Periadventitial Calcium Chloride and Elastase Infiltration에 의한 마우스 복부 대동맥류 모델

요약

이 원고는 염화칼슘과 엘라스타제를 사용하여 생쥐 복부 대동맥류 모델을 확립하기 위한 프로토콜을 제시하고 이전 모델링 방법의 장점을 결합합니다. 이 모델은 복부 대동맥류의 기저에 있는 병태생리학적 메커니즘을 조사하는 데 사용할 수 있습니다.

초록

복부 대동맥류(AAA)는 높은 사망률과 관련하여 생명을 위협하는 질병입니다. 동맥 직경이 50% 이상 증가함에 따라 복부 대동맥이 영구적으로 확장되는 것이 특징입니다. 병태생리학적 변화를 모방하고 AAA의 기본 메커니즘을 연구하기 위해 AAA의 다양한 동물 모델이 도입되었습니다. 이러한 모델 중 염화칼슘(CaCl₂) 및 엘라스타제 유도 AAA 모델은 마우스에서 일반적으로 사용됩니다. 그러나 이러한 방법에는 특정 제한 사항이 있습니다. 기존의 광강내 돼지 췌장 엘라스타제(PPE) 관류는 기술적 난이도가 높고 파열률이 높은 반면, PPE의 유습 투여는 일관되지 않은 결과를 낳습니다. 또한 CaCl₂ 유도 AAA 모델에는 죽상혈전증 및 동맥류 파열과 같은 인간 AAA 기능이 없습니다. 따라서 CaCl₂ 와 PPE의 결합 적용은 AAA 동물 모델에서 성공률을 높이고 더 큰 직경 증가를 유도하는 접근 방식으로 제안되었습니다. 이 원고는 복부 대동맥의 내측에서 PPE 및 CaCl₂ 의 대동맥 주위 침윤을 통해 마우스 AAA 모델을 확립하기 위한 포괄적인 프로토콜을 제시합니다. 이 프로토콜을 따르면 기술적 단순성과 재현성으로 약 90%의 AAA 형성률을 달성할 수 있습니다. 추가 초음파 및 조직학적 실험을 통해 이 모델이 인간 AAA에서 관찰된 형태학적 및 병리학적 변화를 효과적으로 복제한다는 것을 확인했습니다.

서문

복부 대동맥류(AAA)는 복부 대동맥의 직경이 50% 이상 증가하거나 최대 대동맥 직경이 3cm를 초과하는 것으로 정의됩니다. 이 질환은 생명에 심각한 위협이 되며, 동맥류 파열 시 사망률이 약 90%에 이릅니다 ^1,2,3. 현재 개복 수술 및 혈관 내 대동맥 수복술(EVAR)은 AAA 환자에게 사용할 수 있는 유일한 중재법이다 ^4,5,6. 그러나 외과적 적응증이 없는 환자에서 동맥류 형성을 억제하거나 복부 대동맥의 성장 속도를 늦추는 의학적 치료의 효과를 뒷받침하는 근거는 불충분하다⁷. 그럼에도 불구하고 동맥류 최대 직경에 대한 지속적인 감시, 혈압 조절, 항혈소판 요법 및 스타틴을 포함한 비특이적 치료법은 갑작스러운 동맥류 파열과 잠재적인 심혈관 및 신경학적 사건의 위험을 최대한 줄이기 위해 사용됩니다. 그럼에도 불구하고 동맥류 파열을 예방하는 항혈소판제와 스타틴의 역할은 여전히 논란의 여지가 있으며 추가 연구가 필요하다 ^5,7,8,9,10.

안정적인 AAA 동물 모델은 AAA의 발병 기전을 조사하는 데 필수적이며, 이러한 모델을 확립하기 위해 수많은 방법이 도입되었습니다 11,12,13. 현재 염화칼슘(CaCl2_{), 엘라}스타제, 안지오텐신 II(Ang II), 이종이식 및 형질전환 모델이 설치류 AAA 모델을 확립하는 데 사용됩니다(11,12,13). 이 중 Ang II는 마우스에서 가장 일반적으로 사용되는 반면, CaCl₂ 및 엘라스타제는 마우스와 랫트에서도 널리 사용됩니다 11,12,13,14. Ang II 유도 AAA 모델은 인간 AAA 병리학과 매우 유사한 죽상동맥경화증을 유도할 수 있는 유일한 동물 모델로, 간단하고 재현 가능하며 개복술의 필요성을 없애줍니다 11,12,13. 그러나 CaCl₂ 또는 엘라스타제에 의해 유도된 모델과 달리 Ang II에 의해 유도된 동맥류 부위는 불확실하고 하행 대동맥 또는 복부 상부 대동맥에서 자주 관찰되며 파열 위험이 높습니다 11,12,13,14. 유전자 결핍 마우스에서 Ang II 유도 AAA 모델의 동맥류 발생률은 100%까지 높을 수 있는 반면, C57BL/6 마우스의 39%만이 동맥류를 발생시켰으며, 유전자 결핍 마우스를 얻는 데 드는 시간과 경제적 비용이 높습니다^13,15.

