Induzione di piccole colonie in Candida glabrato tramite terapia fotodinamica mediata dal Rose Bengala

Riepilogo

Il significato delle piccole colonie nella resistenza ai farmaci di Candida spp. non è stato completamente esplorato. La terapia fotodinamica antimicrobica (aPDT) offre una strategia promettente contro le infezioni fungine resistenti ai farmaci. Questo studio dimostra che l'aPDT mediata dal bengala rosa disattiva efficacemente la Candida glabrata e induce piccole colonie, presentando una procedura unica.

Abstract

Di fronte a un tasso di mortalità del 40% nei pazienti con candidemia, la Candida resistente ai farmaci e i loro piccoli mutanti rimangono una delle principali sfide terapeutiche. La terapia fotodinamica antimicrobica (aPDT) prende di mira più strutture fungine, a differenza degli antibiotici/antimicotici, contrastando potenzialmente la resistenza. I metodi tradizionali per indurre piccole colonie si basano sul bromuro di etidio o sul fluconazolo, che possono influenzare la suscettibilità ai farmaci e le risposte allo stress. Questo studio ha studiato l'applicazione della luce verde (picco 520 nm) e del fotosensibilizzatore del bengala rosa (RB) per combattere un isolato di Candida glabrata resistente ai farmaci. I risultati hanno rivelato che il trattamento con aPDT ha inibito significativamente la crescita cellulare (riduzione del ≥99,9%) e ha indotto efficacemente la formazione di colonie piccole, come evidenziato dalle dimensioni ridotte e dalla perdita della colorazione dell'indicatore redox mitocondriale. Questo studio fornisce la prova iniziale che l'aPDT può indurre colonie piccole in un ceppo di C. glabrata multiresistente in vitro, offrendo un approccio potenzialmente trasformativo per combattere le infezioni fungine resistenti.

Introduzione

Le infezioni fungine, in particolare quelle causate dalla Candida albicans e dalla Candida glabrata, sempre più resistente ai farmaci, rappresentano una seria minaccia globale¹. Queste infezioni possono essere mortali, specialmente per i pazienti ospedalizzati e quelli con un sistema immunitario indebolito. L'aumento della resistenza antifungina minaccia il controllo della candidosi invasiva, una grave infezione fungina con elevata mortalità, in particolare da Candida albicans². I ceppi resistenti ostacolano un trattamento efficace, aumentando potenzialmente sia la complessità che i tassi di mortalità. Nella contea di Alameda, California, USA, C. glabrata è diventata la specie invasiva più diffusa³. Questo cambiamento nella prevalenza e nella distribuzione delle specie di Candida può essere influenzato dalle pratiche sanitarie locali, dai dati demografici dei pazienti, dall'utilizzo di agenti antifungini e dalla prevalenza dei fattori di rischio per le infezioni da Candida.

Piccoli mutanti nella Candida, privi di mitocondri funzionali, rivelano come questo organello influenzi la risposta ai farmaci, la virulenza e la resistenza allo stress ^4,5. C. glabrata forma facilmente queste colonie, acquisendo sensibilità ai polieni mentre la perde a favore degli azoli⁶. La sensibilità azolica e la funzione respiratoria sono strettamente collegate, con una diminuzione della respirazione che porta alla resistenza attraverso la perdita di DNA mitocondriale⁷. Piccole colonie di C. glabrata con resistenza all'azolo sono state isolate da campioni di feci umane da un ricevente di trapianto di midollo osseo sottoposto a trattamento con fluconazolo⁸ e da flaconi di emocoltura di pazienti con infezioni del flusso sanguigno⁹. Le loro potenziali implicazioni nella resistenza ai farmaci, nella virulenza e nella risposta allo stress evidenziano il loro significato clinico. Inoltre, le loro proprietà distinte li rendono strumenti preziosi per indagare su questioni fondamentali nella biologia mitocondriale⁵. Man mano che la ricerca sui mutanti petite continua, è probabile che le loro applicazioni nella ricerca clinica e di base si espandano.

Questo studio ha scoperto che la terapia fotodinamica (PDT) può indurre piccole colonie in C. glabrata, ampliando la gamma di metodi oltre le tecniche tradizionali di esposizione di C. glabrata al bromuro di etidio o al fluconazolo.

Protocollo

1. Coltura di C. glabrata

NOTA: Per gli esperimenti viene utilizzato un C. glabrata multiresistente (C2-1000907) resistente alla maggior parte degli agenti antifungini, incluso il fluconazolo. Potrebbe essere necessario adattare le condizioni sperimentali al ceppo specifico, poiché possono esistere variazioni tra ceppi diversi. Tutti gli esperimenti hanno utilizzato Candida in fase logaritmica coltivata a 25 °C (che imita l'infezione naturale) per coerenza. La mancanza di ife di C. glabrata semplifica la quantificazione rispetto a C. albicans, che forma ife a 37 °C¹⁰.

