Induction de petites colonies chez Candida glabrate via la thérapie photodynamique médiée par Rose Bengal

Résumé

L’importance des petites colonies dans la résistance aux médicaments de Candida spp. n’a pas été pleinement explorée. La thérapie photodynamique antimicrobienne (aPDT) offre une stratégie prometteuse contre les infections fongiques résistantes aux médicaments. Cette étude démontre que l’aPDT médiée par le bengale de la rose désactive efficacement Candida glabrata et induit de petites colonies, présentant une procédure unique.

Résumé

Face à un taux de mortalité de 40 % chez les patients atteints de candidémie, le Candida résistant aux médicaments et ses petits mutants restent un défi thérapeutique majeur. La thérapie photodynamique antimicrobienne (aPDT) cible plusieurs structures fongiques, contrairement aux antibiotiques/antifongiques, ce qui peut contrecarrer la résistance. Les méthodes traditionnelles pour induire de petites colonies reposent sur le bromure d’éthidium ou le fluconazole, qui peuvent influencer la sensibilité aux médicaments et les réponses au stress. Cette étude a porté sur l’application d’un photosensibilisant à la lumière verte (pic de 520 nm) et au rose-bengale (RB) pour lutter contre un isolat de Candida glabrata résistant aux médicaments. Les résultats ont révélé que le traitement aPDT inhibait significativement la croissance cellulaire (réduction de ≥99,9 %) et induisait efficacement la formation de petites colonies, comme en témoigne la réduction de la taille et la perte de la coloration indicatrice redox mitochondriale. Cette étude fournit des preuves initiales que l’aPDT peut induire de petites colonies dans une souche de C. glabrata multirésistante in vitro, offrant une approche potentiellement transformatrice pour lutter contre les infections fongiques résistantes.

Introduction

Les infections fongiques, en particulier celles causées par Candida albicans et Candida glabrata, de plus en plus résistant aux médicaments, constituent une grave menace mondiale¹. Ces infections peuvent être mortelles, en particulier pour les patients hospitalisés et ceux dont le système immunitaire est affaibli. L’augmentation de la résistance aux antifongiques menace le contrôle de la candidose invasive, une infection fongique grave avec une mortalité élevée, en particulier de Candida albicans². Les souches résistantes entravent l’efficacité du traitement, ce qui peut augmenter à la fois la complexité et les taux de mortalité. Dans le comté d’Alameda, en Californie, aux États-Unis, C. glabrata est devenu l’espèce envahissante la plus répandue³. Ce changement dans la prévalence et la distribution des espèces de Candida peut être influencé par les pratiques de soins de santé locales, la démographie des patients, l’utilisation d’agents antifongiques et la prévalence des facteurs de risque d’infections à Candida.

De petits mutants chez Candida, dépourvus de mitochondries fonctionnelles, révèlent comment cet organite affecte la réponse aux médicaments, la virulence et la résistance au stress ^4,5. C. glabrata forme facilement ces colonies, gagnant en sensibilité aux polyènes tout en les perdant au profit des azoles⁶. La sensibilité aux azoles et la fonction respiratoire sont intimement liées, la diminution de la respiration entraînant une résistance via la perte d’ADN mitochondrial⁷. De petites colonies de C. glabrata résistantes aux azoles ont été isolées à partir d’échantillons de selles humaines provenant d’un receveur d’une greffe de moelle osseuse subissant un traitement au fluconazole⁸ et de flacons d’hémoculture de patients atteints d’infections du sang⁹. Leurs implications potentielles dans la résistance aux médicaments, la virulence et la réponse au stress mettent en évidence leur signification clinique. De plus, leurs propriétés distinctes en font des outils précieux pour étudier des questions fondamentales en biologie mitochondriale⁵. Au fur et à mesure que la recherche sur les petits mutants se poursuit, leurs applications dans la recherche clinique et fondamentale sont susceptibles de s’étendre.

Cette étude a révélé que la thérapie photodynamique (PDT) peut induire de petites colonies chez C. glabrata, élargissant ainsi la gamme de méthodes au-delà des techniques traditionnelles d’exposition de C. glabrata au bromure d’éthidium ou au fluconazole.

Protocole

1. Élevage de C. glabrata

REMARQUE : Un C. glabrata multirésistant (C2-1000907) résistant à la plupart des agents antifongiques, y compris le fluconazole, est utilisé pour les expériences. Il peut être nécessaire d’adapter les conditions expérimentales à la souche spécifique, car il peut exister des variations entre les différentes souches. Toutes les expériences ont utilisé du Candida en phase logarithmique cultivé à 25 °C (imitant l’infection naturelle) pour plus de cohérence. L’absence d’hyphes de C. glabrata simplifie la quantification par rapport à C. albicans, qui forme des hyphes à 37 °C¹⁰.

