Indução de pequenas colônias em Candida glabrate via terapia fotodinâmica mediada por Rose Bengal

Resumo

O significado de pequenas colônias em Candida spp. resistência a medicamentos não foi totalmente explorado. A terapia fotodinâmica antimicrobiana (aPDT) oferece uma estratégia promissora contra infecções fúngicas resistentes a medicamentos. Este estudo demonstra que a aPDT mediada por rosa bengala desativa efetivamente Candida glabrata e induz pequenas colônias, apresentando um procedimento único.

Resumo

Enfrentando uma taxa de mortalidade de 40% em pacientes com candidemia, a Candida resistente a medicamentos e seus pequenos mutantes continuam sendo um grande desafio de tratamento. A terapia fotodinâmica antimicrobiana (aPDT) tem como alvo várias estruturas fúngicas, ao contrário dos antibióticos/antifúngicos, potencialmente frustrando a resistência. Os métodos tradicionais para induzir colônias pequenas dependem de brometo de etídio ou fluconazol, que podem influenciar a suscetibilidade aos medicamentos e as respostas ao estresse. Este estudo investigou a aplicação de luz verde (pico de 520 nm) e fotossensibilizador de rosa bengala (RB) no combate a um isolado de Candida glabrata resistente a medicamentos. Os resultados revelaram que o tratamento com aPDT inibiu significativamente o crescimento celular (redução de ≥99,9%) e induziu efetivamente a formação de colônias pequenas, como evidenciado pela redução do tamanho e perda da coloração do indicador redox mitocondrial. Este estudo fornece evidências iniciais de que o aPDT pode induzir pequenas colônias em uma cepa de C. glabrata multirresistente in vitro, oferecendo uma abordagem potencialmente transformadora para combater infecções fúngicas resistentes.

Introdução

As infecções fúngicas, particularmente aquelas causadas por Candida albicans e Candida glabrata, cada vez mais resistentes, representam uma séria ameaça global¹. Essas infecções podem ser mortais, especialmente para pacientes hospitalizados e aqueles com sistema imunológico enfraquecido. O aumento da resistência antifúngica ameaça o controle da candidíase invasiva, uma infecção fúngica grave com alta mortalidade, especialmente por Candida albicans². Cepas resistentes dificultam o tratamento eficaz, aumentando potencialmente a complexidade e as taxas de mortalidade. No condado de Alameda, Califórnia, EUA, C. glabrata tornou-se a espécie invasora mais prevalente³. Essa mudança na prevalência e distribuição de espécies de Candida pode ser influenciada por práticas locais de saúde, dados demográficos do paciente, utilização de agentes antifúngicos e prevalência de fatores de risco para infecções por Candida.

Pequenos mutantes em Candida, sem mitocôndrias funcionais, revelam como essa organela afeta a resposta a medicamentos, virulência e resistência ao estresse ^4,5. C. glabrata forma prontamente essas colônias, ganhando sensibilidade aos polienos e perdendo-a aos azóis⁶. A sensibilidade aos azóis e a função respiratória estão intrinsecamente ligadas, com a diminuição da respiração levando à resistência por meio da perda de DNA mitocondrial⁷. Pequenas colônias de C. glabrata com resistência aos azóis foram isoladas de amostras de fezes humanas de um receptor de transplante de medula óssea em tratamento com fluconazol⁸ e de frascos de hemocultura de pacientes com infecções da corrente sanguínea⁹. Suas implicações potenciais na resistência a medicamentos, virulência e resposta ao estresse destacam seu significado clínico. Além disso, suas propriedades distintas os tornam ferramentas valiosas para investigar questões fundamentais na biologia mitocondrial⁵. À medida que a pesquisa sobre pequenos mutantes continua, suas aplicações em pesquisas clínicas e básicas provavelmente se expandirão.

Este estudo descobriu que a terapia fotodinâmica (PDT) pode induzir pequenas colônias em C. glabrata, expandindo a gama de métodos além das técnicas tradicionais de exposição de C. glabrata ao brometo de etídio ou fluconazol.

Protocolo

1. Cultura de C. glabrata

NOTA: Um C. glabrata multirresistente (C2-1000907) que é resistente à maioria dos agentes antifúngicos, incluindo fluconazol, é usado para os experimentos. As condições experimentais podem precisar ser adaptadas à cepa específica, pois podem existir variações entre diferentes cepas. Todos os experimentos usaram Candida em fase logarítmica cultivada a 25 ° C (imitando a infecção natural) para consistência. A falta de hifas de C. glabrata simplifica a quantificação em comparação com C. albicans, que forma hifas a 37 °C¹⁰.

