Rose Bengal Aracılı Fotodinamik Terapi ile Candida glabrate'de Minyon Kolonilerin İndüksiyonu

Özet

Candida spp. ilaç direncinde minyon kolonilerin önemi tam olarak araştırılmamıştır. Antimikrobiyal fotodinamik tedavi (aPDT), ilaca dirençli mantar enfeksiyonlarına karşı umut verici bir strateji sunmaktadır. Bu çalışma, gül bengal aracılı aPDT'nin Candida glabrata'yı etkili bir şekilde deaktive ettiğini ve küçük kolonileri indükleyerek benzersiz bir prosedür sunduğunu göstermektedir.

Özet

Kandidemi hastalarında %40'lık bir mortalite oranıyla karşı karşıya kalan ilaca dirençli Candida ve minyon mutantları önemli bir tedavi zorluğu olmaya devam etmektedir. Antimikrobiyal fotodinamik tedavi (aPDT), antibiyotikler/antifungallerden farklı olarak çoklu mantar yapılarını hedefler ve potansiyel olarak direnci engeller. Minyon kolonileri indüklemek için geleneksel yöntemler, ilaca duyarlılığı ve stres tepkilerini etkileyebilen etidyum bromür veya flukonazole dayanır. Bu çalışma, ilaca dirençli bir Candida glabrata izolatı ile mücadele etmek için yeşil ışık (tepe 520 nm) ve gül bengal (RB) ışığa duyarlılaştırıcı uygulamasını araştırdı. Bulgular, aPDT tedavisinin hücre büyümesini önemli ölçüde inhibe ettiğini (%≥99.9 azalma) ve mitokondriyal redoks indikatör boyamasının boyutunun azalması ve kaybıyla kanıtlandığı gibi minyon koloni oluşumunu etkili bir şekilde indüklediğini ortaya koydu. Bu çalışma, aPDT'nin in vitro olarak çok ilaca dirençli bir C. glabrata suşunda minyon kolonileri indükleyebileceğine dair ilk kanıtları sağlamakta ve dirençli mantar enfeksiyonlarıyla mücadele için potansiyel olarak dönüştürücü bir yaklaşım sunmaktadır.

Giriş

Mantar enfeksiyonları, özellikle Candida albicans ve ilaca giderek daha dirençli Candida glabrata'nın neden olduğu enfeksiyonlar, ciddi bir küresel tehdit oluşturmaktadır¹. Bu enfeksiyonlar, özellikle hastanede yatan hastalar ve bağışıklık sistemi zayıflamış olanlar için ölümcül olabilir. Artan antifungal direnç, özellikle Candida albicans^2'den yüksek mortalite ile ciddi bir mantar enfeksiyonu olan invaziv kandidiyazisin kontrolünü tehdit eder. Dirençli suşlar etkili tedaviyi engelleyerek potansiyel olarak hem karmaşıklığı hem de ölüm oranlarını artırır. ABD'nin Kaliforniya eyaletine bağlı Alameda County'de C. glabrata en yaygın istilacı tür haline gelmiştir³. Candida türlerinin prevalansı ve dağılımındaki bu değişim, yerel sağlık uygulamaları, hasta demografisi, antifungal ajanların kullanımı ve Candida enfeksiyonları için risk faktörlerinin prevalansından etkilenebilir.

Fonksiyonel mitokondriden yoksun olan Candida'daki minyon mutantlar, bu organelin ilaç tepkisini, virülansı ve stres direncini nasıl etkilediğini ortaya koymaktadır ^4,5. C. glabrata bu kolonileri kolayca oluşturur, polienlere karşı duyarlılık kazanırken onu azollere^{kaybeder 6}. Azol duyarlılığı ve solunum fonksiyonu karmaşık bir şekilde bağlantılıdır ve mitokondriyal DNA kaybı yoluyla dirence yol açan azalmış solunum^{ile 7}. Azol direncine sahip C. glabrata'nın minyon kolonileri, flukonazol tedavisi gören bir kemik iliği nakli alıcısından⁸ insan dışkı örneklerinden ve kan dolaşımı enfeksiyonu olan hastaların kan kültürü şişelerinden⁹ izole edilmiştir. İlaç direnci, virülans ve stres tepkisindeki potansiyel etkileri, klinik önemlerini vurgulamaktadır. Ek olarak, farklı özellikleri onları mitokondriyal biyolojideki temel soruları araştırmak için değerli araçlar haline getirir⁵. Minyon mutantlarla ilgili araştırmalar devam ettikçe, hem klinik hem de temel araştırmalardaki uygulamalarının genişlemesi muhtemeldir.

