Induktion von kleinen Kolonien in Candida-glabrat mittels bengalischer Rose-vermittelter photodynamischer Therapie

Zusammenfassung

Die Bedeutung von kleinen Kolonien bei der Arzneimittelresistenz von Candida spp. ist noch nicht vollständig erforscht. Die antimikrobielle photodynamische Therapie (aPDT) bietet eine vielversprechende Strategie gegen arzneimittelresistente Pilzinfektionen. Diese Studie zeigt, dass die bengalisch vermittelte aPDT Candida glabrata effektiv deaktiviert und zierliche Kolonien induziert, was ein einzigartiges Verfahren darstellt.

Zusammenfassung

Mit einer Sterblichkeitsrate von 40 % bei Candidamie-Patienten stellen arzneimittelresistente Candida und ihre zierlichen Mutanten nach wie vor eine große Herausforderung für die Behandlung dar. Die antimikrobielle photodynamische Therapie (aPDT) zielt im Gegensatz zu Antibiotika/Antimykotika auf mehrere Pilzstrukturen ab und kann die Resistenz vereiteln. Traditionelle Methoden zur Induktion kleiner Völker beruhen auf Ethidiumbromid oder Fluconazol, die die Anfälligkeit von Medikamenten und Stressreaktionen beeinflussen können. In dieser Studie wurde die Anwendung von grünem Licht (Peak 520 nm) und Rose Bengal (RB) Photosensibilisator zur Bekämpfung eines arzneimittelresistenten Candida glabrata Isolats untersucht. Die Ergebnisse zeigten, dass die aPDT-Behandlung das Zellwachstum signifikant hemmte (≥99,9 % Reduktion) und die Bildung kleiner Kolonien effektiv induzierte, was sich in einer reduzierten Größe und einem Verlust der mitochondrialen Redoxindikatorfärbung zeigte. Diese Studie liefert erste Hinweise darauf, dass aPDT in vitro kleine Kolonien in einem multiresistenten C. glabrata-Stamm induzieren kann, was einen potenziell transformativen Ansatz zur Bekämpfung resistenter Pilzinfektionen bietet.

Einleitung

Pilzinfektionen, insbesondere solche, die durch Candida albicans und zunehmend arzneimittelresistente Candida glabrata verursacht werden, stellen eine ernsthafte globale Bedrohung dar¹. Diese Infektionen können tödlich sein, insbesondere für Krankenhauspatienten und Patienten mit geschwächtem Immunsystem. Die zunehmende Resistenz gegen Antimykotika bedroht die Kontrolle der invasiven Candidiasis, einer schweren Pilzinfektion mit hoher Mortalität, insbesondere durch Candida albicans². Resistente Stämme behindern eine wirksame Behandlung, was sowohl die Komplexität als auch die Sterblichkeitsraten erhöhen kann. In Alameda County, Kalifornien, USA, ist C. glabrata die am weitesten verbreitete invasive Art³. Diese Verschiebung in der Prävalenz und Verbreitung von Candida-Arten kann durch die lokalen Gesundheitspraktiken, die Patientendemografie, den Einsatz von Antimykotika und die Prävalenz von Risikofaktoren für Candida-Infektionen beeinflusst werden.

Zierliche Mutanten in Candida, denen funktionelle Mitochondrien fehlen, zeigen, wie diese Organelle die Arzneimittelreaktion, Virulenz und Stressresistenz beeinflusst ^4,5. C. glabrata bildet diese Kolonien bereitwillig und gewinnt an Empfindlichkeit gegenüber Polyenen, verliert sie aber an Azole⁶. Die Empfindlichkeit von Azolen und die Atmungsfunktion sind eng miteinander verknüpft, wobei eine verminderte Atmung über den Verlust der mitochondrialen DNA zu einer Resistenz führt⁷. Kleine Kolonien von C. glabrata mit Azolresistenz wurden aus menschlichen Stuhlproben eines Empfängers eines Knochenmarktransplantats, der sich einer Fluconazol-Behandlung unterzog⁸, und aus Blutkulturflaschen von Patienten mit Blutbahninfektionen^{isoliert 9}. Ihre potenziellen Auswirkungen auf Arzneimittelresistenz, Virulenz und Stressreaktion unterstreichen ihre klinische Bedeutung. Darüber hinaus machen sie ihre unterschiedlichen Eigenschaften zu wertvollen Werkzeugen für die Untersuchung grundlegender Fragen der Mitochondrienbiologie⁵. Mit der fortschreitenden Forschung an zierlichen Mutanten werden sich ihre Anwendungen sowohl in der klinischen als auch in der Grundlagenforschung wahrscheinlich erweitern.

