ローズベンガル媒介光線力学療法によるカンジダ炾粒体におけるプチコロニーの誘導

要約

カンジダ属の薬剤耐性におけるプチコロニーの重要性は、十分には解明されていない。抗菌光線力学療法(aPDT)は、薬剤耐性真菌感染症に対する有望な戦略を提供します。この研究は、ローズベンガル媒介aPDTが カンジダグラブラタ を効果的に不活性化し、小柄なコロニーを誘導し、ユニークな手順を提示することを示しています。

要約

カンジダ血症患者の死亡率が40%であることから、薬剤耐性カンジダとその小変異体は依然として治療上の大きな課題となっています。抗菌光線力学療法(aPDT)は、抗生物質/抗真菌薬とは異なり、複数の真菌構造を標的とするため、耐性を阻害する可能性があります。プチコロニーを誘導する従来の方法は、エチジウムブロマイドまたはフルコナゾールに依存しており、薬物感受性およびストレス反応に影響を与える可能性があります。この研究では、薬剤耐性カンジダ・グラブラタ分離株と戦うための緑色光(ピーク520 nm)とローズベンガル(RB)光増感剤の適用を調査しました。その結果、aPDT処理は細胞増殖を有意に阻害し(≥99.9%減少)、サイズの縮小とミトコンドリア酸化還元インジケーター染色の喪失から明らかなように、プチコロニー形成を効果的に誘導することが明らかになりました。この研究は、aPDTがin vitroで多剤耐性C.glabrata株にプチコロニーを誘導できるという最初の証拠を提供し、耐性真菌感染症と闘うための潜在的に変革的なアプローチを提供します。

概要

真菌感染症、特に カンジダ・アルビカンス と薬剤耐性が増す カンジダ・グラブラタによって引き起こされる感染症は、深刻な^{世界的な脅威となっています}1。これらの感染症は、特に入院患者や免疫力が低下している患者にとって致命的となる可能性があります。抗真菌耐性の上昇は、特に カンジダ・アルビカンス^による死亡率の高い重度の真菌感染症である侵襲性カンジダ症の制御を脅かしています2。耐性株は効果的な治療を妨げ、複雑さと死亡率の両方を増加させる可能性があります。米国カリフォルニア州アラメダ郡では、 C. glabrata が最も蔓延している侵入種となっています³。カンジダ種の有病率と分布のこの変化は、地域の医療慣行、患者の人口統計、抗真菌剤の利用、およびカンジダ感染症の危険因子の有病率の影響を受ける可能性があります。

機能的なミトコンドリアを欠くカンジダの小柄な変異体は、このオルガネラが薬物応答、病原性、およびストレス耐性にどのように影響するかを明らかにします^4,5。C. glabrataはこれらのコロニーを容易に形成し、ポリエンに対する感受性を獲得し、アゾール⁶に失う。アゾール感受性と呼吸機能は複雑に関連しており、呼吸の減少はミトコンドリアDNA喪失を介して抵抗につながります⁷。アゾール耐性を持つC.グラブラタの小柄なコロニーは、フルコナゾール治療を受けている骨髄移植レシピエント⁸からのヒト糞便サンプル8および血流感染症患者の血液培養ボトル⁹から分離されています。薬剤耐性、病原性、およびストレス反応におけるそれらの潜在的な影響は、それらの臨床的意義を強調しています。さらに、それらの明確な特性により、ミトコンドリア生物学における基本的な問題を調査するための貴重なツールになります⁵。プチ変異体の研究が進むにつれて、臨床研究と基礎研究の両方での応用が拡大する可能性があります。

この研究では、光線力学療法(PDT)が C.glabrataの小柄なコロニーを誘導できることを発見し、 C.glabrata を臭化エチジウムまたはフルコナゾールに曝露する従来の技術を超えて方法の範囲を拡大しました。

