Um modelo de aneurisma de aorta abdominal de camundongo por infiltração periadventícia de cloreto de cálcio e elastase

Resumo

Este manuscrito apresenta um protocolo para estabelecer um modelo de aneurisma de aorta abdominal de camundongo usando cloreto de cálcio e elastase, combinando as vantagens dos métodos de modelagem anteriores. Este modelo pode ser utilizado para investigar os mecanismos fisiopatológicos subjacentes aos aneurismas da aorta abdominal.

Resumo

O aneurisma da aorta abdominal (AAA) é uma doença com risco de vida associada a altas taxas de mortalidade. É caracterizada pela dilatação permanente da aorta abdominal com aumento de pelo menos 50% no diâmetro arterial. Vários modelos animais de AAA foram introduzidos para imitar as alterações fisiopatológicas e estudar os mecanismos subjacentes do AAA. Entre esses modelos, os modelos AAA induzidos por cloreto de cálcio (CaCl₂) e elastase são comumente usados em camundongos. No entanto, esses métodos têm certas limitações. A perfusão tradicional de elastase pancreática suína intraluminal (PPE) está associada a alta dificuldade técnica e alta taxa de ruptura, enquanto a administração periadventícia de EPI produz resultados inconsistentes. Além disso, o modelo AAA induzido por CaCl₂ carece de características AAA humanas, como aterotrombose e ruptura de aneurisma. Portanto, a aplicação combinada de CaCl₂ e PPE tem sido proposta como uma abordagem para aumentar as taxas de sucesso e induzir maiores aumentos de diâmetro em modelos animais AAA. Este manuscrito apresenta um protocolo abrangente para estabelecer um modelo de AAA de camundongo por meio de infiltração periaórtica de PPE e CaCl₂ no segmento infrarrenal da aorta abdominal. Seguindo este protocolo, podemos atingir uma taxa de formação de AAA de aproximadamente 90% com simplicidade técnica e reprodutibilidade. Outros experimentos ultrassonográficos e histológicos confirmam que este modelo replica efetivamente as alterações morfológicas e patológicas observadas no AAA humano.

Introdução

O aneurisma da aorta abdominal (AAA) é definido como um aumento de diâmetro superior a 50% ou um diâmetro máximo da aorta superior a 3 cm na aorta abdominal. Essa condição representa uma ameaça significativa à vida, com uma taxa de mortalidade em torno de 90% na ruptura do aneurisma ^1,2,3. Atualmente, o reparo cirúrgico aberto e o reparo endovascular da aorta (EVAR) são as únicas intervenções disponíveis para pacientes com AAA ^4,5,6. No entanto, não há evidências suficientes para apoiar a eficácia dos tratamentos médicos na inibição da formação de aneurismas ou na diminuição da taxa de crescimento da aorta abdominal em pacientes que não têm indicações cirúrgicas⁷. No entanto, tratamentos inespecíficos, incluindo vigilância persistente do diâmetro máximo do aneurisma, controle da pressão arterial, terapia antiplaquetária e estatinas, são usados para reduzir ao máximo o risco de ruptura súbita do aneurisma e possíveis eventos cardiovasculares e neurológicos. Apesar disso, o papel das medicações antiplaquetárias e das estatinas na prevenção da ruptura do aneurisma permanece controverso e requer mais estudos 5,7,8,9,10.

Um modelo animal de AAA estável é vital para investigar a patogênese do AAA, e vários métodos foram introduzidos para estabelecer tal modelo 11,12,13. Atualmente, o cloreto de cálcio (CaCl₂), a elastase, a angiotensina II (Ang II), os xenoenxertos e os modelos transgênicos são utilizados no estabelecimento de modelos AAA de roedores 11,12,13. Dentre estes, a Ang II é a mais comumente utilizada em camundongos, enquanto a CaCl₂ e a elastase também são amplamente utilizadas em camundongos e ratos 11,12,13,14. O modelo de AAA induzido por Ang II é o único modelo animal capaz de induzir aterosclerose que se assemelha muito à patologia humana do AAA, que é simples e reprodutível e evita a necessidade de laparotomia 11,12,13. No entanto, ao contrário dos modelos induzidos por CaCl₂ ou elastase, a localização dos aneurismas induzidos por Ang II é incerta e freqüentemente observada na aorta descendente ou na aorta abdominal suprarrenal, com risco aumentado de ruptura 11,12,13,14. A taxa de incidência de aneurismas do modelo AAA induzido por Ang II em camundongos com deficiência genética pode chegar a 100%, enquanto apenas 39% dos camundongos C57BL/6 desenvolveram aneurismas, e o tempo e o custo econômico de obtenção de camundongos com deficiência genética são altos^13,15.

