
   2. Ajuste la suspensión de células de levadura en el medio YPD a un OD₆₀₀ de 0,65 (aproximadamente 1 × 10⁷ células/mL).
   3. Mezcle 1 mL de la suspensión de levadura con 111 μL de rosa de bengala al 2% (RB, Figura 1) (ver Tabla de Materiales) en un tubo de tapa redonda para obtener una concentración final de RB de 0.2%. Incubar la mezcla a 25 °C durante 15 min, girándola en un ángulo de 45° a 155 rpm.
   4. Transfiera la mezcla a un tubo de microcentrífuga de 1,5 ml y centrifuga a 16.100 x g durante 2,5 min (a temperatura ambiente).
   5. Deseche el sobrenadante y raspe suavemente el tubo cinco veces en el piso del capó para volver a suspender el pellet.
   6. Lave la suspensión con 1x PBS cuatro veces para quitar todo el RB. A cada lavado le sigue la resuspensión del pellet con un breve vórtice o pipeteo para una resuspensión completa.
      1. Después del lavado final, agregue 1000 μL de PBS. La solución es de color rosa claro. Transfiera 200 μL de la suspensión de levadura cargada de RB lavada a cada uno de los tres pocillos en una placa de 96 pocillos (triplicado).
   7. Coloque la placa de 96 pocillos en el sistema de iluminación fotodinámica con bombillas LED que emiten luz verde desde abajo. Apague las luces de la habitación para garantizar una iluminación uniforme y evitar interferencias. Active el sistema de luz LED para administrar la dosis de PDT de 4,38 J/^cm2 durante 2 min; Asegúrese de que el sistema esté correctamente alineado con los pozos.
   8. Después de la irradiación, diluya la suspensión de levadura en una placa de 96 pocillos. Agregue 20 μL de suspensión de levadura a un pocillo que contenga 180 μL de PBS, creando una dilución de 10 veces. Repita para las diluciones restantes para lograr un rango de ^10-1 a ^10-5.
   9. Elija cuatro factores de dilución (por ejemplo, ^10-2 a ^10-5) en función del ajuste de la concentración de la célula de levadura.
   10. Para cada factor de dilución, coloque 3 gotas (20 μL cada una) por cuadrante en placas de agar YPD.
   11. Después de que la suspensión de levadura se haya absorbido completamente, alrededor de 10 minutos por las placas de agar, invierta e incube durante la noche a 37 ° C.
   12. Defina T0 como el parental control de C. glabrata sin tratamiento con PDT. Prepare los hongos T0 en la fase de crecimiento del tronco como se ha descrito anteriormente y expóngalos a una luz verde de 4,38 J/^cm2 en presencia de 0,2% de RB. Esta condición de PDT inhibe consistentemente de 3 a 3.5 logs de crecimiento fúngico.
       1. Denote los hongos supervivientes como T1 y expóngalos a la misma dosis de PDT nuevamente después de que se expandan in vitro a una fase de crecimiento logarítmico. Los hongos que sobreviven después de la segunda PDT se denotan como T2 y así sucesivamente.
   13. Al día siguiente, elija cuadrantes con recuentos de colonias entre 5 y 80. Cuente el número de colonias en cada cuadrante y calcule el título con la siguiente fórmula: Unidad formadora de colonias (UFC)/mL = Número de colonias (promedio del triplicado) × Factor de dilución × 50.
   14. Realice la tinción TTC (consulte el paso 3). Escanee la placa como se describió anteriormente (paso 2.2).

3. Análisis de la función mitocondrial (prueba de tinción de TCC)

NOTA: TTC es un indicador redox y un aceptor de electrones. Se vuelve rojo cuando los compuestos blancos son rotos por los electrones¹¹. Tenga en cuenta que no todas las células forman necesariamente colonias visibles dentro de las 24 horas posteriores al cultivo en una placa de agar. Las colonias con mitocondrias funcionales se vuelven rojas, mientras que las que tienen mitocondrias no funcionales permanecen blancas. Esto permite la diferenciación entre colonias con diferente funcionalidad mitocondrial.