プロトコル

1. C. glabrataの培養

注:フルコナゾールを含むほとんどの抗真菌剤に耐性のある多剤耐性 C.グラブラタ (C2-1000907)が実験に使用されます。異なる菌株間で変動が存在する可能性があるため、実験条件を特定の菌株に適合させる必要がある場合があります。すべての実験では、一貫性を保つために、25°Cで増殖した対数相のカンジダ(自然感染を模倣)を使用しました。 C. glabrataは菌糸がないため、37°Cで菌糸を形成する C. albicansと比較して定量化が簡素化されます¹⁰。

1. C. glabrataの対数期培養液を調製するには、寒天プレートから1つのコロニーを採取し、3 mLの滅菌酵母ペプトンデキストロース(YPD)培地を入れたガラス試験管に移します(「材料の表」を参照)。振とうしながら25°Cで14〜16時間インキュベートします(155 rpm、45°の角度で培地への空気透過率を高めます)。
2. インキュベーション後、滅菌技術を使用して、培養物を新鮮なYPDでOD₆₀₀に0.1に希釈します。155rpmで振とうしながら、25°Cで6時間インキュベートします。OD₆₀₀を測定して、C.glabrataの対数位相を確認します。1 × 10 7-1.5 × 10⁷ 細胞/mLに相当する0.65-1.00を目標とします。