1. Pour préparer une culture en phase logarithmique de C. glabrata, prélever une seule colonie dans une plaque de gélose et la transférer dans un tube à essai en verre avec 3 mL de milieu stérile de peptone dextrose (YPD) (voir le tableau des matériaux). Incuber pendant 14 à 16 h à 25 °C avec agitation (155 tr/min, angle de 45° pour augmenter la transmission de l’air vers le fluide).
2. Après l’incubation, diluer la culture avec du YPD frais à une DO₆₀₀ de 0,1 en utilisant une technique stérile. Incuber à 25 °C pendant 6 h en secouant à 155 tr/min. Vérifier la phase logarithmique de C. glabrata en mesurant la DO₆₀₀. Visez 0,65-1,00, ce qui correspond à 1 × 10 7-1,5 × 10⁷ cellules/mL.

2. Induction de petites colonies par bromure d’éthidium, fluconazole et thérapie photodynamique

1. Induction de la petite colonie de bromure d’éthidium
   1. Ajuster une suspension de levure à une DO₆₀₀ de 0,1 (5 × 10^{à 6} cellules/mL) avec YPD jusqu’à un volume final de 3 mL, puis ajouter 30 μL de bromure d’éthidium (10 mg/mL) (voir le tableau des matières) pour une concentration finale de 100 μg/mL.
   2. Incuber la suspension de levure pendant la nuit (16-18 h) à 25 °C, 155 tr/min, angle de 45°. Ajuster à une DO₆₀₀ de 0,65 (1 × 10⁷ cellules/mL). Effectuer une série de dilutions 10 fois dans une plaque de 96 puits en ajoutant 20 μL de suspension de levure ajustée à 180 μL de PBS par puits. Cela crée six dilutions allant de ^10-1 à ^10-5.
   3. Choisir 4 facteurs de dilution (p. ex., 10⁰, 10¹, 10² et 10³) et 3 gouttes (20 μL) sur 4 quadrants de gélose YPD (en trois exemplaires).
   4. Incuber les assiettes pendant la nuit à 37 °C. Sélectionnez des quadrants avec 5 à 80 colonies à partir des dilutions précédemment choisies pour la coloration au chlorure de triphényltétrazolium (TTC)¹¹ (voir étape 3). Numérisez des plaques à 1200 dpi à l’aide d’un scanner optique couleur 48 bits.
2. Induction de la petite colonie de fluconazole
   REMARQUE : Pour accélérer le processus, utilisez des cellules T3 (un mélange de cellules normales et de cellules petites obtenues après 3 traitements RB-PDT ; voir l’étape 2.3) pour la formation de petites colonies induites par le fluconazole. En effet, le traitement standard entraîne généralement une formation plus lente.
   1. Préparez et ajustez une suspension de cellules de levure comme décrit à l’étape 2.1.1.
   2. Incuber toute la nuit (16-18 h) à 25 °C. Réglez à nouveau l’OD₆₀₀ sur 0,1.
   3. Transférez 1 mL de la suspension ajustée dans un tube stérile de 5 mL.
   4. Trempez un coton-tige stérile (15 cm de long, avec une pointe de 0,9 cm x 2,6 cm, voir tableau des matériaux) dans la suspension de levure, en assurant le contact avec le fond du tube et en tournant pour éliminer l’excès de liquide de la paroi du tube.
   5. Préparez les plaques dans la hotte à l’aide de gélose Mueller-Hinton (voir la table des matériaux).
   6. Tamponnez le coton d’avant en arrière sur la gélose, faites pivoter deux fois de 60°, puis tamponnez le périmètre pour une couverture uniforme.
   7. Stérilisez les pinces à feu pendant 1 à 2 secondes, en les laissant refroidir brièvement, puis utilisez-les pour ramasser les disques vierges.
   8. Divisez la plaque en trois secteurs égaux à l’aide d’un marqueur. Placez un disque vierge au centre de chaque secteur.
   9. Ajouter 12,5 μL de fluconazole (2 mg/mL, voir le tableau des matériaux) dans chaque disque (25 μg/disque), bien mélanger pour éviter les bulles et incuber à 37 °C pendant 20 à 24 h.
   10. Effectuez la coloration TTC (voir étape 3). Numérisez des plaques à 1200 dpi à l’aide d’un scanner optique couleur 48 bits.
3. Induction de la petite colonie PDT
