Un modello murino di aneurisma dell'aorta addominale mediante cloruro di calcio periavventiziale e infiltrazione di elastasi

Riepilogo

Questo manoscritto presenta un protocollo per stabilire un modello murino di aneurisma dell'aorta addominale utilizzando cloruro di calcio ed elastasi, combinando i vantaggi dei precedenti metodi di modellazione. Questo modello può essere utilizzato per studiare i meccanismi fisiopatologici alla base degli aneurismi dell'aorta addominale.

Abstract

L'aneurisma dell'aorta addominale (AAA) è una malattia pericolosa per la vita associata ad alti tassi di mortalità. È caratterizzata dalla dilatazione permanente dell'aorta addominale con un aumento di almeno il 50% del diametro arterioso. Vari modelli animali di AAA sono stati introdotti per imitare i cambiamenti fisiopatologici e studiare i meccanismi sottostanti dell'AAA. Tra questi modelli, i modelli AAA indotti da cloruro di calcio (CaCl₂) ed elastasi sono comunemente usati nei topi. Tuttavia, questi metodi presentano alcune limitazioni. La tradizionale perfusione intraluminale di elastasi pancreatica suina (PPE) è associata a un'elevata difficoltà tecnica e a un alto tasso di rottura, mentre la somministrazione periavventiziale di DPI produce risultati incoerenti. Inoltre, il modello AAA indotto da CaCl₂ manca di caratteristiche AAA umane, come l'aterotrombosi e la rottura dell'aneurisma. Pertanto, l'applicazione combinata di CaCl₂ e PPE è stata proposta come approccio per aumentare le percentuali di successo e indurre maggiori aumenti di diametro nei modelli animali AAA. Questo manoscritto presenta un protocollo completo per stabilire un modello murino di AAA attraverso l'infiltrazione periaortica di PPE e CaCl₂ nel segmento infrarenale dell'aorta addominale. Seguendo questo protocollo, possiamo raggiungere un tasso di formazione di AAA di circa il 90% con semplicità tecnica e riproducibilità. Ulteriori esperimenti ecografici e istologici confermano che questo modello replica efficacemente i cambiamenti morfologici e patologici osservati nell'AAA umana.

Introduzione

L'aneurisma dell'aorta addominale (AAA) è definito come un aumento del diametro superiore al 50% o un diametro aortico massimo superiore a 3 cm nell'aorta addominale. Questa condizione rappresenta una minaccia significativa per la vita, con un tasso di mortalità di circa il 90% in caso di rottura dell'aneurisma ^1,2,3. Attualmente, la riparazione chirurgica a cielo aperto e la riparazione endovascolare dell'aorta (EVAR) sono gli unici interventi disponibili per i pazienti con AAA ^4,5,6. Tuttavia, non ci sono prove sufficienti per supportare l'efficacia dei trattamenti medici nell'inibire la formazione di aneurismi o nel rallentare il tasso di crescita dell'aorta addominale in pazienti che non hanno indicazioni chirurgiche⁷. Tuttavia, trattamenti non specifici, tra cui la sorveglianza persistente del diametro massimo dell'aneurisma, il controllo della pressione sanguigna, la terapia antipiastrinica e le statine, vengono utilizzati per ridurre il più possibile il rischio di rottura improvvisa dell'aneurisma e potenziali eventi cardiovascolari e neurologici. Nonostante ciò, il ruolo dei farmaci antipiastrinici e delle statine nella prevenzione della rottura dell'aneurisma rimane controverso e richiede ulteriori studi 5,7,8,9,10.

Un modello animale stabile di AAA è vitale per studiare la patogenesi dell'AAA e sono stati introdotti numerosi metodi per stabilire tale modello 11,12,13. Attualmente, il cloruro di calcio (CaCl₂), l'elastasi, l'angiotensina II (Ang II), gli xenotrapianti e i modelli transgenici sono utilizzati per stabilire modelli AAA di roditori 11,12,13. Tra questi, l'Ang II è il più comunemente usato nei topi, mentre il CaCl₂ e l'elastasi sono ampiamente utilizzati anche nei topi e nei ratti 11,12,13,14. Il modello AAA indotto da Ang II è l'unico modello animale in grado di indurre l'aterosclerosi che assomiglia molto alla patologia AAA umana, che è semplice e riproducibile e ovvia alla necessità di laparotomia 11,12,13. Tuttavia, a differenza dei modelli indotti da CaCl₂ o elastasi, la sede degli aneurismi indotta da Ang II è incerta e frequentemente osservata nell'aorta discendente o nell'aorta addominale surrenale, con un aumentato rischio di rottura 11,12,13,14. Il tasso di incidenza dell'aneurisma del modello AAA indotto da Ang II nei topi con deficit genetico può raggiungere il 100%, mentre solo il 39% dei topi C57BL/6 ha sviluppato aneurismi e il tempo e il costo economico per ottenere topi con deficit genetico sono elevati^13,15.