Gertz et al.에 의해 처음 소개된 CaCl₂는 경동맥에서 동맥류 형성을 유도하는 데 사용되었으며 나중에 Chiou et al.에 의해 수정되어 마우스^16,17에서 AAA 모델을 확립했습니다. 그러나 탄성 섬유 파괴, 혈관 염증 및 세포외 기질 저하를 유도하는 능력에도 불구하고 CaCl₂는 죽상혈전증, ILT(Intraluminal thrombus) 및 동맥류 파열^12,18을 포함한 여러 인간 AAA 기능이 없습니다. 또한, 대동맥 주위 CaCl₂ 적용의 형성 속도 및 직경 증가 비율은 불안정한 상태로 남아 있습니다^13,19. AAA를 유도하기 위한 초기 발광 내 돼지 췌장 엘라스타제(PPE) 관류 모델은 1990년 Anidjar et al.에 의해 개발되었으며, 그 후 Bhamidipati et al.의 쥐 모델에서의 유래 PPE 침투에 대한 보고서가 뒤따랐^{습니다 20,21}. 오늘날 엘라스타제 유도 AAA 동물 모델의 대다수는 실현 가능성과 최소 침습적 특성으로 인해 Bhamidipati의 프로토콜을 사용합니다. 그러나 AAA의 발생률과 최대 직경은 다양할 수 있으며 일반적으로 대동맥 내 PPE 관류보다 낮다는 점에 유의하는 것이 중요합니다. 또한, 엘라스타제의 대동맥 주위 도포에 의해 유발된 동맥류는 자연 치유되는 경향을 나타낸다 11,12,20,21,22,23.

이러한 한계를 해결하기 위해 Tanaka 등은 쥐에서 AAA 모델을 확립하기 위해 광내 PPE 관류와 CaCl₂ 침투를 포함하는 조합 접근법을 제안했으며, 이는 만족스러운 결과를 산출했습니다²⁴. 또한, Zhu et al.은 PPE + CaCl₂ 모델이 단일 PPE 그룹 및 PPE + BAPN 그룹²⁵에 비해 더 높은 생존율 및 증가된 동맥류 형성률과 같은 이점을 제공한다는 것을 입증했습니다. 이 결합된 접근 방식은 또한 우수한 안정성과 재현성을 나타냅니다. 또한, Bi et al.은 대동맥 주위 CaCl₂와 엘라스타제 배양의 조합을 통해 토끼 AAA 모델을 성공적으로 확립했습니다. 평균 팽창율은 5일째 65.3% ± 8.9%였으나, 15일째 86.5% ± 28.7%로 더욱 증가하였고,²⁶ 30일째 203.6% ± 39.1%로 크게 증가하였다. 그러나 현재 대동맥 주위 CaCl₂와 엘라스타제 적용을 결합하여 설치류에서 AAA의 유도를 보고하는 기존 문헌은 없습니다.

이 원고는 intraventitial CaCl₂ 및 elastase infiltration의 조합을 통해 murine AAA 모델을 확립하기 위한 표준 프로토콜을 제시합니다. 다음 섹션에서는 자세한 수술 절차를 제공하고 쥐 AAA 모델의 대표적인 결과를 제시합니다.

프로토콜

동물 실험 프로토콜은 미국 국립보건원(National Institute of Health)의 실험동물 관리 및 사용 가이드(NIH Pub No. 86/23, 1985)를 준수했으며, 쓰촨 대학교 화화(West China Hospital)의 기관 동물 관리 및 사용 위원회(승인 번호 202311300012)의 승인을 받았습니다. 이 연구에는 8주에서 10주 된 C57/B6J 수컷 마우스가 사용되었습니다. 사용된 시약 및 장비에 대한 자세한 내용은 재료 표에 나열되어 있습니다.

