Индукция миниатюрных колоний у Candida glabrate с помощью фотодинамической терапии, опосредованной Rose Bengal

Резюме

Значение миниатюрных колоний в лекарственной устойчивости Candida spp. до конца не изучено. Антимикробная фотодинамическая терапия (аФДТ) предлагает многообещающую стратегию против лекарственно-устойчивых грибковых инфекций. Это исследование демонстрирует, что аФДТ, опосредованная бенгальской розой, эффективно деактивирует Candida glabrata и индуцирует миниатюрные колонии, представляя собой уникальную процедуру.

Аннотация

Сталкиваясь с 40% смертностью у пациентов с кандидемией, лекарственно-устойчивые Candida и их миниатюрные мутанты остаются серьезной проблемой лечения. Антимикробная фотодинамическая терапия (аФДТ) нацелена на несколько грибковых структур, в отличие от антибиотиков/противогрибковых препаратов, потенциально препятствуя резистентности. Традиционные методы индуцирования миниатюрных колоний основаны на бромиде этидия или флуконазоле, которые могут влиять на чувствительность к лекарствам и реакцию на стресс. В этом исследовании изучалось применение зеленого света (пик 520 нм) и фотосенсибилизатора розовой бенгалии (RB) для борьбы с лекарственно-устойчивым изолятом Candida glabrata . Результаты показали, что лечение аФДТ значительно ингибировало рост клеток (снижение на ≥99,9%) и эффективно индуцировало образование миниатюрных колоний, о чем свидетельствует уменьшение размера и потеря окрашивания митохондриальных окислительно-восстановительных индикаторов. Это исследование предоставляет первоначальные доказательства того, что аФДТ может индуцировать миниатюрные колонии в штамме C. glabrata с множественной лекарственной устойчивостью in vitro, предлагая потенциально трансформационный подход к борьбе с устойчивыми грибковыми инфекциями.

Введение

Грибковые инфекции, особенно вызванные Candida albicans и все более устойчивой к лекарствам Candida glabrata, представляют серьезную глобальную угрозу¹. Эти инфекции могут быть смертельными, особенно для госпитализированных пациентов и людей с ослабленной иммунной системой. Растущая устойчивость к противогрибковым препаратам угрожает борьбе с инвазивным кандидозом, тяжелой грибковой инфекцией с высокой смертностью, особенно от Candida albicans². Резистентные штаммы препятствуют эффективному лечению, потенциально увеличивая как сложность, так и смертность. В округе Аламеда, штат Калифорния, США, C. glabrata стал наиболее распространенным инвазивным видом³. На этот сдвиг в распространенности и распространении видов Candida могут влиять местные методы здравоохранения, демографические данные пациентов, использование противогрибковых препаратов и распространенность факторов риска инфекций Candida.

Миниатюрные мутанты у Candida, лишенные функциональных митохондрий, показывают, как эта органелла влияет на реакцию на лекарства, вирулентность и стрессоустойчивость ^4,5. C. glabrata легко образует эти колонии, приобретая чувствительность к полиенам, но теряя ее к азолам⁶. Чувствительность к азолам и дыхательная функция тесно связаны, при этом снижение дыхания приводит к резистентности из-за потери митохондриальной ДНК⁷. Миниатюрные колонии C. glabrata с резистентностью к азолам были выделены из образцов стула человека от реципиента трансплантата костного мозга, проходящего лечение флуконазолом⁸, и из флаконов для посева крови пациентов с инфекциями кровотока⁹. Их потенциальное влияние на лекарственную устойчивость, вирулентность и реакцию на стресс подчеркивает их клиническую значимость. Кроме того, их отличительные свойства делают их ценными инструментами для исследования фундаментальных вопросов митохондриальной биологии⁵. По мере продолжения исследований миниатюрных мутантов их применение как в клинических, так и в фундаментальных исследованиях, вероятно, будет расширяться.

Это исследование показало, что фотодинамическая терапия (ФДТ) может индуцировать миниатюрные колонии у C. glabrata, расширяя диапазон методов за пределы традиционных методов воздействия на C. glabrata бромида этидия или флуконазола.