2. エチジウムブロマイド、フルコナゾール、光線力学療法によるプチコロニーの誘導

1. 臭化エチジウムプチコロニー誘導
   1. 酵母懸濁液を OD₆₀₀ 0.1(5 × 10⁶ 細胞/mL)と YPD で最終容量 3 mL に調整し、30 μL のエチジウムブロマイドストック(10 mg/mL)( 材料表を参照)を加えて最終濃度を 100 μg/mL にします。
   2. 酵母懸濁液を25°C、155rpm、45°の角度で一晩(16〜18時間)インキュベートします。OD₆₀₀ を 0.65 (1 × 10⁷ 細胞/mL) に調整します。96ウェルプレートで、調整した酵母懸濁液20 μLをウェルあたり180 μLのPBSに添加して、10倍希釈シリーズを実行します。これにより、^10-1 から^10-5の範囲の6つの希釈が作成されます。
   3. 4つの希釈係数(例:10⁰、10¹、10²、および10³)を選択し、YPD寒天プレートの4つの象限(トリプリケート)にそれぞれ3滴(20μL)をプレートします。
   4. プレートを37°Cで一晩インキュベートします。 塩化トリフェニルテトラゾリウム(TTC)染色¹¹ (ステップ3を参照)のために以前に選択した希釈液から、5〜80コロニーの象限を選択します。48ビットのフルカラー光学スキャナーを使用して、1200dpiでプレートをスキャンします。
2. フルコナゾールプチコロニー誘導
   注:プロセスを迅速化するために、フルコナゾール誘発性プチコロニー形成には、T3細胞(3回のRB-PDT処理後に得られた正常細胞とプチ細胞の混合物;ステップ2.3を参照)を使用します。これは、標準治療は通常、形成が遅くなるためです。
   1. ステップ2.1.1の説明に従って、酵母細胞懸濁液を調製および調整します。
   2. 25°Cで一晩(16〜18時間)インキュベートします。 OD₆₀₀ をもう一度 0.1 に調整します。
   3. 調整した懸濁液1mLを滅菌済みの5mLチューブに移します。
   4. 滅菌綿棒(長さ15 cm、先端0.9 cm x 2.6 cm、 材料の表を参照)を酵母懸濁液に浸し、チューブの底部との接触を確保し、ねじってチューブ壁から余分な液体を取り除きます。
   5. Mueller-Hinton寒天を使用してフード内のプレートを準備します( 材料の表を参照)。
   6. 寒天の上で綿を前後に綿棒で拭き、60°を2回回転させてから、周囲を綿棒で拭いて均一に覆います。
   7. 鉗子を炎で1〜2秒間滅菌し、短時間冷ましてから、それらを使用して空のディスクを拾います。
   8. マーカーを使用してプレートを3つの等しいセクターに分割します。各セクタの中央に空のディスクを1枚ずつ配置します。
   9. 12.5 μLのフルコナゾールストック(2 mg/mL、 材料表を参照)を各ディスク(25 μg/ディスク)に加え、気泡を避けるために十分に混合し、37°Cで20〜24時間インキュベートします。
   10. TTC染色を行います(ステップ3を参照)。48ビットのフルカラー光学スキャナーを使用して、1200dpiでプレートをスキャンします。
3. PDTプチコロニー誘導
   注:PDT後に、真菌が異なれば、小柄なコロニーの数も異なる場合があります。一部の株はまったく生成しない場合があります。
   1. aPDT システムを準備します。
      メモ: aPDTシステムデバイスのセットアップ手順は、Hung et^{al 12}によって報告された方法に従います。簡単に言うと、aPDTシステムは、520 nmのピークを持つ緑色のLEDアレイ( 材料の表を参照)で構成されており、96ウェルプレートの各ウェルと良好な位置合わせで底面から光を照射します。
   2. YPD培地中の酵母細胞懸濁液をOD₆₀₀ で0.65(約1×10⁷ 細胞/mL)に調整します。
   3. 1 mLの酵母懸濁液を111 μLの2%ローズベンガル(RB、 図1)( 材料の表を参照)を丸いチューブ内で混合して、最終RB濃度を0.2%にします。混合物を25°Cで15分間インキュベートし、155rpmで45°の角度で回転させます。
   4. 混合物を1.5 mLの微量遠心チューブに移し、16,100 x g で2.5分間(室温)遠心分離します。
   5. 上清を捨て、フードの床でチューブを5回そっとこすり、ペレットを再懸濁します。
   6. 懸濁液を1x PBSで4回洗浄して、すべてのRBを取り除きます。各洗浄の後、ペレットの再懸濁が続き、短時間のボルテックスまたはピペッティングで完全に再懸濁されます。
      1. 最終洗浄後、PBS1000μLを加えます。溶液は淡いピンク色です。洗浄したRBをロードした酵母懸濁液200 μLを、96ウェルプレート(トリプリケート)の3つのウェルのそれぞれに移します。
   7. 96ウェルプレートを下から緑色に照らすLED電球を備えたフォトダイナミックライトシステムに配置します。部屋の照明を消して、均一な照明を確保し、干渉を防ぎます。LEDライトシステムをアクティブにして、2分間で4.38 J / cm² のPDT線量を提供します。システムが井戸と適切に位置合わせされていることを確認してください。
   8. 照射後、酵母懸濁液を96ウェルプレートで希釈します。180 μL PBSを含むウェルに20 μLの酵母懸濁液を加え、10倍に希釈します。残りの希釈液についても繰り返して、^10-1 から^10-5の範囲にします。
   9. 酵母細胞濃度調整に基づいて、4つの希釈係数(例えば、^10-2 〜^10-5)を選択します。
   10. 希釈係数ごとに、YPD寒天プレートの象限ごとに3滴(各20μL)をプレートします。
   11. 酵母懸濁液が完全に吸収された後、寒天プレートで約10分間、反転させ、37°Cで一晩インキュベートします。
   12. T0をPDT治療なしの対照親C .グラブラタ として定義します。上記のように対数増殖期にT0菌を調製し、0.2%RBの存在下で4.38 J / cm² の緑色光にさらします。このPDT状態は、真菌の増殖の3〜3.5ログを一貫して阻害します。
       1. 生き残った真菌をT1として示し、それらをin vitroで対数増殖段階に拡大した後、それらを再び同じPDT用量に曝露します。2回目のPDT以降に生き残った菌類は、T2などと表記されます。
   13. 翌日、コロニー数が5〜80の象限を選択します。各象限のコロニー数を数え、次の式で力価を計算します:コロニー形成単位(CFU)/mL =コロニー数(三重の平均)×希釈係数×50。
   14. TTC染色を行います(ステップ3を参照)。前述のようにプレートをスキャンします(手順2.2)。

3. ミトコンドリア機能解析(TCC染色試験)

注:TTCは酸化還元インジケーターであり、電子受容体です。白色化合物が電子によって破壊されると赤くなります¹¹。すべての細胞が寒天プレートでの培養後24時間以内に目に見えるコロニーを形成するとは限らないことに注意してください。機能的なミトコンドリアを持つコロニーは赤くなりますが、機能しないミトコンドリアを持つコロニーは白のままです。これにより、ミトコンドリアの機能が異なるコロニー間の差別化が可能になります。