Inicialmente introduzido por Gertz et al., o CaCl₂ foi utilizado para induzir a formação de aneurisma na artéria carótida e posteriormente modificado por Chiou et al. para estabelecer um modelo de AAA em camundongos^16,17. No entanto, apesar de sua capacidade de induzir a quebra de fibras elásticas, inflamação dos vasos e degradação da matriz extracelular, o CaCl₂ carece de várias características do AAA humano, incluindo aterotrombose, trombo intraluminal (ILT) e ruptura do aneurisma^12,18. Além disso, a taxa de formação e a porcentagem de aumento do diâmetro da aplicação de CaCl₂ periaórtico permanecem instáveis^13,19. O modelo inicial de perfusão intraluminal de elastase pancreática suína (PPE) para indução de AAA foi desenvolvido por Anidjar et al. em 1990, seguido pelo relatório de Bhamidipati et al. sobre infiltração periadventícia de EPI em um modelo murino^20,21. Hoje em dia, a maioria dos modelos animais AAA induzidos por elastase utiliza o protocolo de Bhamidipati devido à sua viabilidade e natureza minimamente invasiva. No entanto, é importante notar que a taxa de incidência e o diâmetro máximo do AAA podem variar e geralmente são menores do que a perfusão intra-aórtica do EPP. Além disso, os aneurismas induzidos pela aplicação periaórtica de elastase apresentam tendência à cicatrização espontânea 11,12,20,21,22,23.

Para lidar com essas limitações, Tanaka et al. propuseram uma abordagem combinada envolvendo perfusão intraluminal de EPP e infiltração de CaCl₂ para estabelecer um modelo de AAA em ratos, que produziu resultados satisfatórios²⁴. Além disso, Zhu et al. demonstraram que o modelo PPE + CaCl₂ oferece vantagens como maiores taxas de sobrevida e aumento das taxas de formação de aneurisma em comparação com o grupo PPE único e o grupo PPE + BAPN²⁵. Essa abordagem combinada também exibe boa estabilidade e reprodutibilidade. Além disso, Bi et al. estabeleceram com sucesso um modelo AAA de coelho por meio da combinação de CaCl₂ periaórtico e incubação de elastase. A taxa média de dilatação foi de 65,3% ± 8,9% no dia 5, que aumentou ainda mais para 86,5% ± 28,7% no dia 15 e aumentou significativamente para 203,6% ± 39,1% no dia 30²⁶. No entanto, atualmente não há literatura existente relatando a indução de AAA em roedores pela combinação de CaCl₂ periaórtico e aplicação de elastase.

Este manuscrito apresenta um protocolo padrão para estabelecer um modelo de AAA murino por meio do uso combinado de CaCl₂ periadventício e infiltração de elastase. As seções subsequentes fornecem procedimentos cirúrgicos detalhados e apresentam resultados representativos do modelo AAA murino.

Protocolo

O protocolo de experimento animal estava em conformidade com o Guia do Instituto Nacional de Saúde para o Cuidado e Uso de Animais de Laboratório (NIH Pub No. 86/23, 1985) e foi aprovado pelo Comitê Institucional de Cuidados e Uso de Animais do Hospital da China Ocidental, Universidade de Sichuan (Número de Aprovação 202311300012). Camundongos machos C57 / B6J de oito a dez semanas de idade foram usados para este estudo. Os detalhes dos reagentes e equipamentos usados estão listados na Tabela de Materiais.