протокол

1. Культивирование C. glabrata

Примечание: Для экспериментов используется C. glabrata с множественной лекарственной устойчивостью (C2-1000907), устойчивый к большинству противогрибковых агентов, включая флуконазол. Экспериментальные условия, возможно, придется адаптировать к конкретному штамму, так как между различными штаммами могут существовать вариации. Во всех экспериментах использовалась логарифмическая фаза Candida, выращенная при 25 °C (имитирующая естественную инфекцию) для консистенции. Отсутствие гиф у C. glabrata упрощает количественное определение по сравнению с C. albicans, который образует гифы при 37 °C¹⁰.

1. Чтобы приготовить логарифмическую культуру C. glabrata, выберите одну колонию из агарового планшета и перенесите ее в стеклянную пробирку с 3 мл стерильной среды пептон-декстрозы дрожжей (YPD) (см. Таблицу материалов). Инкубировать в течение 14-16 ч при 25 °C с встряхиванием (155 об/мин, угол 45° для увеличения пропускания воздуха в среду).
2. После инкубации разбавьте культуру свежим YPD до наружного диаметра₆₀₀ 0,1 стерильным методом. Инкубировать при 25 °C в течение 6 ч с встряхиванием при 155 об/мин. Проверьте логарифмическую фазу C. glabrata, измерив наружный диаметр₆₀₀. Стремитесь к 0,65-1,00, что соответствует 1 × 10 7-1,5 × 10⁷ клеток/мл.

2. Индукция миниатюрных колоний бромидом этидия, флуконазолом и фотодинамической терапией