Bu çalışma, fotodinamik tedavinin (PDT) C. glabrata'da minyon kolonileri indükleyebileceğini ve C. glabrata'yı etidyum bromür veya flukonazole maruz bırakmanın geleneksel tekniklerinin ötesine geçen yöntem yelpazesini genişletebileceğini keşfetti.

Protokol

1. C. glabrata'nın kültürlenmesi

NOT: Deneyler için flukonazol de dahil olmak üzere çoğu antifungal ajana dirençli, çoklu ilaca dirençli bir C. glabrata (C2-1000907) kullanılmıştır. Farklı suşlar arasında farklılıklar olabileceğinden, deneysel koşulların spesifik suşa uyarlanması gerekebilir. Tüm deneyler, tutarlılık için 25 ° C'de (doğal enfeksiyonu taklit ederek) yetiştirilen log faz Candida'yı kullandı. C. glabrata'nın hif eksikliği, 37 ° C'de hif oluşturan C. albicans ile karşılaştırıldığında miktar tayinini basitleştirir¹⁰.

1. C. glabrata'nın log faz kültürünü hazırlamak için, bir agar plakasından tek bir koloni seçin ve bunu 3 mL steril maya pepton dekstroz (YPD) ortamı içeren bir cam test tüpüne aktarın (bkz. Çalkalayarak 25 ° C'de 14-16 saat inkübe edin (155 rpm, ortama hava iletimini artırmak için 45 ° açı).
2. İnkübasyondan sonra, kültürü steril teknik kullanarak taze YPD ile 0.1 OD_600'e seyreltin. 25 °C'de 6 saat boyunca 155 rpm'de çalkalayarak inkübe edin. OD_600'ü ölçerek C. glabrata'nın günlük fazını doğrulayın. 1 × 10 7-1.5 × 10 7 hücre/mL'ye karşılık gelen 0.65-1.00'ı hedefleyin.

