通过外膜周围氯化钙和弹性蛋白酶浸润的小鼠腹主动脉瘤模型

摘要

本手稿提出了一种使用氯化钙和弹性蛋白酶建立小鼠腹主动脉瘤模型的方案，结合了以前建模方法的优点。该模型可用于研究腹主动脉瘤的病理生理机制。

摘要

腹主动脉瘤 （AAA） 是一种危及生命的疾病，死亡率高。其特征是腹主动脉永久扩张，动脉直径至少增加 50%。已经引入了各种 AAA 动物模型来模拟病理生理变化并研究 AAA 的潜在机制。在这些模型中，氯化钙 （CaCl₂） 和弹性蛋白酶诱导的 AAA 模型常用于小鼠。但是，这些方法具有一定的局限性。传统的肠腔内猪胰弹性蛋白酶 （PPE） 灌注与高技术难度和高破裂率相关，而 PPE 的外膜周围给药产生不一致的结果。此外，CaCl₂ 诱导的 AAA 模型缺乏人类 AAA 特征，例如动脉粥样硬化血栓形成和动脉瘤破裂。因此，已提出将 CaCl₂ 和 PPE 的联合应用作为提高 AAA 动物模型成功率和诱导更大直径增加的一种方法。本手稿提出了一种全面的方案，用于通过在腹主动脉肾下段进行 PPE 和 CaCl₂ 的主动脉周围浸润来建立小鼠 AAA 模型。通过遵循此协议，我们可以实现大约 90% 的 AAA 形成率，同时具有技术简单性和可重复性。进一步的超声和组织学实验证实，该模型有效地复制了在人类 AAA 中观察到的形态学和病理变化。

引言

腹主动脉瘤 （AAA） 定义为腹主动脉直径增加超过 50% 或最大主动脉直径超过 3 cm。这种情况对生命构成重大威胁，动脉瘤破裂时的死亡率约为 90% ^1,2,3。目前，开放手术修复和血管内主动脉修复 （EVAR） 是 AAA 患者唯一可用的干预措施 ^4,5,6。然而，没有足够的证据支持药物治疗在抑制无手术指征的患者动脉瘤形成或减缓腹主动脉生长速度方面的有效性⁷。然而，非特异性治疗，包括持续监测最大动脉瘤直径、控制血压、抗血小板治疗和他汀类药物，以尽可能降低动脉瘤突然破裂和潜在心血管和神经系统事件的风险。尽管如此，抗血小板药物和他汀类药物在预防动脉瘤破裂中的作用仍然存在争议，需要进一步研究 ^5,7,8,9,10。

稳定的 AAA 动物模型对于研究 AAA 的发病机制至关重要，并且已经引入了许多方法来建立这样的模型 11,12,13。目前，氯化钙 （CaCl₂）、弹性蛋白酶、血管紧张素 II （Ang II）、异种移植物和转基因模型用于建立啮齿动物 AAA 模型 11,12,13。其中，Ang II 是小鼠最常用的，而 CaCl₂ 和弹性蛋白酶也广泛用于小鼠和大鼠 11,12,13,14。Ang II 诱导的 AAA 模型是唯一能够诱导动脉粥样硬化的动物模型，其病理学与人类 AAA 病理非常相似，简单且可重复，无需剖腹手术 11,12,13。然而，与 CaCl₂ 或弹性蛋白酶诱导的模型相比，Ang II 诱导的动脉瘤部位不确定，经常在降主动脉或肾上腹主动脉中观察到，破裂的风险增加 11,12,13,14。Ang II 诱导的 AAA 模型在基因缺陷小鼠中的动脉瘤发生率可高达 100%，而只有 39% 的 C57BL/6 小鼠发生动脉瘤，获得基因缺陷小鼠的时间和经济成本很高^13,15。

CaCl₂ 最初由 Gertz 等人引入，用于诱导颈动脉动脉瘤形成，后来由 Chiou 等人修饰，在小鼠中建立 AAA 模型^16,17。然而，尽管 CaCl₂ 能够诱导弹性纤维分解、血管炎症和细胞外基质降解，但它缺乏几种人类 AAA 特征，包括动脉粥样硬化血栓形成、腔内血栓 （ILT） 和动脉瘤破裂^12,18。此外，主动脉周围 CaCl₂ 应用的形成速率和直径增加百分比仍然不稳定^13,19。Anidjar 等人于 1990 年开发了用于诱导 AAA 的初始腔内猪胰弹性蛋白酶 （PPE） 灌注模型，随后 Bhamidipati 等人报告了小鼠模型中外膜周围 PPE 浸润^20,21。如今，由于其可行性和微创性，大多数弹性蛋白酶诱导的 AAA 动物模型都使用 Bhamidipati 的方案。然而，需要注意的是，AAA 的发生率和最大直径可能会有所不同，并且通常低于主动脉内 PPE 灌注。此外，由主动脉周围应用弹性蛋白酶诱导的动脉瘤具有自发愈合的趋势 11,12,20,21,22,23。

