ローズベンガル媒介光線力学療法によるカンジダ炾粒体におけるプチコロニーの誘導

要約

カンジダ属の薬剤耐性におけるプチコロニーの重要性は、十分には解明されていない。抗菌光線力学療法(aPDT)は、薬剤耐性真菌感染症に対する有望な戦略を提供します。この研究は、ローズベンガル媒介aPDTが カンジダグラブラタ を効果的に不活性化し、小柄なコロニーを誘導し、ユニークな手順を提示することを示しています。

要約

カンジダ血症患者の死亡率が40%であることから、薬剤耐性カンジダとその小変異体は依然として治療上の大きな課題となっています。抗菌光線力学療法(aPDT)は、抗生物質/抗真菌薬とは異なり、複数の真菌構造を標的とするため、耐性を阻害する可能性があります。プチコロニーを誘導する従来の方法は、エチジウムブロマイドまたはフルコナゾールに依存しており、薬物感受性およびストレス反応に影響を与える可能性があります。この研究では、薬剤耐性カンジダ・グラブラタ分離株と戦うための緑色光(ピーク520 nm)とローズベンガル(RB)光増感剤の適用を調査しました。その結果、aPDT処理は細胞増殖を有意に阻害し(≥99.9%減少)、サイズの縮小とミトコンドリア酸化還元インジケーター染色の喪失から明らかなように、プチコロニー形成を効果的に誘導することが明らかになりました。この研究は、aPDTがin vitroで多剤耐性C.glabrata株にプチコロニーを誘導できるという最初の証拠を提供し、耐性真菌感染症と闘うための潜在的に変革的なアプローチを提供します。

概要

真菌感染症、特に カンジダ・アルビカンス と薬剤耐性が増す カンジダ・グラブラタによって引き起こされる感染症は、深刻な^{世界的な脅威となっています}1。これらの感染症は、特に入院患者や免疫力が低下している患者にとって致命的となる可能性があります。抗真菌耐性の上昇は、特に カンジダ・アルビカンス^による死亡率の高い重度の真菌感染症である侵襲性カンジダ症の制御を脅かしています2。耐性株は効果的な治療を妨げ、複雑さと死亡率の両方を増加させる可能性があります。米国カリフォルニア州アラメダ郡では、 C. glabrata が最も蔓延している侵入種となっています³。カンジダ種の有病率と分布のこの変化は、地域の医療慣行、患者の人口統計、抗真菌剤の利用、およびカンジダ感染症の危険因子の有病率の影響を受ける可能性があります。

機能的なミトコンドリアを欠くカンジダの小柄な変異体は、このオルガネラが薬物応答、病原性、およびストレス耐性にどのように影響するかを明らかにします^4,5。C. glabrataはこれらのコロニーを容易に形成し、ポリエンに対する感受性を....

プロトコル

1. C. glabrataの培養

注:フルコナゾールを含むほとんどの抗真菌剤に耐性のある多剤耐性 C.グラブラタ (C2-1000907)が実験に使用されます。異なる菌株間で変動が存在する可能性があるため、実験条件を特定の菌株に適合させる必要がある場合があります。すべての実験では、一貫性を保つために、25°Cで増殖した対数相のカンジダ(自然感染を模倣)を使用しました。 C. glabrataは菌糸がないため、37°Cで菌糸を形成する C. albicansと比較して定量化が簡素化されます¹⁰。

1. C. glabrataの対数期培養液を調製するには、寒天プレートから1つのコロニーを採取し、3 mLの滅菌酵母ペプトンデキストロース(YPD)培地を入れたガラス試験管に移します(「材料の表」を参照)。振とうしながら25°Cで14〜16時間インキュベートします(155 rpm、45°の角度で培地への空気透過率を高めます)。
2. インキュベーション後、滅菌技術を使用して、培養物を新鮮なYPDでOD₆₀₀に0.1に希釈します。155rpmで振とうしながら、25°Cで6時間インキュベートします。OD₆₀₀を測定....

結果

データは、標準誤差±平均として示され、各グループで少なくとも3倍になる3つの独立した実験から得られた。コロニー数、OD₆₀₀ 測定値、TTC 染色結果などの実験データをグラフ化し、グラフ作成および統計ソフトウェアを使用して統計分析しました ( 「資料表」を参照)。データの分析には一元配置分散分析(ANOVA)または t検定 を使用し、 p値<0.05が有意である?.......

ディスカッション

この研究は、PDTがカンジダのプチコロニー形成を誘導する最初の報告された方法であり、臭化エチジウムとフルコナゾールの確立された効果を上回っていることを明らかにしました。この新しい観察は、病原性の低下による真菌の根絶と耐性メカニズムの出現の両方に対するその意味を解明するために、さらなる調査を必要とします。

RBを介したPDTは、 C.glabrataの?.......

資料

Name	Company	Catalog Number	Comments
0.22 μm filter	Merck, Taipei, Taiwan	Millex, SLGVR33RS
1.5 mL microfuge tube	Neptune, San Diego, USA	#3745
20% Triphenyltetrazolium chloride (TTC)	Sigma-Aldrich, MO, USA	T8877
5 mL polypropylene round bottom tube	Corning, AZ, USA	352059
5 mL round-bottom tube with cell strainer cap	Corning, AZ, USA	Falcon, #352235
96-well plate	Alpha plus, Taoyuan Hsien, Taiwan	#16196
Agar	BRS, Tainan, Taiwan	AG012
Blank disk	Advantec, Tokyo, Japan	49005040
Centrifuge	Eppendorf, UK	5415R
Ethidium bromide solution	Sigma-Aldrich, MO, USA	E1510
Fluconazole, 2 mg/mL	Pfizer, NY, USA	BC18790248
GraphPad Prism	GraphPad Software	Version 7.0
Green light emitting diode (LED) strip	Nanyi electronics Co.,Ltd, Tainan, Taiwan	5050	Excitation wave: 500~550 nm
Low Temperature. shake Incubators	Yihder, Taipei, Taiwan	LM-570D (R)
Mouth care cotton swabs	Good Verita Enterprise, Taipei, Taiwan	161357
Muller Hinton II agar	BD biosciences, California, USA	211438
Multimode microplate reader	Molecular Devices	SpectraMax i3x
OD600 spectrophotometer	Biochrom, London, UK	Ultrospec 10
Rose Bengal	Sigma-Aldrich, USA	330000	stock concentration 40 mg/mL = 4%, prepare in PBS, stored at 4 °C
Sterilized glass tube	Sunmei, Tainan, Taiwan	AK45048-16100
Yeast Extract Peptone Dextrose Medium	HIMEDIA, India	M1363