2. Etidyum bromür, flukonazol ve fotodinamik tedavi ile minyon kolonilerin indüksiyonu

1. Etidyum bromür minyon koloni indüksiyonu
   1. Bir maya süspansiyonunu YPD ile 3 mL'lik_bir nihai hacme kadar 0.1 (5 × 10⁶ hücre / mL) OD 600'e ayarlayın, ardından 30 μL etidyum bromür stoğu ekleyin (10 mg / mL) (100 μg / mL'lik bir nihai konsantrasyon için Malzeme Tablosuna bakınız).
   2. Maya süspansiyonunu gece boyunca (16-18 saat) 25 °C, 155 rpm, 45° açıyla inkübe edin. 0,65 (1 × 10⁷ hücre/mL) OD_600'e ayarlayın. Kuyucuk başına 180 μL PBS'ye 20 μL ayarlanmış maya süspansiyonu ekleyerek 96 oyuklu bir plakada 10 katlı bir seyreltme serisi gerçekleştirin. Bu, ^{10-1 ila 10-5} arasında değişen altı seyreltme oluşturur.
   3. 4 seyreltme faktörü seçin (ör., 10⁰, 10¹, 10² ve 10³) ve YPD agar plakalarının (üçlü) 4 çeyreğinde her biri 3 damla (20 μL) plaka.
   4. Plakaları gece boyunca 37 °C'de inkübe edin. Trifeniltetrazolyum klorür (TTC) boyama¹¹ için önceden seçilen seyreltmelerden 5-80 kolonili kadranları seçin (bkz. adım 3). 48 bit tam renkli optik tarayıcı kullanarak plakaları 1200 dpi'de tarayın.
2. Flukonazol minyon koloni indüksiyonu
   NOT: İşlemi hızlandırmak için, flukonazol kaynaklı minyon koloni oluşumu için T3 hücrelerini (3 RB-PDT tedavisinden sonra elde edilen normal ve minyon hücrelerin bir karışımı; bkz. adım 2.3) kullanın. Bunun nedeni, standart tedavinin tipik olarak daha yavaş oluşumla sonuçlanmasıdır.
   1. Adım 2.1.1'de açıklandığı gibi bir maya hücresi süspansiyonu hazırlayın ve ayarlayın.
   2. Gece boyunca (16-18 saat) 25 °C'de inkübe edin. OD_600'ü tekrar 0.1'e ayarlayın.
   3. Ayarlanmış süspansiyonun 1 mL'sini steril 5 mL'lik bir tüpe aktarın.
   4. Steril bir pamuklu çubuğu (15 cm uzunluğunda, 0,9 cm x 2,6 cm uçlu, Malzeme Tablosuna bakın) maya süspansiyonuna batırın, tüp tabanı ile teması sağlayın ve fazla sıvıyı tüp duvarından çıkarmak için bükün.
   5. Mueller-Hinton agar kullanarak kaputtaki plakaları hazırlayın ( Malzeme Tablosuna bakın).
   6. Pamuğu agar üzerinde ileri geri sürün, iki kez 60° döndürün, ardından eşit kapsama alanı için çevresini temizleyin.
   7. Forsepsleri 1-2 saniye alev üzerinde sterilize edin, kısa bir süre soğumalarına izin verin, ardından boş diskleri almak için kullanın.
   8. Bir işaretleyici kullanarak plakayı üç eşit sektöre bölün. Her sektörün ortasına bir boş disk yerleştirin.
   9. Her diske (25 μg/disk) 12,5 μL flukonazol stoğu (2 mg/mL, Malzeme Tablosuna bakınız) ekleyin, kabarcıkları önlemek için iyice karıştırın ve 37 ° C'de 20-24 saat inkübe edin.
   10. TTC boyamayı gerçekleştirin (bkz. adım 3). 48 bit tam renkli optik tarayıcı kullanarak plakaları 1200 dpi'de tarayın.
3. PDT minyon koloni indüksiyonu
   NOT: Farklı mantarlar, PDT'den sonra farklı sayıda minyon koloni üretebilir. Bazı suşlar hiç üretmeyebilir.
   1. aPDT sistemini hazırlayın.
      NOT: aPDT sistem cihazı için kurulum prosedürü, Hung ve ark.¹² tarafından bildirilen yöntemi takip eder. Kısaca, aPDT sistemi, 520 nm'de bir tepe noktasına sahip yeşil bir LED dizisinden oluşur (Malzeme Tablosuna bakınız), 96 oyuklu bir plakanın her bir oyuğu ile iyi bir hizalama ile alttan ışık parlar.
   2. YPD ortamındaki maya hücresi süspansiyonunu 0.65 OD_600'e (yaklaşık 1 × 10⁷ hücre / mL) ayarlayın.
   3. 1 mL maya süspansiyonunu 111 μL %2 gül bengal (RB, Şekil 1) ile karıştırın (Malzeme Tablosuna bakınız) yuvarlak kapaklı bir tüpte %0.2'lik bir nihai RB konsantrasyonu elde etmek için. Karışımı 25 °C'de 15 dakika inkübe edin ve 155 rpm'de 45°'lik bir açıyla döndürün.
   4. Karışımı 1.5 mL'lik bir mikrosantrifüj tüpüne aktarın ve 16.100 x g'da 2.5 dakika (oda sıcaklığında) santrifüjleyin.
   5. Süpernatanı atın ve peleti yeniden süspanse etmek için tüpü davlumbaz zemininde beş kez hafifçe kazıyın.
   6. Tüm RB'yi çıkarmak için süspansiyonu 1x PBS ile dört kez yıkayın. Her yıkamayı, kapsamlı bir yeniden süspansiyon için kısa bir vorteksleme veya pipetleme ile peletin yeniden süspansiyonu takip eder.
      1. Son yıkamadan sonra 1000 μL PBS ekleyin. Çözelti açık pembe renktedir. Yıkanmış RB yüklü maya süspansiyonunun 200 μL'sini 96 oyuklu bir plakadaki (üç katlı) üç kuyucuğun her birine aktarın.
   7. 96 oyuklu plakayı, aşağıdan yeşil ışık saçan LED ampullerle fotodinamik ışık sistemine yerleştirin. Eşit aydınlatma sağlamak ve paraziti önlemek için oda ışıklarını kapatın. 2 dakika boyunca 4.38 J /^cm2 PDT dozunu vermek için LED ışık sistemini etkinleştirin; Sistemin kuyularla düzgün şekilde hizalandığından emin olun.
   8. Işınlamadan sonra, maya süspansiyonunu 96 oyuklu bir plakada seyreltin. 180 μL PBS içeren bir kuyucuğa 20 μL maya süspansiyonu ekleyin ve 10 kat seyreltme oluşturun. ^{10-1 ila 10-5} aralığına ulaşmak için kalan seyreltmeler için tekrarlayın.
   9. Maya hücresi konsantrasyon ayarına bağlı olarak dört seyreltme faktörü (örneğin, ^10-2 ila ^10-5) seçin.
   10. Her seyreltme faktörü için, YPD agar plakaları üzerinde kadran başına 3 damla (her biri 20 μL) plaka.
   11. Maya süspansiyonu tamamen emildikten sonra, agar plakaları tarafından yaklaşık 10 dakika ters çevirin ve gece boyunca 37 °C'de inkübe edin.
   12. T0'ı PDT tedavisi olmayan kontrol ebeveyni C. glabrata olarak tanımlayın. T0 mantarlarını yukarıda tarif edildiği gibi kütük büyüme aşamasında hazırlayın ve bunları %0,2 RB varlığında 4,38 J/^cm2 yeşil ışığa maruz bırakın. Bu PDT koşulu sürekli olarak 3 ila 3.5 log mantar büyümesini engeller.
       1. Hayatta kalan mantarları T1 olarak belirtin ve in vitro olarak bir log büyüme aşamasına genişletildikten sonra tekrar aynı PDT dozuna maruz bırakın. İkinci PDT'den sonra hayatta kalan mantarlar T2 ve benzeri olarak gösterilir.
   13. Ertesi gün, koloni sayısı 5 ile 80 arasında olan kadranları seçin. Her kadrandaki koloni sayısını sayın ve titreyi aşağıdaki formülle hesaplayın: Koloni oluşturan birim (CFU)/mL = Koloni sayısı (üçlü ortalama) × Seyreltme faktörü × 50.
   14. TTC boyamayı gerçekleştirin (bkz. adım 3). Plakayı daha önce açıklandığı gibi tarayın (adım 2.2).