1. Per preparare una coltura in fase loglogaritmica di C. glabrata, prelevare una singola colonia da una piastra di agar e trasferirla in una provetta di vetro con 3 ml di terreno sterile di peptone destrosio di lievito (YPD) (vedere Tabella dei materiali). Incubare per 14-16 ore a 25 °C agitando (155 giri/min, angolo di 45° per aumentare la trasmissione dell'aria al fluido).
2. Dopo l'incubazione, diluire la coltura con YPD fresco a un OD₆₀₀ di 0,1 utilizzando una tecnica sterile. Incubare a 25 °C per 6 h agitando a 155 giri/min. Verificare la fase logaritmica di C. glabrata misurando l'OD₆₀₀. Puntare a 0,65-1,00, che corrisponde a 1 × 10 7-1,5 × 10⁷ cellule/mL.

2. Induzione di piccole colonie mediante bromuro di etidio, fluconazolo e terapia fotodinamica

1. Induzione di piccole colonie di bromuro di etidio
   1. Regolare una sospensione di lievito a una OD₆₀₀ di 0,1 (5 × 10⁶ cellule/mL) con YPD a un volume finale di 3 mL, quindi aggiungere 30 μL di bromuro di etidio (10 mg/mL) (vedere la Tabella dei materiali) per una concentrazione finale di 100 μg/mL.
   2. Incubare la sospensione di lievito per una notte (16-18 h) a 25 °C, 155 giri/min, angolo di 45°. Regolare su un OD₆₀₀ di 0,65 (1 × 10⁷ cellule/mL). Eseguire una serie di diluizioni di 10 volte in una piastra a 96 pozzetti aggiungendo 20 μl della sospensione di lievito aggiustata a 180 μl di PBS per pozzetto. Questo crea sei diluizioni che vanno da ^10-1 a ^10-5.
   3. Selezionare 4 fattori di diluizione (ad es. 10⁰, 10¹, 10² e 10³) e piastra 3 gocce (20 μL) ciascuna su 4 quadranti di piastre di agar YPD (triplicate).
   4. Incubare le piastre per una notte a 37 °C. Selezionare i quadranti con 5-80 colonie dalle diluizioni precedentemente scelte per la colorazione con tricheniltetrazolio cloruro (TTC)¹¹ (vedere fase 3). Scansiona le lastre a 1200 dpi utilizzando uno scanner ottico a colori a 48 bit.
2. Induzione di piccole colonie di fluconazolo
   NOTA: Per accelerare il processo, utilizzare cellule T3 (una miscela di cellule normali e piccole ottenute dopo 3 trattamenti RB-PDT; vedere fase 2.3) per la formazione di piccole colonie indotta dal fluconazolo. Questo perché il trattamento standard in genere provoca una formazione più lenta.
   1. Preparare e regolare una sospensione di cellule di lievito come descritto al punto 2.1.1.
   2. Incubare per una notte (16-18 h) a 25 °C. Regolare nuovamente l'OD₆₀₀ a 0.1.
   3. Trasferire 1 mL della sospensione regolata in una provetta sterile da 5 mL.
   4. Immergere un batuffolo di cotone sterile (lungo 15 cm, con una punta di 0,9 cm x 2,6 cm, vedere Tabella dei materiali) nella sospensione di lievito, assicurandosi del contatto con il fondo della provetta e ruotandolo per rimuovere il liquido in eccesso dalla parete della provetta.
   5. Preparare le piastre nella cappa utilizzando l'agar Mueller-Hinton (vedi Tabella dei materiali).
   6. Tampona il cotone avanti e indietro sull'agar, ruota di 60° due volte, quindi tampona il perimetro per una copertura uniforme.
   7. Sterilizzare le pinze sulla fiamma per 1-2 s, lasciandole raffreddare brevemente, quindi usarle per raccogliere i dischi vuoti.
   8. Dividi il piatto in tre settori uguali usando un pennarello. Posizionare un disco vuoto al centro di ogni settore.
   9. Aggiungere 12,5 μL di brodo di fluconazolo (2 mg/mL, vedere la Tabella dei materiali) a ciascun disco (25 μg/disco), mescolare accuratamente per evitare bolle e incubare a 37 °C per 20-24 ore.
   10. Eseguire la colorazione TTC (vedere il passaggio 3). Scansiona le lastre a 1200 dpi utilizzando uno scanner ottico a colori a 48 bit.
3. Induzione di colonie di PDT