为了解决这些局限性，Tanaka 等人提出了一种涉及腔内 PPE 灌注和 CaCl₂ 浸润的组合方法，以在大鼠中建立 AAA 模型，并产生了令人满意的结果²⁴。此外，Zhu 等人证明，与单个 PPE 组和 PPE + BAPN 组相比，PPE + CaCl₂ 模型具有更高的生存率和更高的动脉瘤形成率等优势²⁵。这种组合方法还表现出良好的稳定性和可重复性。此外，Bi 等人 通过 主动脉周围 CaCl₂ 和弹性蛋白酶孵育的组合成功建立了兔 AAA 模型。第 5 天的平均扩张比为 65.3% ± 8.9%，第 15 天进一步增加到 86.5%，± 28.7%，第 30 天± 39.1% 显着上升至^{203.6% 和} 39.1%。然而，目前没有现有文献报道通过结合主动脉周围 CaCl₂ 和弹性蛋白酶应用在啮齿动物中诱导 AAA。

本手稿提出了一种通过联合使用外膜周围 CaCl₂ 和弹性蛋白酶浸润来建立小鼠 AAA 模型的标准方案。后续部分提供了详细的外科手术程序，并介绍了小鼠 AAA 模型的代表性结果。

研究方案

动物实验方案符合美国国立卫生研究院实验动物护理和使用指南（NIH Pub No. 86/23,1985），并得到四川大学华西医院机构动物护理和使用委员会的批准（批准号 202311300012）。本研究使用 8 至 10 周龄的 C57/B6J 雄性小鼠。所用试剂和设备的详细信息列在 材料表中。

1. 术前准备

1. 获得动物并在标准条件下（温度 24 °C，湿度 40%-50%，12 小时光暗循环）用干净的水喂养它们正常的食物。
2. 将化妆棉剪成 40 毫米 x 4 毫米的条状，并与剪刀、镊子和其他手术设备一起消毒。
3. 将动物放入麻醉机的诱导室中，使用 3%-3.5% 异氟醚快速诱导麻醉（遵循机构批准的方案）。此外，开具布托啡诺（1 mg/kg，肌内注射）作为抢先镇痛药物。
   1. 当鼠标不再对疼痛刺激有反应时，将鼠标从腔室中取出，然后在小鼠身上戴上面罩，用 1%-1.5% 异氟醚保持麻醉深度。每 5-10 分钟监测一次呼吸频率和深度。
4. 将鼠标仰卧在加热垫上，用胶带固定四肢，并涂上眼膏以防止干燥。
5. 使用电动剃须刀或脱毛化妆水完全去除腹部的毛发，然后用聚维酮碘和浸有乙醇的棉签以圆周运动对该区域进行至少三次消毒。

2. 外科手术

1. 将鼠标置于立体显微镜下。用剪刀沿腹部中线做一个大约 2-2.5 厘米的纵向切口。
2. 通过 白线 （经腹入路）进入腹膜腔，放置牵开器以暴露腹膜腔，并使用浸有生理盐水的纱布将肠道和结肠填塞到右半腹部。
3. 使用镊子和棉签对肾下腹主动脉和下腔静脉 （IVC） 附近的结缔组织和脂肪组织进行钝性分离。轻轻解剖腹主动脉，露出腹主动脉和上覆的大腰大肌之间的间隙，如前所述²⁵。
   1. 将消毒过的化妆棉条插入该缝隙中，要非常小心，不要损坏腰动脉或静脉。没有必要将腹主动脉与 IVC 隔离。
4. 用 0.9 M CaCl₂ 浸泡棉球，并将其放在腹主动脉外膜上 15 分钟。在浸润过程中使用消毒纱布覆盖腹腔。
5. 轻轻取出 CaCl₂ 浸泡的棉球，并用 0.9% 盐水溶液清洗浸润的片段。
6. 用 ddH₂O 将弹性蛋白酶稀释至 2 mg/mL （8 U/mL）。使用胰岛素注射器将 50 μL 稀释的弹性蛋白酶涂抹在腹主动脉的肾下段，并包裹化妆棉条以覆盖腹主动脉和 IVC。在浸润过程中使用消毒纱布覆盖腹腔。在 Sham 组中，使用 0.9% 生理盐水替代 CaCl₂ 和 PPE。
7. 15 分钟后，小心地取下纱布和化妆棉条。将肠道和结肠移回原来的位置，用肠系膜覆盖处理过的主动脉，并润湿肠道以防止粘连。
8. 使用 6-0 不可吸收的聚丙烯缝合线分别闭合肌肉层和皮肤。用聚维酮碘和乙醇对手术区域进行消毒。
9. 将鼠标放在加热垫上并监测其呼吸状态，直到它恢复意识。记录作时间和实验动物的数量。根据兽医建议，开具卡洛芬（5 mg/kg，皮下注射）作为术后镇痛剂，术后至少 3 天。