1. Para preparar uma cultura em fase logarítmica de C. glabrata, pegue uma única colônia de uma placa de ágar e transfira-a para um tubo de ensaio de vidro com 3 mL de meio estéril de peptona dextrose de levedura (YPD) (ver Tabela de Materiais). Incubar durante 14-16 h a 25 °C com agitação (155 rpm, ângulo de 45° para aumentar a transmissão de ar para o meio).
2. Após a incubação, diluir a cultura com YPD fresco até um OD₆₀₀ de 0,1 usando a técnica estéril. Incubar a 25 °C durante 6 h com agitação a 155 rpm. Verificar a fase logarítmica de C. glabrata medindo o OD₆₀₀. Apontar para 0,65-1,00, o que corresponde a 1 × 10 7-1,5 × 10⁷ células/mL.

2. Indução de pequenas colônias por brometo de etídio, fluconazol e terapia fotodinâmica

1. Indução de colônias pequenas de brometo de etídio
   1. Ajuste uma suspensão de levedura para uma DO₆₀₀ de 0,1 (5 × 10⁶ células/mL) com YPD para um volume final de 3 mL e, em seguida, adicione 30 μL de estoque de brometo de etídio (10 mg/mL) (ver Tabela de Materiais) para uma concentração final de 100 μg/mL.
   2. Incubar a suspensão de levedura durante a noite (16-18 h) a 25 °C, 155 rpm, ângulo de 45°. Ajuste para um OD₆₀₀ de 0,65 (1 × 10⁷ células/mL). Realize uma série de diluição de 10 vezes em uma placa de 96 poços, adicionando 20 μL da suspensão de levedura ajustada a 180 μL de PBS por poço. Isso cria seis diluições que variam de ^10-1 a ^10-5.
   3. Selecione 4 fatores de diluição (por exemplo, 10⁰, 10¹, 10² e 10³) e 3 gotas de 3 (20 μL) cada um em 4 quadrantes de placas de ágar YPD (triplicado).
   4. Incubar as placas durante a noite a 37 °C. Selecione quadrantes com 5-80 colônias das diluições escolhidas anteriormente para a coloração de cloreto de trifeniltetrazólio (TTC)¹¹ (consulte a etapa 3). Digitalize as chapas a 1200 dpi usando um scanner óptico colorido de 48 bits.
2. Indução de colônias pequenas de fluconazol
   NOTA: Para agilizar o processo, use células T3 (uma mistura de células normais e pequenas obtidas após 3 tratamentos RB-PDT; consulte a etapa 2.3) para a formação de colônias pequenas induzidas por fluconazol. Isso ocorre porque o tratamento padrão geralmente resulta em uma formação mais lenta.
   1. Prepare e ajuste uma suspensão de células de levedura conforme descrito na etapa 2.1.1.
   2. Incubar durante a noite (16-18 h) a 25 °C. Ajuste o OD₆₀₀ para 0.1 novamente.
   3. Transfira 1 mL da suspensão ajustada para um tubo estéril de 5 mL.
   4. Mergulhe um cotonete estéril (15 cm de comprimento, com ponta de 0,9 cm x 2,6 cm, consulte a Tabela de Materiais) na suspensão de levedura, garantindo o contato com o fundo do tubo e torcendo para remover o excesso de líquido da parede do tubo.
   5. Prepare as placas no exaustor usando ágar Mueller-Hinton (consulte a Tabela de Materiais).
   6. Passe o algodão para frente e para trás no ágar, gire 60° duas vezes e, em seguida, limpe o perímetro para uma cobertura uniforme.
   7. Esterilize as pinças sobre uma chama por 1-2 s, deixando-as esfriar brevemente, depois use-as para pegar os discos vazios.
   8. Divida a placa em três setores iguais usando um marcador. Coloque um disco vazio no centro de cada setor.
   9. Adicione 12,5 μL de estoque de fluconazol (2 mg / mL, consulte a Tabela de Materiais) a cada disco (25 μg / disco), misture bem para evitar bolhas e incube a 37 ° C por 20-24 h.
   10. Execute a coloração TTC (consulte a etapa 3). Digitalize as chapas a 1200 dpi usando um scanner óptico colorido de 48 bits.
3. Indução de colônias pequenas PDT
   NOTA: Diferentes fungos podem produzir diferentes números de colônias pequenas após a PDT. Algumas cepas podem não produzir nenhum.
   1. Prepare o sistema aPDT.