1. 処理後、カンジダ懸濁液をYPD寒天プレート上で所望の細胞密度に従って希釈し、可視化および染色を容易にするために明確なコロニーを得る。
2. 37°Cで24時間増殖した後、単一の細胞から可視コロニーが形成されます。20% TTCの20μLを各コロニーの中心に直接ピペットで移します。
3. 完全に吸収された後、コロニーによるTTCの約10分間、37°Cで30〜40分間インキュベートします。

4. 正常および小柄なC. glabrataの成長動態

注:酵母の3つの株を比較した: C. glabrata C2-1000907 T0(PDT処理なしの臨床分離株)、T3n(親細胞に類似した平均直径1.5±0.8 mmのコロニーを示す3連続RB-PDT後のC. glabrata C2-1000907)、およびT3p(3連続RB-PDT後の C. glabrata C2-1000907のプチコロニー)。

1. YPD培地中の酵母細胞懸濁液を、3mLチューブ中のOD₆₀₀ (5 × 10⁶ 細胞/mL)のOD 3に調整します。
2. マルチモードマイクロプレートリーダー(材料表を参照)を使用して、静的培養のOD₆₀₀を20分ごとに24時間自動的に測定します。

結果

データは、標準誤差±平均として示され、各グループで少なくとも3倍になる3つの独立した実験から得られた。コロニー数、OD₆₀₀ 測定値、TTC 染色結果などの実験データをグラフ化し、グラフ作成および統計ソフトウェアを使用して統計分析しました ( 「資料表」を参照)。データの分析には一元配置分散分析(ANOVA)または t検定 を使用し、 p値<0.05が有意である?...

ディスカッション

この研究は、PDTがカンジダのプチコロニー形成を誘導する最初の報告された方法であり、臭化エチジウムとフルコナゾールの確立された効果を上回っていることを明らかにしました。この新しい観察は、病原性の低下による真菌の根絶と耐性メカニズムの出現の両方に対するその意味を解明するために、さらなる調査を必要とします。

RBを介したPDTは、 C.glabrataの?...

資料

Name	Company	Catalog Number	Comments
0.22 μm filter	Merck, Taipei, Taiwan	Millex, SLGVR33RS
1.5 mL microfuge tube	Neptune, San Diego, USA	#3745
20% Triphenyltetrazolium chloride (TTC)	Sigma-Aldrich, MO, USA	T8877
5 mL polypropylene round bottom tube	Corning, AZ, USA	352059
5 mL round-bottom tube with cell strainer cap	Corning, AZ, USA	Falcon, #352235
96-well plate	Alpha plus, Taoyuan Hsien, Taiwan	#16196
Agar	BRS, Tainan, Taiwan	AG012
Blank disk	Advantec, Tokyo, Japan	49005040
Centrifuge	Eppendorf, UK	5415R
Ethidium bromide solution	Sigma-Aldrich, MO, USA	E1510
Fluconazole, 2 mg/mL	Pfizer, NY, USA	BC18790248
GraphPad Prism	GraphPad Software	Version 7.0
Green light emitting diode (LED) strip	Nanyi electronics Co.,Ltd, Tainan, Taiwan	5050	Excitation wave: 500~550 nm
Low Temperature. shake Incubators	Yihder, Taipei, Taiwan	LM-570D (R)
Mouth care cotton swabs	Good Verita Enterprise, Taipei, Taiwan	161357
Muller Hinton II agar	BD biosciences, California, USA	211438
Multimode microplate reader	Molecular Devices	SpectraMax i3x
OD600 spectrophotometer	Biochrom, London, UK	Ultrospec 10
Rose Bengal	Sigma-Aldrich, USA	330000	stock concentration 40 mg/mL = 4%, prepare in PBS, stored at 4 °C
Sterilized glass tube	Sunmei, Tainan, Taiwan	AK45048-16100
Yeast Extract Peptone Dextrose Medium	HIMEDIA, India	M1363