Diese Studie entdeckte, dass die photodynamische Therapie (PDT) winzige Kolonien in C. glabrata induzieren kann, wodurch das Methodenspektrum über die traditionellen Techniken der Exposition von C. glabrata gegenüber Ethidiumbromid oder Fluconazol hinaus erweitert wird.

Protokoll

1. Kultivierung von C. glabrata

HINWEIS: Für die Versuche wird ein multiresistentes C. glabrata (C2-1000907) verwendet, das gegen die meisten Antimykotika, einschließlich Fluconazol, resistent ist. Die Versuchsbedingungen müssen möglicherweise an den spezifischen Stamm angepasst werden, da es Unterschiede zwischen verschiedenen Stämmen geben kann. In allen Experimenten wurde Candida in logaritärer Phase verwendet, das bei 25 °C gezüchtet wurde (um eine natürliche Infektion nachzuahmen), um die Konsistenz zu gewährleisten. Das Fehlen von Hyphen bei C. glabrata vereinfacht die Quantifizierung im Vergleich zu C. albicans, die bei 37 °C Hyphen bildet¹⁰.

1. Um eine Log-Phasen-Kultur von C. glabrata herzustellen, nehmen Sie eine einzelne Kolonie aus einer Agarplatte und geben Sie sie in ein Reagenzglas aus Glas mit 3 ml sterilem Hefe-Pepton-Dextrose-Medium (YPD) (siehe Materialtabelle). 14-16 h bei 25 °C unter Schütteln inkubieren (155 U/min, 45° Winkel, um die Luftdurchlässigkeit zum Medium zu erhöhen).
2. Nach der Inkubation wird die Kultur mit frischem YPD steril auf einen OD₆₀₀ von 0,1 verdünnt. 6 h bei 25 °C inkubieren und bei 155 U/min schütteln. Überprüfen Sie die logarithmische Phase von C. glabrata durch Messung des OD₆₀₀. Streben Sie 0,65-1,00 an, was 1 × 10 7-1,5 × 10⁷ Zellen/ml entspricht.