   NOTA: Funghi diversi possono produrre un numero diverso di piccole colonie dopo la PDT. Alcuni ceppi potrebbero non produrne affatto.
   1. Preparare il sistema aPDT.
      NOTA: La procedura di configurazione per il dispositivo del sistema aPDT segue il metodo riportato da Hung et al¹². In breve, il sistema aPDT è costituito da un array di LED verdi con un picco a 520 nm (vedi Tabella dei materiali), che illumina la luce dal basso con un buon allineamento con ciascun pozzetto di una piastra a 96 pozzetti.
   2. Regolare la sospensione di cellule di lievito nel terreno YPD a un OD₆₀₀ di 0,65 (circa 1 × 10⁷ cellule/mL).
   3. Miscelare 1 mL della sospensione di lievito con 111 μL di rosa bengala al 2% (RB, Figura 1) (vedere la Tabella dei materiali) in una provetta con tappo rotondo per ottenere una concentrazione finale di RB dello 0,2%. Incubare la miscela a 25 °C per 15 minuti, ruotandola con un angolo di 45° a 155 giri/min.
   4. Trasferire la miscela in una provetta da microcentrifuga da 1,5 ml e centrifugare a 16.100 x g per 2,5 minuti (a temperatura ambiente).
   5. Scartare il surnatante e raschiare delicatamente il tubo cinque volte sul fondo della cappa per risospendere il pellet.
   6. Lavare la sospensione con 1x PBS quattro volte per rimuovere tutto l'RB. Ogni lavaggio è seguito da una risospensione del pellet con un breve vortice o pipettaggio per una risospensione completa.
      1. Dopo il lavaggio finale, aggiungere 1000 μL di PBS. La soluzione è di colore rosa chiaro. Trasferire 200 μl della sospensione di lievito caricata con RB lavata in ciascuno dei tre pozzetti in una piastra a 96 pozzetti (triplicata).
   7. Posizionare la piastra a 96 pozzetti sul sistema di illuminazione fotodinamica con lampadine a LED che emettono luce verde dal basso. Spegnere le luci della stanza per garantire un'illuminazione uniforme ed evitare interferenze. Attivare il sistema di illuminazione a LED per erogare la dose di PDT di 4,38 J/cm² in 2 minuti; Assicurarsi che il sistema sia correttamente allineato con i pozzetti.
   8. Dopo l'irradiazione, diluire la sospensione di lievito in una piastra a 96 pozzetti. Aggiungere 20 μL di sospensione di lievito in un pozzetto contenente 180 μL di PBS, creando una diluizione di 10 volte. Ripetere per le diluizioni rimanenti per ottenere un intervallo da ^10-1 a ^10-5.
   9. Scegli quattro fattori di diluizione (ad esempio, da ^10-2 a ^10-5) in base all'aggiustamento della concentrazione delle cellule di lievito.
   10. Per ogni fattore di diluizione, piastra 3 gocce (20 μL ciascuna) per quadrante su piastre di agar YPD.
   11. Dopo che la sospensione di lievito è stata completamente assorbita, circa 10 minuti dalle piastre di agar, capovolgere e incubare per una notte a 37 °C.
   12. Definire T0 come il parente di controllo C. glabrata senza trattamento PDT. Preparare i funghi T0 nella fase di crescita del tronco come descritto sopra ed esporli a 4,38 J/^cm2 di luce verde in presenza dello 0,2% di RB. Questa condizione di PDT inibisce costantemente da 3 a 3,5 log di crescita fungina.
       1. Denotare i funghi sopravvissuti come T1 ed esporli nuovamente alla stessa dose di PDT dopo che sono stati espansi in vitro in una fase di crescita logaritmica. I funghi sopravvissuti dopo la seconda PDT sono indicati come T2 e così via.
   13. Il giorno successivo, scegli quadranti con un numero di colonie compreso tra 5 e 80. Contare il numero di colonie in ciascun quadrante e calcolare il titolo con la seguente formula: Unità formante colonia (CFU)/mL = Numero di colonie (media del triplicato) × Fattore di diluizione × 50.
   14. Eseguire la colorazione TTC (vedere il passaggio 3). Scansiona la lastra come descritto in precedenza (passaggio 2.2).