      NOTA: O procedimento de configuração para o dispositivo do sistema aPDT segue o método relatado por Hung et al¹². Resumidamente, o sistema aPDT consiste em uma matriz de LED verde com um pico de 520 nm (consulte a Tabela de Materiais), brilhando luz do fundo com bom alinhamento com cada poço de uma placa de 96 poços.
   2. Ajuste a suspensão de células de levedura no meio YPD para um OD₆₀₀ de 0,65 (cerca de 1 × 10⁷ células / mL).
   3. Misture 1 mL da suspensão de levedura com 111 μL de rosa bengala a 2% (RB, Figura 1) (ver Tabela de Materiais) em um tubo com tampa redonda para obter uma concentração final de RB de 0,2%. Incubar a mistura a 25 °C durante 15 min, rodando-a num ângulo de 45° a 155 rpm.
   4. Transfira a mistura para um tubo de microcentrífuga de 1,5 mL e centrifugue a 16.100 x g por 2,5 min (à temperatura ambiente).
   5. Descarte o sobrenadante e raspe suavemente o tubo cinco vezes no chão do capô para ressuspender o pellet.
   6. Lave a suspensão com 1x PBS quatro vezes para remover todo o RB. Cada lavagem é seguida pela ressuspensão do pellet com breve vórtice ou pipetagem para ressuspensão completa.
      1. Após a lavagem final, adicione 1000 μL de PBS. A solução é de cor rosa claro. Transfira 200 μL da suspensão de levedura carregada com RB lavada para cada um dos três poços em uma placa de 96 poços (triplicata).
   7. Posicione a placa de 96 poços no sistema de luz fotodinâmica com lâmpadas LED brilhando luz verde por baixo. Apague as luzes da sala para garantir uma iluminação uniforme e evitar interferências. Ative o sistema de luz LED para fornecer a dose PDT de 4,38 J/^cm2 em 2 min; Certifique-se de que o sistema esteja devidamente alinhado com os poços.
   8. Após a irradiação, diluir a suspensão de levedura em uma placa de 96 poços. Adicione 20 μL de suspensão de levedura a um poço contendo 180 μL de PBS, criando uma diluição de 10 vezes. Repita para as diluições restantes para atingir um intervalo de ^10-1 a ^10-5.
   9. Escolha quatro fatores de diluição (por exemplo, ^10-2 a ^10-5) com base no ajuste da concentração de células de levedura.
   10. Para cada factor de diluição, aplicar 3 gotas (20 μl cada) por quadrante em placas de ágar YPD.
   11. Após a suspensão da levedura ser completamente absorvida, cerca de 10 min pelas placas de ágar, inverter e incubar durante a noite a 37 °C.
   12. Defina T0 como o parente controle de C. glabrata sem tratamento com PDT. Prepare fungos T0 na fase de crescimento logarítmica conforme descrito acima e exponha-os a 4,38 J / cm² luz verde na presença de 0,2% RB. Esta condição de PDT inibe consistentemente 3 a 3,5 logs de crescimento de fungos.
       1. Denote os fungos sobreviventes como T1 e exponha-os à mesma dose de PDT novamente depois de serem expandidos in vitro para uma fase de crescimento logarítmico. Os fungos sobreviventes após a segunda PDT são denotados como T2 e assim por diante.
   13. No dia seguinte, escolha quadrantes com contagem de colônias entre 5 e 80. Contar o número de colónias em cada quadrante e calcular o título com a seguinte fórmula: Unidade formadora de colónias (UFC)/ml = Número de colónias (média do triplicado) × Factor de diluição × 50.
   14. Execute a coloração TTC (consulte a etapa 3). Digitalize a placa conforme descrito anteriormente (etapa 2.2).

3. Análise da função mitocondrial (teste de coloração TCC)

NOTA: TTC é um indicador redox e um aceptor de elétrons. Fica vermelho quando os compostos brancos são quebrados por elétrons¹¹. Observe que nem todas as células necessariamente formam colônias visíveis dentro de 24 horas após a cultura em uma placa de ágar. As colônias com mitocôndrias funcionais ficam vermelhas, enquanto aquelas com mitocôndrias não funcionais permanecem brancas. Isso permite a diferenciação entre colônias com diferentes funcionalidades mitocondriais.