2. Induktion kleiner Kolonien durch Ethidiumbromid, Fluconazol und photodynamische Therapie

1. Induktion von Ethidiumbromid petite colony
   1. Eine Hefesuspension auf einen OD₆₀₀ von 0,1 (5 × 10⁶ Zellen/ml) mit YPD auf ein Endvolumen von 3 mL einstellen, dann 30 μl Ethidiumbromid-Stamm (10 mg/ml) (siehe Materialtabelle) für eine Endkonzentration von 100 μg/ml hinzufügen.
   2. Die Hefesuspension über Nacht (16-18 h) bei 25 °C, 155 U/min, 45° Winkel inkubieren. Stellen Sie auf einen OD₆₀₀ von 0,65 (1 × 10⁷ Zellen/ml) ein. Führen Sie eine 10-fache Verdünnungsreihe in einer 96-Well-Platte durch, indem Sie 20 μl der angepassten Hefesuspension zu 180 μl PBS pro Well hinzufügen. Dadurch entstehen sechs Verdünnungen von ^10-1 bis ^10-5.
   3. Wählen Sie 4 Verdünnungsfaktoren (z. B. 10⁰, 10¹, 10² und 10³) und Platte 3 Tropfen (20 μl) auf jeweils 4 Quadranten von YPD-Agarplatten (dreifach).
   4. Die Platten über Nacht bei 37 °C inkubieren. Quadranten mit 5-80 Kolonien aus den zuvor gewählten Verdünnungen für die Färbung von Triphenyltetrazoliumchlorid (TTC)¹¹ auswählen (siehe Schritt 3). Scannen Sie Platten mit 1200 dpi mit einem optischen 48-Bit-Vollfarbscanner.
2. Induktion von Fluconazol petite colony
   HINWEIS: Um den Prozess zu beschleunigen, verwenden Sie T3-Zellen (eine Mischung aus normalen und zierlichen Zellen, die nach 3 RB-PDT-Behandlungen gewonnen wurden; siehe Schritt 2.3) für die Fluconazol-induzierte Bildung einer kleinen Kolonie. Dies liegt daran, dass die Standardbehandlung in der Regel zu einer langsameren Bildung führt.
   1. Eine Hefezellsuspension wie in Schritt 2.1.1 beschrieben vorbereiten und anpassen.
   2. Über Nacht (16-18 h) bei 25 °C inkubieren. Stellen Sie den OD₆₀₀ wieder auf 0,1 ein.
   3. 1 ml der eingestellten Suspension in ein steriles 5-ml-Röhrchen überführen.
   4. Tauchen Sie ein steriles Wattestäbchen (15 cm lang, mit einer Spitze von 0,9 cm x 2,6 cm, siehe Materialtabelle) in die Hefesuspension, achten Sie dabei auf den Kontakt mit dem Röhrchenboden und drehen Sie, um überschüssige Flüssigkeit von der Röhrchenwand zu entfernen.
   5. Bereiten Sie die Platten in der Haube mit Mueller-Hinton-Agar vor (siehe Materialtabelle).
   6. Tupfen Sie die Watte auf dem Agar hin und her, drehen Sie sie zweimal um 60° und tupfen Sie dann den Umfang ab, um eine gleichmäßige Abdeckung zu gewährleisten.
   7. Sterilisieren Sie die Pinzette 1-2 s lang über einer Flamme, lassen Sie sie kurz abkühlen und nehmen Sie dann die leeren Scheiben auf.
   8. Teilen Sie die Platte mit einem Marker in drei gleich große Sektoren. Legen Sie eine leere Scheibe in die Mitte jedes Sektors.
   9. 12,5 μl Fluconazol-Stamm (2 mg/ml, siehe Materialtabelle) auf jede Platte (25 μg/Platte) geben, gründlich mischen, um Blasen zu vermeiden, und 20-24 h bei 37 °C inkubieren.
   10. Führen Sie die TTC-Färbung durch (siehe Schritt 3). Scannen Sie Platten mit 1200 dpi mit einem optischen 48-Bit-Vollfarbscanner.
3. PDT Induktion kleiner Völker
   HINWEIS: Verschiedene Pilze können nach der PDT eine unterschiedliche Anzahl von kleinen Kolonien produzieren. Einige Stämme produzieren möglicherweise überhaupt keine.
   1. Bereiten Sie das aPDT-System vor.
      HINWEIS: Das Einrichtungsverfahren für das aPDT-Systemgerät folgt der von Hung et al.¹² beschriebenen Methode. Kurz gesagt, das aPDT-System besteht aus einem grünen LED-Array mit einem Peak bei 520 nm (siehe Materialtabelle), das Licht von unten mit guter Ausrichtung auf jedes Well einer 96-Well-Platte ausstrahlt.
   2. Die Hefezellsuspension im YPD-Medium wird auf einen OD₆₀₀ von 0,65 (ca. 1 × 10⁷ Zellen/ml) eingestellt.
   3. Mischen Sie 1 ml der Hefesuspension mit 111 μl 2 % rosa Bengalen (RB, Abbildung 1) (siehe Materialtabelle) in einem Röhrchen mit rundem Deckel, um eine endgültige RB-Konzentration von 0,2 % zu erhalten. Die Mischung 15 min lang bei 25 °C inkubieren und dabei in einem 45°-Winkel bei 155 U/min drehen.
   4. Übertragen Sie die Mischung in ein 1,5-ml-Mikrozentrifugenröhrchen und zentrifugieren Sie sie bei 16.100 x g für 2,5 min (bei Raumtemperatur).
   5. Entsorgen Sie den Überstand und kratzen Sie das Rohr vorsichtig fünfmal über den Haubenboden, um das Pellet wieder aufzuhängen.
   6. Waschen Sie die Suspension viermal mit 1x PBS, um alle RB zu entfernen. Nach jeder Wäsche folgt die Resuspension des Pellets mit kurzem Vortexen oder Pipettieren für eine gründliche Resuspension.
      1. Nach der letzten Wäsche 1000 μl PBS hinzufügen. Die Lösung hat eine hellrosa Farbe. Übertragen Sie 200 μl der gewaschenen RB-beladenen Hefesuspension in jede der drei Vertiefungen in einer 96-Well-Platte (dreifach).
   7. Positionieren Sie die 96-Well-Platte auf dem photodynamischen Lichtsystem mit LED-Lampen, die grünes Licht von unten ausstrahlen. Schalten Sie die Raumbeleuchtung aus, um eine gleichmäßige Ausleuchtung zu gewährleisten und Störungen zu vermeiden. Aktivieren Sie das LED-Lichtsystem, um die PDT-Dosis von 4,38 J/cm² über 2 Minuten abzugeben; Stellen Sie sicher, dass das System ordnungsgemäß auf die Bohrlöcher ausgerichtet ist.
   8. Nach der Bestrahlung die Hefesuspension in einer 96-Well-Platte verdünnen. Geben Sie 20 μl Hefesuspension in eine Vertiefung mit 180 μl PBS, wodurch eine 10-fache Verdünnung entsteht. Wiederholen Sie den Vorgang für die verbleibenden Verdünnungen, um einen Bereich von ^10-1 bis ^10-5 zu erreichen.
   9. Wählen Sie vier Verdünnungsfaktoren (z. B. ^10-2 bis ^10-5) basierend auf der Anpassung der Hefezellkonzentration.
   10. Für jeden Verdünnungsfaktor 3 Tropfen (je 20 μl) pro Quadranten auf YPD-Agarplatten aufschlagen.
   11. Nachdem die Hefesuspension vollständig resorbiert wurde, ca. 10 min von den Agarplatten, invertieren und über Nacht bei 37 °C inkubieren.
   12. Definieren Sie T0 als die elterliche Kontrolle C. glabrata ohne PDT-Behandlung. Bereiten Sie T0-Pilze in der logarithmischen Wachstumsphase wie oben beschrieben vor und setzen Sie sie 4,38 J/^{cm 2} grünem Licht in Gegenwart von 0,2 % RB aus. Diese PDT-Bedingung hemmt konsequent 3 bis 3,5 log Pilzwachstum.
       1. Kennzeichnen Sie die überlebenden Pilze als T1 und setzen Sie sie erneut der gleichen PDT-Dosis aus, nachdem sie in vitro zu einer logarithmischen Wachstumsphase expandiert wurden. Die nach der zweiten PDT überlebten Pilze werden als T2 usw. bezeichnet.
   13. Wählen Sie am nächsten Tag Quadranten mit einer Koloniezahl zwischen 5 und 80. Zählen Sie die Anzahl der Kolonien in jedem Quadranten und berechnen Sie den Titer mit der folgenden Formel: Koloniebildende Einheit (KBE)/ml = Anzahl der Kolonien (Durchschnitt des Dreifachs) × Verdünnungsfaktor × 50.
   14. Führen Sie die TTC-Färbung durch (siehe Schritt 3). Scannen Sie die Platte wie zuvor beschrieben (Schritt 2.2).