Inizialmente introdotto da Gertz et al., CaCl₂ è stato utilizzato per indurre la formazione di aneurisma nell'arteria carotide e successivamente modificato da Chiou et al. per stabilire un modello AAA nei topi^16,17. Tuttavia, nonostante la sua capacità di indurre la rottura delle fibre elastiche, l'infiammazione dei vasi e la degradazione della matrice extracellulare, CaCl₂ manca di diverse caratteristiche AAA umane, tra cui l'aterotrombosi, il trombo intraluminale (ILT) e la rottura dell'aneurisma^12,18. Inoltre, la velocità di formazione e la percentuale di aumento del diametro dell'applicazione periaortica di CaCl₂ rimangono instabili^13,19. Il modello iniziale di perfusione intraluminale dell'elastasi pancreatica suina (PPE) per indurre l'AAA è stato sviluppato da Anidjar et al. nel 1990, seguito dal rapporto di Bhamidipati et al. sull'infiltrazione periavventiziale di PPE in un modello murino^20,21. Al giorno d'oggi, la maggior parte dei modelli animali di AAA indotta da elastasi utilizza il protocollo di Bhamidipati per la sua fattibilità e la sua natura minimamente invasiva. Tuttavia, è importante notare che il tasso di incidenza e il diametro massimo dell'AAA possono variare e sono generalmente inferiori alla perfusione intra-aortica di DPI. Inoltre, gli aneurismi indotti dall'applicazione periaortica di elastasi presentano una tendenza a guarire spontaneamente 11,12,20,21,22,23.

Per affrontare queste limitazioni, Tanaka et al. hanno proposto un approccio combinato che coinvolge la perfusione intraluminale di PPE e l'infiltrazione di CaCl₂ per stabilire un modello AAA nei ratti, che ha prodotto risultati soddisfacenti²⁴. Inoltre, Zhu et al. hanno dimostrato che il modello PPE + CaCl₂ offre vantaggi come tassi di sopravvivenza più elevati e tassi di formazione di aneurismi più elevati rispetto sia al gruppo PPE singolo che al gruppo PPE + BAPN²⁵. Questo approccio combinato mostra anche una buona stabilità e riproducibilità. Inoltre, Bi et al. hanno stabilito con successo un modello AAA di coniglio attraverso la combinazione di CaCl₂ periaortica e incubazione di elastasi. Il rapporto di dilatazione medio è stato del 65,3% ± dell'8,9% il giorno 5, che è ulteriormente aumentato all'86,5% ± al 28,7% del giorno 15 ed è aumentato significativamente al 203,6% ± al 39,1% del giorno 30²⁶. Tuttavia, attualmente non esiste letteratura esistente che riporti l'induzione di AAA nei roditori combinando l'applicazione di CaCl₂ periaortica ed elastasi.

Questo manoscritto presenta un protocollo standard per stabilire un modello murino di AAA attraverso l'uso combinato di CaCl₂ periavventiziale e infiltrazione di elastasi. Le sezioni successive forniscono procedure chirurgiche dettagliate e presentano risultati rappresentativi del modello AAA murino.

Protocollo

Il protocollo dell'esperimento sugli animali era conforme alla Guida dell'Istituto Nazionale di Salute per la Cura e l'Uso degli Animali da Laboratorio (NIH Pub n. 86/23, 1985) ed è stato approvato dal Comitato Istituzionale per la Cura e l'Uso degli Animali del West China Hospital, Università del Sichuan (Numero di approvazione 202311300012). Per questo studio sono stati utilizzati topi maschi C57/B6J di età compresa tra otto e dieci settimane. I dettagli dei reagenti e delle attrezzature utilizzate sono elencati nella Tabella dei Materiali.