3. Analisi della funzione mitocondriale (test di colorazione TCC)

NOTA: TTC è un indicatore redox e un accettore di elettroni. Diventa rosso quando i composti bianchi vengono rotti dagli elettroni¹¹. Si noti che non tutte le cellule formano necessariamente colonie visibili entro 24 ore dalla coltura su una piastra di agar. Le colonie con mitocondri funzionali diventano rosse, mentre quelle con mitocondri non funzionali rimangono bianche. Ciò consente la differenziazione tra colonie con diversa funzionalità mitocondriale.

1. Dopo il trattamento, diluire le sospensioni di Candida su piastre di agar YPD in base alla densità cellulare desiderata per ottenere colonie distinte per una facile visualizzazione e colorazione.
2. Dopo 24 ore di crescita a 37 °C, le colonie visibili si formano da una singola cellula. Pipettare 20 μl di TTC al 20% direttamente al centro di ciascuna colonia.
3. Dopo il completo assorbimento, circa 10 minuti di TTC da parte delle colonie, incubare a 37 °C per 30-40 minuti.

4. Cinetica di crescita di C. glabrata normale e piccola

NOTA: Sono stati confrontati tre ceppi di lievito: C. glabrata C2-1000907 T0 (isolato clinico senza trattamento con PDT), T3n (C. glabrata C2-1000907 dopo 3 colonie consecutive che presentano RB-PDT con un diametro medio di 1,5 ± 0,8 mm simile alle cellule parentali) e T3p (piccole colonie di C. glabrata C2-1000907 dopo 3 RB-PDT consecutive).

1. Regolare la sospensione di cellule di lievito in terreno YPD a un OD₆₀₀ di 0,1 (5 × 10⁶ cellule/mL) in una provetta da 3 mL.
2. Misurare automaticamente l'OD₆₀₀ della coltura statica ogni 20 minuti utilizzando il lettore di micropiastre multimodale (vedi Tabella dei materiali) per 24 ore.

Risultati

I dati sono presentati come media con ± errore standard e sono stati ottenuti da tre esperimenti indipendenti, con almeno triplicati in ciascun gruppo. I dati sperimentali, inclusi i conteggi delle colonie, le misurazioni OD₆₀₀ e i risultati della colorazione TTC, sono stati rappresentati graficamente e analizzati statisticamente utilizzando grafici e software statistici (vedi Tabella dei materiali). Per analizzare i dati è stata utilizzata l'ANOVA unidirezionale o il t-test e un va...

Discussione

Questo studio rivela la PDT come il primo metodo riportato per indurre la formazione di piccole colonie nella Candida, superando gli effetti stabiliti del bromuro di etidio e del fluconazolo. Questa nuova osservazione richiede ulteriori esplorazioni per svelare le sue implicazioni sia per l'eradicazione fungina diminuendo la virulenza che per l'emergere di meccanismi di resistenza.

La PDT mediata da RB inibisce efficacemente la crescita di C. glabrata, suggerendo un potenziale approcc...

Materiali

Name	Company	Catalog Number	Comments
0.22 μm filter	Merck, Taipei, Taiwan	Millex, SLGVR33RS
1.5 mL microfuge tube	Neptune, San Diego, USA	#3745
20% Triphenyltetrazolium chloride (TTC)	Sigma-Aldrich, MO, USA	T8877
5 mL polypropylene round bottom tube	Corning, AZ, USA	352059
5 mL round-bottom tube with cell strainer cap	Corning, AZ, USA	Falcon, #352235
96-well plate	Alpha plus, Taoyuan Hsien, Taiwan	#16196
Agar	BRS, Tainan, Taiwan	AG012
Blank disk	Advantec, Tokyo, Japan	49005040
Centrifuge	Eppendorf, UK	5415R
Ethidium bromide solution	Sigma-Aldrich, MO, USA	E1510
Fluconazole, 2 mg/mL	Pfizer, NY, USA	BC18790248
GraphPad Prism	GraphPad Software	Version 7.0
Green light emitting diode (LED) strip	Nanyi electronics Co.,Ltd, Tainan, Taiwan	5050	Excitation wave: 500~550 nm
Low Temperature. shake Incubators	Yihder, Taipei, Taiwan	LM-570D (R)
Mouth care cotton swabs	Good Verita Enterprise, Taipei, Taiwan	161357
Muller Hinton II agar	BD biosciences, California, USA	211438
Multimode microplate reader	Molecular Devices	SpectraMax i3x
OD600 spectrophotometer	Biochrom, London, UK	Ultrospec 10
Rose Bengal	Sigma-Aldrich, USA	330000	stock concentration 40 mg/mL = 4%, prepare in PBS, stored at 4 °C
Sterilized glass tube	Sunmei, Tainan, Taiwan	AK45048-16100
Yeast Extract Peptone Dextrose Medium	HIMEDIA, India	M1363