3. Analyse der mitochondrialen Funktion (TCC-Färbetest)

HINWEIS: TTC ist ein Redoxindikator und ein Elektronenakzeptor. Es färbt sich rot, wenn weiße Verbindungen durch Elektronen¹¹ gebrochen werden. Es ist zu beachten, dass nicht alle Zellen notwendigerweise innerhalb von 24 Stunden nach der Kultur auf einer Agarplatte sichtbare Kolonien bilden. Kolonien mit funktionellen Mitochondrien färben sich rot, während Kolonien mit nicht-funktionellen Mitochondrien weiß bleiben. Dies ermöglicht die Differenzierung zwischen Kolonien mit unterschiedlicher mitochondrialer Funktionalität.

1. Nach der Behandlung verdünnen Sie Candida-Suspensionen auf YPD-Agarplatten entsprechend der gewünschten Zelldichte, um unterschiedliche Kolonien für eine einfache Visualisierung und Färbung zu erhalten.
2. Nach 24 h Wachstum bei 37 °C bilden sich aus einer einzigen Zelle sichtbare Kolonien. Pipettieren Sie 20 μl 20 % TTC direkt in die Mitte jeder Kolonie.
3. Nach vollständiger Resorption, ca. 10 min TTC durch die Völker, inkubieren Sie bei 37 °C für 30-40 min.