1. Preparazione preoperatoria

1. Procurare gli animali e nutrirli con una normale dieta con acqua pulita in condizioni standard (temperatura 24 °C, umidità 40%-50%, ciclo luce-buio di 12 ore).
2. Taglia un batuffolo di cotone in strisce di 40 mm x 4 mm e sterilizzalo insieme a forbici, pinze e altre attrezzature chirurgiche.
3. Posizionare l'animale nella camera di induzione della macchina per anestesia e utilizzare isoflurano al 3%-3,5% per indurre rapidamente l'anestesia (seguendo i protocolli approvati istituzionalmente). Inoltre, prescrivere il butorfanolo (1 mg/kg, iniezione intramuscolare) come farmaco analgesico preventivo.
   1. Rimuovere il topo dalla camera quando non risponde più alla stimolazione del dolore, quindi posizionare una maschera sul topo e mantenere la profondità dell'anestesia con isoflurano all'1%-1,5%. Monitorare la frequenza respiratoria e la profondità ogni 5-10 minuti.
4. Posizionare il mouse in posizione supina sul termoforo, utilizzare del nastro adesivo per immobilizzare gli arti e applicare un unguento per gli occhi per prevenire la secchezza.
5. Utilizzare un rasoio elettrico o una lozione depilatoria per rimuovere completamente i peli nella zona addominale, quindi disinfettare quest'area con tamponi di cotone imbevuti di iodio povidone ed etanolo con un movimento circolare almeno tre volte.

2. Procedura chirurgica

1. Posiziona il mouse sotto uno stereomicroscopio. Con le forbici praticare un'incisione longitudinale di circa 2-2,5 cm lungo la linea mediana dell'addome.
2. Entrare nella cavità peritoneale attraverso la linea alba (approccio transaddominale), posizionare un divaricatore per esporre la cavità peritoneale e impacchettare l'intestino e il colon nella metà destra dell'addome utilizzando una normale garza imbevuta di soluzione fisiologica.
3. Eseguire la separazione smussata del tessuto connettivo e adiposo adiposo adiacente all'aorta addominale infrarenale e alla vena cava inferiore (IVC) utilizzando pinze e tamponi di cotone. Sezionare delicatamente l'aorta addominale ed esporre lo spazio tra l'aorta addominale e lo psoas major sovrastante, come precedentemente indicato²⁵.
   1. Inserisci le strisce di dischetto di cotone sterilizzate in quella fessura, facendo molta attenzione a non danneggiare l'arteria o la vena lombare. Non è necessario isolare l'aorta addominale dall'IVC.
4. Immergere il batuffolo di cotone con 0,9 M di CaCl₂ e posizionarlo sull'avventizia dell'aorta addominale per 15 minuti. Utilizzare una garza sterilizzata per coprire la cavità addominale durante il processo di infiltrazione.
5. Rimuovere delicatamente il batuffolo di cotone imbevuto di CaCl₂ e lavare il segmento infiltrato con una soluzione salina allo 0,9%.
6. Diluire l'elastasi a 2 mg/mL (8 U/mL) con ddH₂O. Utilizzare una siringa da insulina per applicare 50 μL di elastasi diluita al segmento infrarenale dell'aorta addominale e avvolgere le strisce di dischetti di cotone per coprire l'aorta addominale e l'IVC. Utilizzare una garza sterilizzata per coprire la cavità addominale durante il processo di infiltrazione. Nel gruppo Sham, utilizzare soluzione fisiologica allo 0,9% per sostituire CaCl₂ e PPE.
7. 15 minuti dopo, rimuovere con cura la garza e le strisce di dischetto di cotone. Riportare l'intestino e il colon nelle loro posizioni originali, coprire l'aorta trattata con il mesentere e inumidire l'intestino per prevenire l'adesione.
8. Chiudere lo strato muscolare e la pelle separatamente utilizzando una sutura in polipropilene 6-0 non assorbibile. Disinfettare l'area chirurgica con iodio povidone ed etanolo.
9. Posiziona il mouse su un termoforo e monitora il suo stato respiratorio fino a quando non riprende conoscenza. Registrare il tempo dell'operazione e il numero di animali da esperimento. Prescrivere il carprofene (5 mg/kg, per via sottocutanea) come analgesia post-operatoria per almeno 3 giorni dopo l'intervento, secondo le raccomandazioni del veterinario.

3. Esame ecografico

1. 21 giorni dopo l'intervento, condurre un esame ecografico per valutare il tasso di incidenza di AAA.
2. Anestetizzare il topo (seguendo protocolli istituzionalmente approvati) e rimuovere i peli addominali come precedentemente descritto.
3. Posiziona il mouse sul termoforo dell'ecografo per roditori. Applicare l'accoppiante ad ultrasuoni sull'addome e misurare il diametro massimo dell'aneurisma e il diametro del segmento normale dell'aorta addominale.
   1. Calcolare l'aumento della percentuale dell'aorta addominale infrarenale. Il criterio per il successo della formazione di AAA è che il diametro massimo dell'AAA sia aumentato del 50% o più rispetto al diametro del segmento normale dell'aorta addominale infrarenale.
4. Utilizzare un tovagliolo per rimuovere l'accoppiante ultrasonico rimanente dopo l'esame e posizionare il mouse sul termoforo fino a quando non si è completamente ripreso.