1. Después del tratamiento, diluya las suspensiones de Candida en placas de agar YPD de acuerdo con la densidad celular deseada para obtener colonias distintas para una fácil visualización y tinción.
2. Después de 24 h de crecimiento a 37 °C, se forman colonias visibles a partir de una sola célula. Pipetear 20 μL de TTC al 20% directamente en el centro de cada colonia.
3. Después de la absorción completa, alrededor de 10 min de TTC por parte de las colonias, incubar a 37 °C durante 30-40 min.

4. Cinética de crecimiento de C. glabrata normal y pequeña

NOTA: Se compararon tres cepas de levadura: C. glabrata C2-1000907 T0 (aislado clínico sin tratamiento con PDT), T3n (C. glabrata C2-1000907 después de 3 RB-PDT consecutivas exhibiendo colonias con un diámetro promedio de 1.5 ± 0.8 mm similar a las células parentales), y T3p (colonias pequeñas de C. glabrata C2-1000907 después de 3 RB-PDT consecutivas).

1. Ajuste la suspensión de células de levadura en medio YPD a un OD₆₀₀ de 0,1 (5 × 10⁶ células/mL) en un tubo de 3 mL.
2. Mida automáticamente el diámetro exterior₆₀₀ del cultivo estático cada 20 min utilizando el lector de microplacas multimodo (ver Tabla de Materiales) durante 24 h.

Resultados

Los datos se presentan como la media con ± error estándar y se obtuvieron de tres experimentos independientes, con al menos triplicados en cada grupo. Los datos experimentales, incluidos los recuentos de colonias, las mediciones de OD₆₀₀ y los resultados de tinción con TTC, se graficaron y analizaron estadísticamente utilizando gráficos y software estadístico (ver Tabla de Materiales). Para el análisis de los datos se utilizó un ANOVA de un factor o prueba t , y se consideró ...

Discusión

Este estudio revela que la PDT es el primer método reportado para inducir la formación de colonias pequeñas en Candida, superando los efectos establecidos del bromuro de etidio y el fluconazol. Esta nueva observación requiere una mayor exploración para desentrañar sus implicaciones tanto para la erradicación de hongos mediante la disminución de la virulencia como para la aparición de mecanismos de resistencia.

La TFD mediada por RB inhibe eficazmente el crecimiento de C. glabrata<...

Materiales

Name	Company	Catalog Number	Comments
0.22 μm filter	Merck, Taipei, Taiwan	Millex, SLGVR33RS
1.5 mL microfuge tube	Neptune, San Diego, USA	#3745
20% Triphenyltetrazolium chloride (TTC)	Sigma-Aldrich, MO, USA	T8877
5 mL polypropylene round bottom tube	Corning, AZ, USA	352059
5 mL round-bottom tube with cell strainer cap	Corning, AZ, USA	Falcon, #352235
96-well plate	Alpha plus, Taoyuan Hsien, Taiwan	#16196
Agar	BRS, Tainan, Taiwan	AG012
Blank disk	Advantec, Tokyo, Japan	49005040
Centrifuge	Eppendorf, UK	5415R
Ethidium bromide solution	Sigma-Aldrich, MO, USA	E1510
Fluconazole, 2 mg/mL	Pfizer, NY, USA	BC18790248
GraphPad Prism	GraphPad Software	Version 7.0
Green light emitting diode (LED) strip	Nanyi electronics Co.,Ltd, Tainan, Taiwan	5050	Excitation wave: 500~550 nm
Low Temperature. shake Incubators	Yihder, Taipei, Taiwan	LM-570D (R)
Mouth care cotton swabs	Good Verita Enterprise, Taipei, Taiwan	161357
Muller Hinton II agar	BD biosciences, California, USA	211438
Multimode microplate reader	Molecular Devices	SpectraMax i3x
OD600 spectrophotometer	Biochrom, London, UK	Ultrospec 10
Rose Bengal	Sigma-Aldrich, USA	330000	stock concentration 40 mg/mL = 4%, prepare in PBS, stored at 4 °C
Sterilized glass tube	Sunmei, Tainan, Taiwan	AK45048-16100
Yeast Extract Peptone Dextrose Medium	HIMEDIA, India	M1363