1. 수술 전 준비

1. 동물을 구하여 표준 조건(온도 24°C, 습도 40%-50%, 12시간 명암 주기)에서 깨끗한 물로 정상적인 차우 식단을 먹입니다.
2. 화장솜을 40mm x 4mm 스트립으로 자르고 가위, 집게 및 기타 수술 장비와 함께 소독합니다.
3. 동물을 마취 기계의 유도 챔버에 넣고 3%-3.5% 이소플루란을 사용하여 빠르게 마취를 유도합니다(기관에서 승인된 프로토콜에 따름). 또한 선제적 진통제로 부토르파놀(1mg/kg, 근육주사)을 처방한다.
   1. 통증 자극에 더 이상 반응하지 않으면 챔버에서 마우스를 제거한 다음 마우스에 마스크를 놓고 1%-1.5% 이소플루란으로 마취 깊이를 유지합니다. 5-10분마다 호흡수와 깊이를 모니터링합니다.
4. 마우스를 가열 패드의 누운 자세에 놓고 접착 테이프를 사용하여 팔다리를 고정하고 안연고를 바르어 건조를 방지합니다.
5. 전기 면도기나 제모 로션을 사용하여 복부 부위의 털을 완전히 제거한 다음 포비돈 요오드와 에탄올에 적신 면봉으로 이 부위를 3회 이상 원을 그리며 소독합니다.

2. 수술 절차

1. 마우스를 실체현미경 아래에 놓습니다. 가위를 사용하여 복부 정중선을 따라 약 2-2.5cm의 세로로 절개합니다.
2. linea alba(경복부 접근법)를 통해 복막강에 들어가 견인기를 놓아 복막강을 노출시키고 생리식염수에 적신 거즈를 사용하여 장과 결장을 복부 오른쪽 절반에 포장합니다.
3. 겸자와 면봉을 사용하여 복부 대동맥과 하대정맥(IVC)에 인접한 결합 조직과 지방 조직을 둔하게 분리합니다. 복부 대동맥을 부드럽게 절개하고 앞서 언급한 바와 같이 복부 대동맥과 그 위에 있는 대요근 사이의 틈을 노출시킨다²⁵.
   1. 멸균된 화장솜 스트립을 그 틈에 삽입하고 요추 동맥이나 정맥이 손상되지 않도록 각별히 주의하십시오. IVC에서 복부 대동맥을 분리할 필요는 없습니다.
4. 면봉에 0.9M CaCl₂ 를 적시고 복부 대동맥의 막부에 15분 동안 놓습니다. 침윤 과정에서 복강을 덮기 위해 멸균된 거즈를 사용하십시오.
5. CaCl₂에 적신 면봉을 부드럽게 제거하고 침투된 부분을 0.9% 식염수로 세척합니다.
6. 엘라스타제를 ddH₂O로 2mg/mL(8U/mL)로 희석합니다. 인슐린 주사기를 사용하여 희석된 엘라스타제 50μL를 복부 대동맥의 내측 분절에 바르고 면 패드 스트립을 감싸 복부 대동맥과 IVC를 덮습니다. 침윤 과정에서 복강을 덮기 위해 멸균된 거즈를 사용하십시오. 가짜 그룹에서는 CaCl₂ 및 PPE를 대체하기 위해 0.9% 생리식염수를 사용하십시오.
7. 15분 후 거즈와 화장솜 스트립을 조심스럽게 제거합니다. 장과 결장을 원래 위치로 되돌려 놓고, 치료한 대동맥을 장간막으로 덮고, 장을 촉촉하게 하여 유착을 방지합니다.
8. 6-0 비흡수성 폴리프로필렌 봉합사를 사용하여 근육층과 피부를 따로 닫습니다. 수술 부위를 포비돈 요오드와 에탄올로 소독합니다.
9. 마우스를 가열 패드에 놓고 의식을 회복할 때까지 호흡 상태를 모니터링합니다. 수술 시간과 실험 동물의 수를 기록합니다. 수의사의 권고에 따라 수술 후 최소 3일 동안 수술 후 진통으로 카프로펜(5mg/kg, 피하)을 처방하십시오.

3. 초음파 검사

1. 수술 21일 후 초음파 검사를 실시하여 AAA 발생률을 평가합니다.
2. 쥐를 마취하고(기관에서 승인된 프로토콜에 따라) 이전에 설명한 대로 복부를 제거합니다.
3. 설치류 초음파 기계의 가열 패드에 마우스를 놓습니다. 복부에 초음파 접촉 매질을 적용하고 동맥류의 최대 직경과 복부 대동맥의 정상 분절 직경을 측정합니다.
   1. infrarenal abdominal aorta의 증가된 백분율을 계산합니다. 성공적인 AAA 형성을 위한 기준은 AAA의 최대 직경이 흉부 대동맥의 정상 분절 직경에 비해 50% 이상 증가했다는 것입니다.
4. 검사 후 냅킨을 사용하여 남아있는 초음파 접촉 매질을 닦아내고 완전히 회복 될 때까지 마우스를 가열 패드에 올려 놓습니다.