4. Prelievo dell'aorta addominale ed esperimenti patologici

1. Sacrificare il topo per overdose di isoflurano il giorno successivo all'esame ecografico (seguendo protocolli istituzionalmente approvati).
2. Aprire le cavità toraciche e addominali ed eseguire la perfusione con 1x PBS attraverso il ventricolo sinistro fino a quando i polmoni e il fegato diventano bianchi, seguendo la procedura descritta nella letteratura precedente²⁷.
3. Utilizzare un calibro digitale per misurare il diametro esterno dell'aorta infrarenale. Prelevare l'aorta addominale infrarenale al microscopio e conservare il vaso in paraformaldeide al 4% per 24-48 ore.
4. Rimuovere il tessuto connettivo e adiposo che circonda l'aorta addominale. Incorporare l'aorta nella paraffina per preparare le sezioni, tagliando le sezioni in fette di 3-5 μm come precedentemente descritto ^18,28.
5. Eseguire la colorazione ematossilina ed eosina (H&E), tricromica di Masson ed Elastic-Van Gieson (EVG) sulle fette deparaffinizzate utilizzando i rispettivi kit di colorazione secondo le istruzioni del produttore.
   1. Analizza la struttura dei vasi e l'infiammazione con la colorazione H&E, osserva la degradazione della matrice extracellulare (ECM) e le fibre di collagene con la colorazione tricromica di Masson ed esamina le fibre elastiche con la colorazione EVG.

Risultati

In questo studio sono stati inclusi e assegnati in modo casuale un totale di 24 topi: 12 nel gruppo Sham e 12 nel gruppo PPE + CaCl₂ , rispettivamente. Tutti i dati sono presentati come medie ± deviazioni standard, se non diversamente specificato. Il tempo medio di funzionamento è stato di 55,67 min ± 4,08 min. Non ci sono stati decessi intraoperatori o rotture di aneurisma e il tasso di sopravvivenza entro 21 giorni dall'intervento chirurgico è stato del 100%. Non sono st...

Discussione

La ricerca sui meccanismi molecolari dell'AAA richiede un modello animale stabile. Di conseguenza, numerosi modelli animali AAA sono stati stabiliti sin dal suo sviluppo iniziale da Economou et al. negli anni '60²⁹. Tra questi modelli, CaCl₂ è spesso impiegato nei roditori grazie alla sua economicità, semplicità tecnica e riproducibilità affidabile. Tuttavia, è stato dimostrato che l'infiltrazione perivascolare di CaCl₂ è instabile nell...

Materiali

Name	Company	Catalog Number	Comments
Anesthesia Machine	RWD	R550
Butorphanol	Jiangsu Hengrui Pharmaceutical Co., Ltd	220608BP	1ml: 1mg
C57BL/6JGpt Male Mice	GemPharmatech	N000013
Calcium Chloride	Sigma Aldrich	C4901	100 g
Carprofen	MCE	HY-B1227	100 mg
Chow Diet	Dossy Experimental Animals Co.Ltd
Digital Caliper	Greener	IP54
Ethanol	Jinhe Pharmaceutical Co.Ltd	539682	75%/500 mL
EVG Staining Kit	Solarbio	G1597
GraphPad Prism	Graphpad		Ver 9.0.0
H&E Staining Kit	Servicebio	G1076
Insulin Syringe	BD	2143420
Isoflurane	RWD	R510-22-4	100 mL
Masson Staining Kit	Servicebio	G1006
Normal Saline	Servicebio	G4702	500 mL
Paraformaldehyde	Biosharp	BL539A	4%/500 mL
PBS, 1x	Servicebio	G4202	500 mL
Porcine Pancreatic Elastase	Sigma Aldrich	E1250	100 mg
Povidine Iodine	Yongan Pharmaceutical Co.Ltd		5%/100 mg
Prolene Polypropylene Suture	Ethicon LLC	8709H
Rodent Ultrasound System	Fujifilm	Vevo 3100LT
Stereo Microscope	Olympus	SZ61
Ultrasonic Couplant	Keppler	KL-250	250 g