1. Индукция миниатюрной колонии бромида этидия
   1. Доведите дрожжевую суспензию до наружного диаметра₆₀₀ 0,1 (5 × 10⁶ клеток/мл) с YPD до конечного объема 3 мл, затем добавьте 30 мкл запаса бромида этидия (10 мг/мл) (см. Таблицу материалов) для получения конечной концентрации 100 мкг/мл.
   2. Дрожжевую суспензию инкубировать в течение ночи (16-18 ч) при температуре 25 °С, 155 об/мин, угле 45°. Отрегулируйте внешний диаметр₆₀₀ 0,65 (1 × 10⁷ клеток/мл). Выполните серию 10-кратного разбавления в 96-луночном планшете, добавив 20 мкл отрегулированной суспензии дрожжей к 180 мкл PBS на лунку. Это создает шесть разведений в диапазоне от ^10-1 до ^10-5.
   3. Выберите 4 коэффициента разведения (например, 10⁰, 10¹, 10² и 10³) и поместите 3 капли (20 μл) на 4 квадрантах агаровых планшетов YPD (в три раза).
   4. Инкубируйте планшеты в течение ночи при 37 °C. Выберите квадранты с 5-80 колониями из ранее выбранных разведений для окрашивания трифенилтетразолия хлорида (ТТС)¹¹ (см. шаг 3). Сканируйте пластины с разрешением 1200 точек на дюйм с помощью 48-битного полноцветного оптического сканера.
2. Индукция колонии флуконазола петит
   ПРИМЕЧАНИЕ: Чтобы ускорить процесс, используйте Т3-клетки (смесь нормальных и миниатюрных клеток, полученную после 3 обработок RB-PDT; см. шаг 2.3) для образования миниатюрных колоний, индуцированных флуконазолом. Это связано с тем, что стандартная обработка обычно приводит к более медленному образованию.
   1. Приготовьте и отрегулируйте суспензию дрожжевых клеток, как описано в шаге 2.1.1.
   2. Инкубировать в течение ночи (16-18 ч) при 25 °C. Снова отрегулируйте внешний диаметр₆₀₀ на 0,1.
   3. Переложите 1 мл отрегулированной суспензии в стерильную 5 мл пробирку.
   4. Окуните стерильный ватный тампон (длиной 15 см, с наконечником 0,9 см х 2,6 см, см. Таблицу материалов) в дрожжевую суспензию, обеспечивая контакт со дном трубки и скручивая, чтобы удалить лишнюю жидкость со стенки трубки.
   5. Подготовьте пластины в вытяжке с помощью агара Мюллера-Хинтона (см. Таблицу материалов).
   6. Проведите ватой вперед и назад по агару, дважды поверните на 60°, затем проведите тампоном по периметру для равномерного покрытия.
   7. Стерилизуйте щипцы над пламенем в течение 1-2 с, давая им немного остыть, затем используйте их, чтобы собрать чистые диски.
   8. Разделите пластину на три равных сектора с помощью маркера. Поместите по одному пустому диску в центр каждого сектора.
   9. Добавьте 12,5 мкл флуконазола (2 мг/мл, см. Таблицу материалов) в каждый диск (25 мкг/диск), тщательно перемешайте, чтобы избежать образования пузырьков, и инкубируйте при 37 °C в течение 20-24 ч.
   10. Выполните окрашивание TTC (см. шаг 3). Сканируйте пластины с разрешением 1200 точек на дюйм с помощью 48-битного полноцветного оптического сканера.
3. Индукция малой колонии ФДТ
   ПРИМЕЧАНИЕ: Разные грибы могут производить разное количество миниатюрных колоний после ФДТ. Некоторые штаммы могут вообще их не производить.
   1. Подготовьте систему aPDT.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Процедура настройки устройства системы aPDT соответствует методу, описанному Hung et al¹². Вкратце, система aPDT состоит из зеленого светодиодного массива с пиком на 520 нм (см. Таблицу материалов), излучающего свет снизу с хорошим выравниванием с каждой лункой 96-луночного планшета.
   2. Отрегулируйте суспензию дрожжевых клеток в среде YPD до наружного диаметра₆₀₀ 0,65 (около 1 × 10⁷ клеток/мл).
   3. Смешайте 1 мл дрожжевой суспензии со 111 мкл 2% розовой бенгальской (RB, рис. 1) (см. таблицу материалов) в пробирке с круглым колпачком, чтобы получить конечную концентрацию RB 0,2%. Инкубируйте смесь при температуре 25 °C в течение 15 минут, вращая ее под углом 45° при 155 об/мин.
   4. Переложите смесь в микроцентрифужную пробирку объемом 1,5 мл и центрифугируйте при давлении 16 100 x g в течение 2,5 мин (при комнатной температуре).
   5. Выбросьте надосадочную жидкость и аккуратно соскребите трубку пять раз по полу вытяжки, чтобы снова суспендировать гранулу.
   6. Промойте суспензию 1x PBS четыре раза, чтобы удалить весь RB. После каждой промывки происходит ресуспендирование гранулы с коротким вихревым или пипетированием для тщательной ресуспендирования.
      1. После окончательной промывки добавьте 1000 μл PBS. Раствор светло-розового цвета. Перенесите по 200 мкл промытой дрожжевой суспензии, загруженной RB, в каждую из трех лунок в 96-луночном планшете (в трех экземплярах).
   7. Расположите 96-луночный планшет на фотодинамической световой системе со светодиодными лампами, светящими зеленым светом снизу. Выключите свет в комнате, чтобы обеспечить равномерное освещение и предотвратить помехи. Активируйте систему светодиодного освещения для подачи дозы ФДТ 4,38 Дж/^см2 в течение 2 мин; Убедитесь, что система правильно выровнена по скважинам.
   8. После облучения разбавьте дрожжевую суспензию в 96-луночном планшете. Добавьте 20 мкл дрожжевой суспензии в лунку, содержащую 180 мкл PBS, создавая 10-кратное разбавление. Повторите для остальных разведений, чтобы достичь диапазона от ^10-1 до ^10-5.
   9. Выберите четыре фактора разбавления (например, от ^10-2 до ^10-5) на основе корректировки концентрации дрожжевых клеток.
   10. Для каждого фактора разбавления пластина 3 капли (по 20 мкл каждая) на квадрант на агаровых пластинах YPD.
   11. После того, как дрожжевая суспензия полностью впитается, около 10 минут агаровыми планшетами, переверните и инкубируйте в течение ночи при 37 °C.
   12. Определите T0 как контрольный родительский C. glabrata без лечения ФДТ. Подготовьте грибы Т0 в фазе роста бревна, как описано выше, и подвергните их воздействию зеленого света 4,38 Дж/^см2 в присутствии 0,2% RB. Это состояние ФДТ последовательно подавляет от 3 до 3,5 логарифмов роста грибка.
       1. Обозначьте выжившие грибы как T1 и снова подвергните их той же дозе ФДТ после того, как они будут расширены in vitro до фазы логарифмического роста. Выжившие грибы после второй ФДТ обозначаются как Т2 и так далее.
   13. На следующий день выберите квадранты с числом колоний от 5 до 80. Подсчитайте количество колоний в каждом квадранте и рассчитайте титр по следующей формуле: Колониеобразующая единица (КОЕ)/мл = Количество колоний (среднее из тройных) × Коэффициент разведения × 50.
   14. Выполните окрашивание TTC (см. шаг 3). Отсканируйте пластину, как описано ранее (шаг 2.2).