   REMARQUE : Différents champignons peuvent produire un nombre différent de petites colonies après la PDT. Certaines souches peuvent ne pas en produire du tout.
   1. Préparez le système aPDT.
      REMARQUE : La procédure de configuration du dispositif du système aPDT suit la méthode décrite par Hung et al¹². En bref, le système aPDT se compose d’un réseau de LED vertes avec un pic à 520 nm (voir le tableau des matériaux), éclairant la lumière par le bas avec un bon alignement avec chaque puits d’une plaque de 96 puits.
   2. Ajustez la suspension de cellules de levure dans le milieu YPD à une DO₆₀₀ de 0,65 (environ 1 × 10,⁷ cellules/mL).
   3. Mélanger 1 mL de suspension de levure avec 111 μL de rose bengale à 2 % (RB, Figure 1) (voir le tableau des matériaux) dans un tube à capuchon rond pour obtenir une concentration finale de RB de 0,2 %. Incuber le mélange à 25 °C pendant 15 min, en le tournant à un angle de 45° à 155 tr/min.
   4. Transférez le mélange dans un tube de microcentrifugation de 1,5 mL et centrifugez à 16 100 x g pendant 2,5 min (à température ambiante).
   5. Jetez le surnageant et raclez doucement le tube cinq fois sur le sol de la hotte pour remettre la pastille en suspension.
   6. Lavez la suspension avec 1x PBS quatre fois pour retirer tout le RB. Chaque lavage est suivi d’une remise en suspension de la pastille avec un bref vortex ou un pipetage pour une remise en suspension complète.
      1. Après le lavage final, ajoutez 1000 μL de PBS. La solution est de couleur rose clair. Transférez 200 μL de la suspension de levure lavée chargée de RB dans chacun des trois puits d’une plaque de 96 puits (en trois exemplaires).
   7. Positionnez la plaque à 96 puits sur le système d’éclairage photodynamique avec des ampoules LED qui éclairent en vert par le bas. Éteignez les lumières de la pièce pour assurer un éclairage uniforme et éviter les interférences. Activer le système d’éclairage LED pour délivrer la dose PDT de 4,38 J/cm² sur 2 min ; Assurez-vous que le système est bien aligné avec les puits.
   8. Après l’irradiation, diluez la suspension de levure dans une plaque à 96 puits. Ajoutez 20 μL de suspension de levure dans un puits contenant 180 μL de PBS, créant ainsi une dilution 10 fois. Répétez l’opération pour les dilutions restantes pour obtenir une plage de ^10-1 à ^10-5.
   9. Choisissez quatre facteurs de dilution (p. ex., ^10-2 à ^10-5) en fonction de l’ajustement de la concentration des cellules de levure.
   10. Pour chaque facteur de dilution, déposer 3 gouttes (20 μL chacune) par quadrant sur des plaques de gélose YPD.
   11. Une fois la suspension de levure complètement absorbée, environ 10 min par les plaques de gélose, inverser et incuber pendant une nuit à 37 °C.
   12. Définir T0 comme le C . glabrata parental témoin sans traitement PDT. Préparez les champignons T0 dans la phase de croissance logarithmique comme décrit ci-dessus et exposez-les à une lumière verte de 4,38 J/^cm2 en présence de 0,2% de RB. Cette condition PDT inhibe constamment 3 à 3,5 log de croissance fongique.
       1. Désignez les champignons survivants par T1 et exposez-les à nouveau à la même dose de PDT après qu’ils aient été expansés in vitro jusqu’à une phase de croissance logarithmique. Les champignons qui ont survécu après la deuxième PDT sont notés T2 et ainsi de suite.
   13. Le lendemain, choisissez des quadrants avec un nombre de colonies compris entre 5 et 80. Comptez le nombre de colonies dans chaque quadrant et calculez le titre à l’aide de la formule suivante : Unité formant colonies (UFC)/mL = Nombre de colonies (moyenne de triples) × Facteur de dilution × 50.
   14. Effectuez la coloration TTC (voir étape 3). Balayez la plaque comme décrit précédemment (étape 2.2).