4. Wachstumskinetik von normalem und zierlichem C. glabrata

HINWEIS: Drei Hefestämme wurden verglichen: C. glabrata C2-1000907 T0 (klinisches Isolat ohne PDT-Behandlung), T3n (C. glabrata C2-1000907 nach 3 aufeinanderfolgenden RB-PDT-Kolonien mit einem durchschnittlichen Durchmesser von 1,5 ± 0,8 mm, ähnlich den Elternzellen) und T3p (kleine Kolonien von C. glabrata C2-1000907 nach 3 aufeinanderfolgenden RB-PDT).

1. Die Hefezellsuspension in YPD-Medium wird in einem 3-ml-Röhrchen auf einen OD₆₀₀ von 0,1 (5 × 10⁶ Zellen/ml) eingestellt.
2. Messen Sie den OD₆₀₀ der statischen Kultur automatisch alle 20 Minuten mit dem Multi-Mode-Mikroplatten-Reader (siehe Materialtabelle) für 24 Stunden.

Ergebnisse

Die Daten werden als Mittelwert mit ± Standardfehler dargestellt und stammen aus drei unabhängigen Experimenten mit mindestens dreifachen Werten in jeder Gruppe. Experimentelle Daten, einschließlich Koloniezahlen, OD_{600-Messungen} und TTC-Färbeergebnisse, wurden grafisch dargestellt und mit Hilfe von Grafiken und statistischer Software statistisch analysiert (siehe Materialtabelle). Zur Analyse der Daten wurde eine unidirektionale ANOVA oder ein t-Test verwendet, und ein p-Wert...

Diskussion

Diese Studie enthüllt PDT als die erste berichtete Methode zur Induktion der Bildung kleiner Kolonien in Candida und übertrifft damit die etablierten Wirkungen von Ethidiumbromid und Fluconazol. Diese neuartige Beobachtung erfordert weitere Untersuchungen, um ihre Auswirkungen sowohl auf die Pilzausrottung durch Verringerung der Virulenz als auch auf das Auftreten von Resistenzmechanismen zu entschlüsseln.

Die RB-vermittelte PDT hemmt effektiv das Wachstum von C. glabrata, was auf ...

Materialien

Name	Company	Catalog Number	Comments
0.22 μm filter	Merck, Taipei, Taiwan	Millex, SLGVR33RS
1.5 mL microfuge tube	Neptune, San Diego, USA	#3745
20% Triphenyltetrazolium chloride (TTC)	Sigma-Aldrich, MO, USA	T8877
5 mL polypropylene round bottom tube	Corning, AZ, USA	352059
5 mL round-bottom tube with cell strainer cap	Corning, AZ, USA	Falcon, #352235
96-well plate	Alpha plus, Taoyuan Hsien, Taiwan	#16196
Agar	BRS, Tainan, Taiwan	AG012
Blank disk	Advantec, Tokyo, Japan	49005040
Centrifuge	Eppendorf, UK	5415R
Ethidium bromide solution	Sigma-Aldrich, MO, USA	E1510
Fluconazole, 2 mg/mL	Pfizer, NY, USA	BC18790248
GraphPad Prism	GraphPad Software	Version 7.0
Green light emitting diode (LED) strip	Nanyi electronics Co.,Ltd, Tainan, Taiwan	5050	Excitation wave: 500~550 nm
Low Temperature. shake Incubators	Yihder, Taipei, Taiwan	LM-570D (R)
Mouth care cotton swabs	Good Verita Enterprise, Taipei, Taiwan	161357
Muller Hinton II agar	BD biosciences, California, USA	211438
Multimode microplate reader	Molecular Devices	SpectraMax i3x
OD600 spectrophotometer	Biochrom, London, UK	Ultrospec 10
Rose Bengal	Sigma-Aldrich, USA	330000	stock concentration 40 mg/mL = 4%, prepare in PBS, stored at 4 °C
Sterilized glass tube	Sunmei, Tainan, Taiwan	AK45048-16100
Yeast Extract Peptone Dextrose Medium	HIMEDIA, India	M1363