1. Após o tratamento, diluir as suspensões de Candida em placas de ágar YPD de acordo com a densidade celular desejada para obter colônias distintas para fácil visualização e coloração.
2. Após 24 h de crescimento a 37 °C, as colônias visíveis são formadas a partir de uma única célula. Pipete 20 μL de TTC a 20% diretamente no centro de cada colônia.
3. Após a absorção completa, cerca de 10 min de TTC pelas colônias, incubar a 37 °C por 30-40 min.

4. Cinética de crescimento de C. glabrata normal e pequena

NOTA: Três cepas de levedura foram comparadas: C. glabrata C2-1000907 T0 (isolado clínico sem tratamento com PDT), T3n (C. glabrata C2-1000907 após 3 colônias RB-PDT consecutivas exibindo um diâmetro médio de 1,5 ± 0,8 mm semelhante às células parentais) e T3p (colônias pequenas de C. glabrata C2-1000907 após 3 RB-PDT consecutivas).

1. Ajuste a suspensão de células de levedura em meio YPD para um OD₆₀₀ de 0,1 (5 × 10⁶ células / mL) em um tubo de 3 mL.
2. Meça automaticamente o OD₆₀₀ da cultura estática a cada 20 minutos usando o leitor de microplacas multimodo (consulte a Tabela de Materiais) por 24 h.

Resultados

Os dados são apresentados como a média com ± erro padrão e foram obtidos a partir de três experimentos independentes, com pelo menos triplicatas em cada grupo. Os dados experimentais, incluindo contagens de colônias, medições de OD₆₀₀ e resultados de coloração TTC, foram representados graficamente e analisados estatisticamente usando gráficos e software estatístico (ver Tabela de Materiais). A análise dos dados foi realizada por ANOVA ou teste t de uma via, sendo consider...

Discussão

Este estudo revela a PDT como o primeiro método relatado para induzir a formação de pequenas colônias em Candida, superando os efeitos estabelecidos do brometo de etídio e do fluconazol. Esta nova observação requer uma exploração mais aprofundada para desvendar suas implicações tanto para a erradicação de fungos, diminuindo a virulência quanto para o surgimento de mecanismos de resistência.

A PDT mediada por RB inibe efetivamente o crescimento de C. glabrata, sugerindo ...

Materiais

Name	Company	Catalog Number	Comments
0.22 μm filter	Merck, Taipei, Taiwan	Millex, SLGVR33RS
1.5 mL microfuge tube	Neptune, San Diego, USA	#3745
20% Triphenyltetrazolium chloride (TTC)	Sigma-Aldrich, MO, USA	T8877
5 mL polypropylene round bottom tube	Corning, AZ, USA	352059
5 mL round-bottom tube with cell strainer cap	Corning, AZ, USA	Falcon, #352235
96-well plate	Alpha plus, Taoyuan Hsien, Taiwan	#16196
Agar	BRS, Tainan, Taiwan	AG012
Blank disk	Advantec, Tokyo, Japan	49005040
Centrifuge	Eppendorf, UK	5415R
Ethidium bromide solution	Sigma-Aldrich, MO, USA	E1510
Fluconazole, 2 mg/mL	Pfizer, NY, USA	BC18790248
GraphPad Prism	GraphPad Software	Version 7.0
Green light emitting diode (LED) strip	Nanyi electronics Co.,Ltd, Tainan, Taiwan	5050	Excitation wave: 500~550 nm
Low Temperature. shake Incubators	Yihder, Taipei, Taiwan	LM-570D (R)
Mouth care cotton swabs	Good Verita Enterprise, Taipei, Taiwan	161357
Muller Hinton II agar	BD biosciences, California, USA	211438
Multimode microplate reader	Molecular Devices	SpectraMax i3x
OD600 spectrophotometer	Biochrom, London, UK	Ultrospec 10
Rose Bengal	Sigma-Aldrich, USA	330000	stock concentration 40 mg/mL = 4%, prepare in PBS, stored at 4 °C
Sterilized glass tube	Sunmei, Tainan, Taiwan	AK45048-16100
Yeast Extract Peptone Dextrose Medium	HIMEDIA, India	M1363