3. Analyse de la fonction mitochondriale (test de coloration TCC)

REMARQUE : TTC est un indicateur redox et un accepteur d’électrons. Il devient rouge lorsque les composés blancs sont brisés par les électrons¹¹. Notez que toutes les cellules ne forment pas nécessairement des colonies visibles dans les 24 heures suivant la culture sur une plaque de gélose. Les colonies avec des mitochondries fonctionnelles deviennent rouges, tandis que celles avec des mitochondries non fonctionnelles restent blanches. Cela permet de différencier les colonies ayant des fonctionnalités mitochondriales différentes.

1. Après le traitement, diluez les suspensions de Candida sur des plaques de gélose YPD en fonction de la densité cellulaire souhaitée pour obtenir des colonies distinctes pour une visualisation et une coloration faciles.
2. Après 24 h de croissance à 37 °C, des colonies visibles se forment à partir d’une seule cellule. Pipette 20 μL de 20% TTC directement sur le centre de chaque colonie.
3. Après absorption complète, environ 10 min de TTC par les colonies, incuber à 37 °C pendant 30-40 min.

4. Cinétique de croissance de C. glabrata normale et petite

REMARQUE : Trois souches de levures ont été comparées : C. glabrata C2-1000907 T0 (isolat clinique sans traitement PDT), T3n (C. glabrata C2-1000907 après 3 RB-PDT consécutives présentant des colonies d’un diamètre moyen de 1,5 ± 0,8 mm similaires aux cellules parentales), et T3p (petites colonies de C. glabrata C2-1000907 après 3 RB-PDT consécutives).

1. Ajuster la suspension de cellules de levure dans un milieu YPD à une DO₆₀₀ de 0,1 (5 × 10⁶ cellules/mL) dans un tube de 3 mL.
2. Mesurez automatiquement la DO₆₀₀ de la culture statique toutes les 20 min à l’aide du lecteur de microplaques multimode (voir tableau des matériaux) pendant 24 h.

Résultats

Les données sont présentées comme la moyenne avec ±'erreur type et ont été obtenues à partir de trois expériences indépendantes, avec au moins des triples dans chaque groupe. Les données expérimentales, y compris le dénombrement des colonies, les mesures de DO₆₀₀ et les résultats de coloration TTC, ont été représentées graphiquement et analysées statistiquement à l’aide d’un logiciel graphique et statistique (voir la Table des matériaux). L’ANOVA à un facteur ou le <...

Discussion

Cette étude révèle que la PDT est la première méthode rapportée pour induire la formation de petites colonies chez Candida, surpassant les effets établis du bromure d’éthidium et du fluconazole. Cette nouvelle observation nécessite une exploration plus approfondie pour démêler ses implications à la fois pour l’éradication fongique en diminuant la virulence et l’émergence de mécanismes de résistance.

La PDT médiée par RB inhibe efficacement la croissance de C. glabra...

matériels

Name	Company	Catalog Number	Comments
0.22 μm filter	Merck, Taipei, Taiwan	Millex, SLGVR33RS
1.5 mL microfuge tube	Neptune, San Diego, USA	#3745
20% Triphenyltetrazolium chloride (TTC)	Sigma-Aldrich, MO, USA	T8877
5 mL polypropylene round bottom tube	Corning, AZ, USA	352059
5 mL round-bottom tube with cell strainer cap	Corning, AZ, USA	Falcon, #352235
96-well plate	Alpha plus, Taoyuan Hsien, Taiwan	#16196
Agar	BRS, Tainan, Taiwan	AG012
Blank disk	Advantec, Tokyo, Japan	49005040
Centrifuge	Eppendorf, UK	5415R
Ethidium bromide solution	Sigma-Aldrich, MO, USA	E1510
Fluconazole, 2 mg/mL	Pfizer, NY, USA	BC18790248
GraphPad Prism	GraphPad Software	Version 7.0
Green light emitting diode (LED) strip	Nanyi electronics Co.,Ltd, Tainan, Taiwan	5050	Excitation wave: 500~550 nm
Low Temperature. shake Incubators	Yihder, Taipei, Taiwan	LM-570D (R)
Mouth care cotton swabs	Good Verita Enterprise, Taipei, Taiwan	161357
Muller Hinton II agar	BD biosciences, California, USA	211438
Multimode microplate reader	Molecular Devices	SpectraMax i3x
OD600 spectrophotometer	Biochrom, London, UK	Ultrospec 10
Rose Bengal	Sigma-Aldrich, USA	330000	stock concentration 40 mg/mL = 4%, prepare in PBS, stored at 4 °C
Sterilized glass tube	Sunmei, Tainan, Taiwan	AK45048-16100
Yeast Extract Peptone Dextrose Medium	HIMEDIA, India	M1363