3. 超声检查

1. 手术后 21 天，进行超声检查以评估 AAA 的发生率。
2. 麻醉小鼠（遵循机构批准的方案）并如前所述去除腹毛。
3. 将鼠标放在啮齿动物超声机的加热垫上。将超声耦合剂涂抹在腹部，测量动脉瘤的最大直径和腹主动脉正常段的直径。
   1. 计算肾下腹主动脉增加的百分比。成功形成 AAA 的标准是 AAA 的最大直径与肾下腹主动脉正常段的直径相比增加了 50% 或更多。
4. 检查后用餐巾擦去残留的超声耦合剂，并将鼠标放在加热垫上，直至完全恢复。

4. 腹主动脉采集和病理实验

1. 在超声检查后的第二天（遵循机构批准的方案）通过异氟醚过量处死小鼠。
2. 打开胸腔和腹腔，按照先前文献中描述的程序，通过左心室用 1x PBS 进行灌注，直到肺和肝脏变白²⁷。
3. 使用数字卡尺测量肾下主动脉的外径。在立体显微镜下收获肾下腹主动脉，并将容器储存在 4% 多聚甲醛中 24-48 小时。
4. 去除腹主动脉周围的结缔组织和脂肪组织。将主动脉嵌入石蜡中以制备切片，如前所述将切片切成 3-5 μm 切片^18,28。
5. 根据制造商的说明，使用相应的染色试剂盒对脱蜡切片进行苏木精和伊红 （H&E）、Masson 三色和 Elastic-Van Gieson （EVG） 染色。
   1. 用 H&E 染色分析血管结构和炎症，用 Masson 三色染色观察细胞外基质 （ECM） 降解和胶原纤维，用 EVG 染色检查弹性纤维。

结果

在本研究中，共纳入 24 只小鼠并随机分配： Sham 组 12 只，PPE + CaCl₂ 组 12 只。除非另有说明，否则所有数据均以均值±标准差表示。平均手术时间为 55.67 min± 4.08 min。无术中死亡或动脉瘤破裂，术后 21 天内生存率为 100%。未观察到与腹主动脉夹层相关的严重肠粘连或并发症。

在 PPE + CaCl₂ 组中，12 只小鼠中有 11 只 （91.67%） 在手术后 21...

讨论

对 AAA 分子机制的研究需要一个稳定的动物模型。因此，自 Economou 等人在 1960 年代首次开发以来，已经建立了许多 AAA 动物模型²⁹。在这些模型中，CaCl₂ 由于其成本效益、技术简单性和可靠的可重复性而经常用于啮齿动物。然而，血管周围 CaCl₂ 浸润已被证明在建立 AAA 时不稳定。Bi 等人和 Freestone 等人报告说，即使 AAA 形成的标准定义为与...

材料

Name	Company	Catalog Number	Comments
Anesthesia Machine	RWD	R550
Butorphanol	Jiangsu Hengrui Pharmaceutical Co., Ltd	220608BP	1ml: 1mg
C57BL/6JGpt Male Mice	GemPharmatech	N000013
Calcium Chloride	Sigma Aldrich	C4901	100 g
Carprofen	MCE	HY-B1227	100 mg
Chow Diet	Dossy Experimental Animals Co.Ltd
Digital Caliper	Greener	IP54
Ethanol	Jinhe Pharmaceutical Co.Ltd	539682	75%/500 mL
EVG Staining Kit	Solarbio	G1597
GraphPad Prism	Graphpad		Ver 9.0.0
H&E Staining Kit	Servicebio	G1076
Insulin Syringe	BD	2143420
Isoflurane	RWD	R510-22-4	100 mL
Masson Staining Kit	Servicebio	G1006
Normal Saline	Servicebio	G4702	500 mL
Paraformaldehyde	Biosharp	BL539A	4%/500 mL
PBS, 1x	Servicebio	G4202	500 mL
Porcine Pancreatic Elastase	Sigma Aldrich	E1250	100 mg
Povidine Iodine	Yongan Pharmaceutical Co.Ltd		5%/100 mg
Prolene Polypropylene Suture	Ethicon LLC	8709H
Rodent Ultrasound System	Fujifilm	Vevo 3100LT
Stereo Microscope	Olympus	SZ61
Ultrasonic Couplant	Keppler	KL-250	250 g