1. Preparo pré-operatório

1. Obtenha os animais e alimente-os com uma dieta normal de ração com água limpa em condições normais (temperatura 24 °C, umidade 40%-50%, ciclo claro-escuro de 12 horas).
2. Corte um algodão em tiras de 40 mm x 4 mm e esterilize-o junto com tesouras, pinças e outros equipamentos cirúrgicos.
3. Coloque o animal na câmara de indução da máquina de anestesia e use isoflurano a 3% a 3,5% para induzir rapidamente a anestesia (seguindo protocolos aprovados institucionalmente). Além disso, prescreva butorfanol (1 mg / kg, injeção intramuscular) como medicamento analgesia preventivo.
   1. Remova o camundongo da câmara quando ele não responder mais à estimulação da dor, coloque uma máscara no camundongo e mantenha a profundidade da anestesia com 1% -1,5% de isoflurano. Monitore a frequência respiratória e a profundidade a cada 5-10 minutos.
4. Coloque o mouse em decúbito dorsal na almofada de aquecimento, use fita adesiva para imobilizar os membros e aplique pomada para os olhos para evitar o ressecamento.
5. Use um barbeador elétrico ou loção depilatória para remover completamente os pelos da região abdominal e, em seguida, desinfete essa área com cotonetes embebidos em iodopovidona e etanol em movimentos circulares pelo menos três vezes.

2. Procedimento cirúrgico

1. Coloque o mouse sob um estereomicroscópio. Use uma tesoura para fazer uma incisão longitudinal de aproximadamente 2-2,5 cm ao longo da linha média do abdômen.
2. Entre na cavidade peritoneal através da linha alba (abordagem transabdominal), coloque um afastador para expor a cavidade peritoneal e embale os intestinos e o cólon na metade direita do abdômen usando gaze embebida em solução salina normal.
3. Realize a separação romba do tecido conjuntivo e adiposo adjacente à aorta abdominal infrarrenal e veia cava inferior (VCI) usando fórceps e cotonetes. Dissecar suavemente a aorta abdominal e expor o espaço entre a aorta abdominal e o psoas maior sobrejacente, conforme mencionado anteriormente²⁵.
   1. Insira as tiras de algodão esterilizadas nessa abertura, tomando muito cuidado para não danificar a artéria ou veia lombar. Não é necessário isolar a aorta abdominal da VCI.
4. Mergulhe a bola de algodão com CaCl_{0,9 M 2} e coloque-a sobre a adventícia da aorta abdominal por 15 min. Use gaze esterilizada para cobrir a cavidade abdominal durante o processo de infiltração.
5. Remova suavemente a bola de algodão embebida em CaCl₂ e lave o segmento infiltrado com solução salina a 0,9%.
6. Dilua a elastase a 2 mg/mL (8 U/mL) com ddH₂O. Use uma seringa de insulina para aplicar 50 μL de elastase diluída no segmento infrarrenal da aorta abdominal e enrole as tiras de algodão para cobrir a aorta abdominal e a VCI. Use gaze esterilizada para cobrir a cavidade abdominal durante o processo de infiltração. No grupo Sham, use solução salina normal a 0,9% para substituir CaCl₂ e PPE.
7. 15 minutos depois, remova cuidadosamente as tiras de gaze e algodão. Mova os intestinos e o cólon de volta às suas posições originais, cubra a aorta tratada com o mesentério e umedeça os intestinos para evitar a adesão.
8. Feche a camada muscular e a pele separadamente com sutura de polipropileno inabsorvível 6-0. Desinfetar a área cirúrgica com iodopovidona e etanol.
9. Coloque o mouse em uma almofada de aquecimento e monitore seu estado respiratório até que ele recupere a consciência. Registre o tempo de operação e o número de animais experimentais. Prescrever carprofeno (5 mg/kg, por via subcutânea) como analgesia pós-operatória por pelo menos 3 dias após a cirurgia, de acordo com a recomendação veterinária.

3. Exame de ultrassom

1. 21 dias após a cirurgia, realizar um exame de ultrassom para avaliar a taxa de incidência de AAA.
2. Anestesiar o rato (seguindo os protocolos aprovados institucionalmente) e remover os pelos abdominais conforme descrito anteriormente.
3. Coloque o mouse na almofada de aquecimento da máquina de ultrassom para roedores. Aplique acoplante ultrassônico no abdômen e meça o diâmetro máximo do aneurisma e o diâmetro do segmento normal da aorta abdominal.
   1. Calcule a porcentagem aumentada da aorta abdominal infrarrenal. O critério para a formação bem-sucedida do AAA é que o diâmetro máximo do AAA tenha aumentado 50% ou mais em comparação com o diâmetro do segmento normal da aorta abdominal infrarrenal.
4. Use um guardanapo para limpar o acoplante ultrassônico restante após o exame e coloque o mouse na almofada de aquecimento até que esteja totalmente recuperado.