3. Mitokondriyal fonksiyon analizi (TCC boyama testi)

NOT: TTC bir redoks göstergesi ve bir elektron alıcısıdır. Beyaz bileşikler elektronlar¹¹ tarafından parçalandığında kırmızıya döner. Tüm hücrelerin, bir agar plakası üzerinde kültürden sonraki 24 saat içinde mutlaka görünür koloniler oluşturmadığını unutmayın. Fonksiyonel mitokondriye sahip koloniler kırmızıya dönerken, fonksiyonel olmayan mitokondriye sahip olanlar beyaz kalır. Bu, farklı mitokondriyal işlevselliğe sahip koloniler arasında ayrım yapılmasına izin verir.

1. İşlemden sonra, kolay görselleştirme ve boyama için farklı koloniler elde etmek için YPD agar plakaları üzerindeki Candida süspansiyonlarını istenen hücre yoğunluğuna göre seyreltin.
2. 37 ° C'de 24 saatlik büyümeden sonra, tek bir hücreden görünür koloniler oluşur. 20 μL %20 TTC'yi doğrudan her koloninin merkezine pipetleyin.
3. Tamamen emildikten sonra, koloniler tarafından yaklaşık 10 dakika TTC, 37 ° C'de 30-40 dakika inkübe edilir.