4. 복부 대동맥 채취 및 병리학 실험

1. 초음파 검사 다음 날에 이소플루란 과다 복용으로 마우스를 희생합니다(기관에서 승인한 프로토콜에 따름).
2. 흉강 및 복강을 열고 이전 문헌²⁷에 설명된 절차에 따라 폐와 간이 하얗게 변할 때까지 좌심실을 통해 1x PBS로 관류를 수행합니다.
3. 디지털 캘리퍼스를 사용하여 대동맥 내륙 대동맥의 외경을 측정합니다. 실체현미경으로 infraarenal abdominal aorta를 채취하고 혈관을 24-48시간 동안 4% 파라포름알데히드에 보관합니다.
4. 복부 대동맥을 둘러싼 결합 및 지방 조직을 제거합니다. 대동맥을 파라핀에 삽입하여 절편을 준비하고 앞서 설명한 대로 단면을 3-5μm 조각으로 자릅니다^18,28.
5. 제조업체의 지침에 따라 각각의 염색 키트를 사용하여 탈파라핀화된 슬라이스에 대해 헤마톡실린 및 에오신(H&E), Masson의 삼색조 및 EVG(Elastic-Van Gieson) 염색을 수행합니다.
   1. H&E 염색으로 혈관 구조와 염증을 분석하고, Masson의 삼색 염색으로 세포외기질(ECM) 분해 및 콜라겐 섬유를 관찰하고, EVG 염색으로 탄성 섬유를 검사합니다.

결과

이 연구에서는 총 24 마리의 마우스를 포함하여 무작위로 할당했습니다 : 각각 Sham 그룹에 12 명, PPE + CaCl₂ 그룹에 12 명. 모든 데이터는 달리 명시되지 않는 한 표준 편차 ± 평균으로 표시됩니다. 평균 작동 시간은 55.67분± 4.08분이었습니다. 수술 중 사망이나 동맥류 파열은 없었으며, 수술 후 21일 이내 생존율은 100%였다. 복부 대동맥 박리와 관련된 심각한 장 유착이...

토론

AAA의 분자 메커니즘에 대한 연구는 안정적인 동물 모델을 필요로 합니다. 결과적으로, 1960년대에 Economou et al.에 의해 처음 개발된 이래 수많은 AAA 동물 모델이 확립되었다²⁹. 이러한 모델 중 CaCl₂ 는 비용 효율성, 기술적 단순성 및 신뢰할 수있는 재현성으로 인해 설치류에 자주 사용됩니다. 그러나, 혈관 주위 CaCl₂ 침윤은 AAA를 형성하는 데...

자료

Name	Company	Catalog Number	Comments
Anesthesia Machine	RWD	R550
Butorphanol	Jiangsu Hengrui Pharmaceutical Co., Ltd	220608BP	1ml: 1mg
C57BL/6JGpt Male Mice	GemPharmatech	N000013
Calcium Chloride	Sigma Aldrich	C4901	100 g
Carprofen	MCE	HY-B1227	100 mg
Chow Diet	Dossy Experimental Animals Co.Ltd
Digital Caliper	Greener	IP54
Ethanol	Jinhe Pharmaceutical Co.Ltd	539682	75%/500 mL
EVG Staining Kit	Solarbio	G1597
GraphPad Prism	Graphpad		Ver 9.0.0
H&E Staining Kit	Servicebio	G1076
Insulin Syringe	BD	2143420
Isoflurane	RWD	R510-22-4	100 mL
Masson Staining Kit	Servicebio	G1006
Normal Saline	Servicebio	G4702	500 mL
Paraformaldehyde	Biosharp	BL539A	4%/500 mL
PBS, 1x	Servicebio	G4202	500 mL
Porcine Pancreatic Elastase	Sigma Aldrich	E1250	100 mg
Povidine Iodine	Yongan Pharmaceutical Co.Ltd		5%/100 mg
Prolene Polypropylene Suture	Ethicon LLC	8709H
Rodent Ultrasound System	Fujifilm	Vevo 3100LT
Stereo Microscope	Olympus	SZ61
Ultrasonic Couplant	Keppler	KL-250	250 g