3. Анализ митохондриальной функции (тест на окрашивание TCC)

ПРИМЕЧАНИЕ: TTC является окислительно-восстановительным индикатором и акцептором электронов. Он становится красным, когда белые соединения разрушаются электронами¹¹. Обратите внимание, что не все клетки обязательно образуют видимые колонии в течение 24 ч после культивирования на агаровой пластине. Колонии с функциональными митохондриями становятся красными, в то время как колонии с нефункциональными митохондриями остаются белыми. Это позволяет дифференцировать колонии с разной митохондриальной функциональностью.

1. После обработки разбавьте суспензии Candida на агаровых планшетах YPD в соответствии с желаемой плотностью клеток, чтобы получить отдельные колонии для легкой визуализации и окрашивания.
2. После 24 ч роста при 37 °C из одной клетки образуются видимые колонии. Пипетка 20 мкл 20% TTC непосредственно в центр каждой колонии.
3. После полного поглощения, около 10 мин TTC колониями, инкубировать при 37 °C в течение 30-40 мин.

4. Кинетика роста нормального и миниатюрного C. glabrata

Примечание: Сравнивались три штамма дрожжей: C. glabrata C2-1000907 T0 (клинический изолят без лечения ФДТ), T3n (C. glabrata C2-1000907 после 3 последовательных RB-PDT, демонстрирующих колонии со средним диаметром 1,5 ± 0,8 мм, похожие на родительские клетки) и T3p (миниатюрные колонии C. glabrata C2-1000907 после 3 последовательных RB-PDT).

1. Отрегулируйте суспензию дрожжевых клеток в среде YPD до наружного диаметра₆₀₀ 0,1 (5 × 10⁶ клеток/мл) в пробирке объемом 3 мл.
2. Автоматически измеряйте внешний диаметр₆₀₀ статической культуры каждые 20 мин с помощью многорежимного считывателя микропланшетов (см. Таблицу материалов) в течение 24 часов.

Результаты

Данные представлены в виде среднего значения со стандартной погрешностью ± и были получены из трех независимых экспериментов, по крайней мере, с тройками в каждой группе. Экспериментальные данные, включая количество колоний, измерения OD₆₀₀ и результаты окрашивания TTC, были построе...

Обсуждение

Это исследование раскрывает ФДТ как первый зарегистрированный метод индуцирования образования миниатюрных колоний у Candida, превосходящий установленные эффекты бромида этидия и флуконазола. Это новое наблюдение требует дальнейших исследований, чтобы разгадать его последствия как для...

Материалы

Name	Company	Catalog Number	Comments
0.22 μm filter	Merck, Taipei, Taiwan	Millex, SLGVR33RS
1.5 mL microfuge tube	Neptune, San Diego, USA	#3745
20% Triphenyltetrazolium chloride (TTC)	Sigma-Aldrich, MO, USA	T8877
5 mL polypropylene round bottom tube	Corning, AZ, USA	352059
5 mL round-bottom tube with cell strainer cap	Corning, AZ, USA	Falcon, #352235
96-well plate	Alpha plus, Taoyuan Hsien, Taiwan	#16196
Agar	BRS, Tainan, Taiwan	AG012
Blank disk	Advantec, Tokyo, Japan	49005040
Centrifuge	Eppendorf, UK	5415R
Ethidium bromide solution	Sigma-Aldrich, MO, USA	E1510
Fluconazole, 2 mg/mL	Pfizer, NY, USA	BC18790248
GraphPad Prism	GraphPad Software	Version 7.0
Green light emitting diode (LED) strip	Nanyi electronics Co.,Ltd, Tainan, Taiwan	5050	Excitation wave: 500~550 nm
Low Temperature. shake Incubators	Yihder, Taipei, Taiwan	LM-570D (R)
Mouth care cotton swabs	Good Verita Enterprise, Taipei, Taiwan	161357
Muller Hinton II agar	BD biosciences, California, USA	211438
Multimode microplate reader	Molecular Devices	SpectraMax i3x
OD600 spectrophotometer	Biochrom, London, UK	Ultrospec 10
Rose Bengal	Sigma-Aldrich, USA	330000	stock concentration 40 mg/mL = 4%, prepare in PBS, stored at 4 °C
Sterilized glass tube	Sunmei, Tainan, Taiwan	AK45048-16100
Yeast Extract Peptone Dextrose Medium	HIMEDIA, India	M1363