4. Normal ve minyon C. glabrata'nın büyüme kinetiği

NOT: Üç maya suşu karşılaştırıldı: C. glabrata C2-1000907 T0 (PDT tedavisi olmayan klinik izolat), T3n (C. glabrata C2-1000907, ebeveyn hücrelerine benzer şekilde ortalama çapı 1.5 ± 0.8 mm olan 3 ardışık RB-PDT sergileyen kolonilerden sonra) ve T3p (3 ardışık RB-PDT'den sonra C. glabrata C2-1000907'nin minyon kolonileri).

1. YPD ortamındaki maya hücresi süspansiyonunu 3 mL'lik bir tüpte 0.1 (5 × 10⁶ hücre / mL) OD_600'e ayarlayın.
2. Çok modlu mikroplaka okuyucuyu kullanarak statik kültürün OD_600'ünü her 20 dakikada bir otomatik olarak ölçün (Malzeme Tablosuna bakın) 24 saat boyunca.

Sonuçlar

Veriler, standart ± hata ile ortalama olarak sunulmuştur ve her grupta en az üç kopya olmak üzere üç bağımsız deneyden elde edilmiştir. Koloni sayımları, OD₆₀₀ ölçümleri ve TTC boyama sonuçları dahil olmak üzere deneysel veriler, grafik ve istatistiksel yazılım kullanılarak grafiklendirildi ve istatistiksel olarak analiz edildi (bkz. Verilerin analizinde tek yönlü varyans analizi (ANOVA) veya t-testi kullanıldı ve p-değeri <0.05 olarak anlamlı kabu...

Tartışmalar

Bu çalışma, PDT'yi Candida'da minyon koloni oluşumunu indüklemek için bildirilen ilk yöntem olarak ortaya koymakta ve etidyum bromür ve flukonazolün yerleşik etkilerini aşmaktadır. Bu yeni gözlem, virülansı azaltarak hem mantar eradikasyonu hem de direnç mekanizmalarının ortaya çıkması üzerindeki etkilerini ortaya çıkarmak için daha fazla araştırma yapılmasını gerektirmektedir.

RB aracılı PDT, C. glabrata'nın büyümesini etkili bir şekilde inhibe ede...

Malzemeler

Name	Company	Catalog Number	Comments
0.22 μm filter	Merck, Taipei, Taiwan	Millex, SLGVR33RS
1.5 mL microfuge tube	Neptune, San Diego, USA	#3745
20% Triphenyltetrazolium chloride (TTC)	Sigma-Aldrich, MO, USA	T8877
5 mL polypropylene round bottom tube	Corning, AZ, USA	352059
5 mL round-bottom tube with cell strainer cap	Corning, AZ, USA	Falcon, #352235
96-well plate	Alpha plus, Taoyuan Hsien, Taiwan	#16196
Agar	BRS, Tainan, Taiwan	AG012
Blank disk	Advantec, Tokyo, Japan	49005040
Centrifuge	Eppendorf, UK	5415R
Ethidium bromide solution	Sigma-Aldrich, MO, USA	E1510
Fluconazole, 2 mg/mL	Pfizer, NY, USA	BC18790248
GraphPad Prism	GraphPad Software	Version 7.0
Green light emitting diode (LED) strip	Nanyi electronics Co.,Ltd, Tainan, Taiwan	5050	Excitation wave: 500~550 nm
Low Temperature. shake Incubators	Yihder, Taipei, Taiwan	LM-570D (R)
Mouth care cotton swabs	Good Verita Enterprise, Taipei, Taiwan	161357
Muller Hinton II agar	BD biosciences, California, USA	211438
Multimode microplate reader	Molecular Devices	SpectraMax i3x
OD600 spectrophotometer	Biochrom, London, UK	Ultrospec 10
Rose Bengal	Sigma-Aldrich, USA	330000	stock concentration 40 mg/mL = 4%, prepare in PBS, stored at 4 °C
Sterilized glass tube	Sunmei, Tainan, Taiwan	AK45048-16100
Yeast Extract Peptone Dextrose Medium	HIMEDIA, India	M1363