4. Colheita da aorta abdominal e experimentos patológicos

1. Sacrifique o camundongo por overdose de isoflurano no dia seguinte ao exame de ultrassom (seguindo protocolos aprovados institucionalmente).
2. Abrir as cavidades torácica e abdominal e realizar perfusão com 1x PBS através do ventrículo esquerdo até que os pulmões e o fígado fiquem brancos, seguindo o procedimento descrito na literatura anterior²⁷.
3. Use um paquímetro digital para medir o diâmetro externo da aorta infrarrenal. Colher a aorta abdominal infrarrenal em estereomicroscópio e armazenar o vaso em paraformaldeído a 4% por 24-48 h.
4. Remova o tecido conjuntivo e adiposo ao redor da aorta abdominal. Incorporar a aorta em parafina para preparar os cortes, cortando-os em fatias de 3-5 μm, conforme descrito anteriormente^18,28.
5. Realize a coloração de hematoxilina e eosina (H&E), tricrômico de Masson e Elastic-Van Gieson (EVG) nas fatias desparafinizadas usando os respectivos kits de coloração de acordo com as instruções do fabricante.
   1. Analise a estrutura do vaso e a inflamação com a coloração H&E, observe a degradação da matriz extracelular (MEC) e as fibras colágenas com a coloração tricrômica de Masson e examine as fibras elásticas com a coloração EVG.

Resultados

Neste estudo, um total de 24 camundongos foram incluídos e distribuídos aleatoriamente: 12 no grupo Sham e 12 no grupo PPE + CaCl₂ , respectivamente. Todos os dados são apresentados como médias ± desvios-padrão, salvo indicação em contrário. O tempo médio de operação foi de 55,67 min ± 4,08 min. Não houve óbitos intraoperatórios ou rupturas de aneurismas, e a sobrevida em 21 dias após a cirurgia foi de 100%. Não foram observadas aderências intestinais graves...

Discussão

A pesquisa sobre os mecanismos moleculares do AAA requer um modelo animal estável. Consequentemente, vários modelos animais AAA foram estabelecidos desde seu desenvolvimento inicial por Economou et al. na década de 1960²⁹. Dentre esses modelos, o CaCl₂ é frequentemente empregado em roedores devido à sua relação custo-benefício, simplicidade técnica e reprodutibilidade confiável. No entanto, a infiltração perivascular de CaCl₂ demo...

Materiais

Name	Company	Catalog Number	Comments
Anesthesia Machine	RWD	R550
Butorphanol	Jiangsu Hengrui Pharmaceutical Co., Ltd	220608BP	1ml: 1mg
C57BL/6JGpt Male Mice	GemPharmatech	N000013
Calcium Chloride	Sigma Aldrich	C4901	100 g
Carprofen	MCE	HY-B1227	100 mg
Chow Diet	Dossy Experimental Animals Co.Ltd
Digital Caliper	Greener	IP54
Ethanol	Jinhe Pharmaceutical Co.Ltd	539682	75%/500 mL
EVG Staining Kit	Solarbio	G1597
GraphPad Prism	Graphpad		Ver 9.0.0
H&E Staining Kit	Servicebio	G1076
Insulin Syringe	BD	2143420
Isoflurane	RWD	R510-22-4	100 mL
Masson Staining Kit	Servicebio	G1006
Normal Saline	Servicebio	G4702	500 mL
Paraformaldehyde	Biosharp	BL539A	4%/500 mL
PBS, 1x	Servicebio	G4202	500 mL
Porcine Pancreatic Elastase	Sigma Aldrich	E1250	100 mg
Povidine Iodine	Yongan Pharmaceutical Co.Ltd		5%/100 mg
Prolene Polypropylene Suture	Ethicon LLC	8709H
Rodent Ultrasound System	Fujifilm	Vevo 3100LT
Stereo Microscope	Olympus	SZ61
Ultrasonic Couplant	Keppler	KL-250	250 g