利用微流控电喷雾技术制备具有不同金属离子的交联海藻酸钠微球

摘要

该方案描述了使用用于药物载体设计的微流体装置制备与不同金属离子交联的海藻酸钠微球。还研究了这些微球的抗菌特性和缓慢的药物释放。

摘要

微球是微米大小的颗粒，可以通过物理封装或吸附将药物加载并逐渐释放到聚合物表面和内部。在生物医学领域，水凝胶微球作为药物载体的应用已被广泛研究，因为它们能够减少给药频率、最大限度地减少副作用并提高患者依从性。海藻酸钠 （ALG） 是一种天然存在的线性多糖，具有三个主链糖苷键。聚合物的每个部分都存在两个辅助羟基，它们具有醇羟基部分的特性。合成的 ALG 单元可以与金属离子发生化学交联反应，形成聚合物堆栈的交联网络结构，最终形成水凝胶。水凝胶微球可以使用涉及 ALG 的离子交联特性的简单工艺制备。在这项研究中，我们使用微流体电沉积策略制备了基于 ALG 的水凝胶微球 （ALGMS）。由于精确控制了微流体电喷雾流，制备的水凝胶微球尺寸均匀且分散良好。采用微流控和高电场相结合的微流控电喷雾技术制备与不同金属离子交联的 ALGMS，并研究了其抗菌性能、缓慢药物释放能力和生物相容性。该技术有望应用于高级药物开发和生产。

引言

药物递送系统是生物组织工程领域的研究热点，旨在提高药物递送效率和疗效，减少不良反应和副作用¹.在这些系统中，水凝胶微球具有良好的生物相容性、可调的机械性能和功能性可塑性，是最常用的药物加载和递送载体之一²。它们可用于药物的缓释和受控释放，为药物提供良好的保护作用，避免或尽量减少药物在其他组织中的非特异性作用，并将药物靶向递送到特定的组织结构³。因此，水凝胶微球已成为一种新的高效药物递送系统，该领域的研究逐渐显现⁴.

水凝胶微球通常由可生物降解的材料合成，包括多糖、蛋白质和天然聚合物⁵。其中，ALG 是从海洋褐藻中提取的生物相容性、可生物降解的多糖⁶。其分子链包含游离羟基和羧基，可与大多数二价或多价阳离子交联，形成具有三维网络的水不溶性水凝胶结构⁵。ALG 形成的水凝胶微球可以在中性和碱性溶液中转化为带负电荷的聚电解质。负电荷之间的这种排斥导致微球膨胀，从而释放封装的活性成分或药物。这些特性导致人们认为 ALG 微球是广泛用于载药和控释的有前途的药物载体⁷。

制备水凝胶微球的方法多种多样。传统的 ALGMS 制备方法通常包括 sol-gel 法或 emulsion-sol 法。这些方法涉及沉淀、共沉淀和凝胶化反应等步骤，以获得目标微球⁸。近年来，随着微流控技术的不断发展，微流控电喷雾法逐渐成为一种高效、精密的微球制备方法⁹.该方法利用微流体技术，通过超细喷嘴电喷涂聚合物溶液，在随后的固化或交联过程中形成微米级的液滴和微球¹⁰。与传统方法相比，微流体电喷雾通过调整溶液流速、电压和细喷嘴尺寸等参数来精确控制微球粒径和形态¹¹。它还能够高速连续制备微球，提高制备效率并保持温和的反应条件。此外，ALGMS 可以制备成具有多种功能，例如控释药物和负载催化剂，使其易于在各个领域应用。

在这里，我们提出了一种使用微流体电喷雾法制备 ALG 微球的方案。该过程包括将 ALG 溶液通过微流体装置并对其进行电喷雾。将所得液滴收集在含有不同金属离子（Ca²⁺、Cu²⁺、Zn²⁺ 和 Fe³⁺）的溶液中，以引发交联反应。该反应提高了微球的稳定性和粘附性，并赋予它们不同的功能。这种方法易于执行，并且合成的微球在其形态上表现出良好的尺寸均匀性。此外，我们还研究了它们的抗菌特性、缓慢的药物释放能力和生物相容性。该协议将有助于进一步的药物开发和生产。

研究方案

实验中使用的血液来自体重 20-25 g、大约 7 周龄的 SPF 级 BALB/c 雌性小鼠。浙江树仁学院动物实验伦理委员会批准了所有动物护理和实验程序。

1. 溶液制备

1. 称取 ALG 并在 50 °C 的水浴中搅拌，溶于超纯水中，得到 2% ALG 溶液。
2. 在超纯水中分别制备含有 5%（或摩尔质量浓度为 0.3 M）的 CaCl₂、FeCl₃、ZnSO₄ 和 CuSO₄ 溶液的质量分数。将每种溶液分别倒入收集皿中。

2. 微流体电喷雾装置

1. 取玻璃毛细管，将其放在喷灯火焰上软化，然后将其拉伸成各种直径 （50 μm-500 μm）。用玻璃切割机切掉精细部分，然后用优质碳化硅砂纸轻轻抛光喷嘴端口。清洁后，将毛细管的粗端连接到长管上，将管子的另一端连接到分配针和 5 mL 注射器（补充图 1）。
   注意：玻璃管切口的锋利边缘很难插入软管;因此，在火焰边缘处，中断应呈圆角。
2. 将注射器连接到微流体注射泵上，并将毛细管的一端连接到支架上。将高压电源的红色高压端夹连接到注射器的分配针头上，将银色夹子放入收集液中。这种配置创建了一个简单的微流体电喷雾装置（图 1A）。
   注意：将毛细管垂直于工作台放置。

3. ALG 微球制备

1. 将含有不同金属离子的单独收集皿直接放在毛细管下方。打开微流体注射泵并选择 Fast Forward 以使用 ALG 灌注管，然后设置适当的流速 （2 mL/h）。
2. 打开高压电源开关并转动旋钮以设置合适的电压 （5-7 kV）。
3. 向每个 90 mm 培养皿中加入 20 mL 溶液，以收集 ALG 微球以形成与不同金属离子交联的 ALGMS（图 1B）。
4. ALG 在电场和重力的作用下，在几秒钟内在不同的离子收集溶液中形成微球。用消毒的移液管吸出微球，并将其转移到单独的 1.5 mL 离心管中，以获得 Zn²⁺、Ca²⁺、Cu²⁺和 Fe³⁺ -ALG 水凝胶微球（图 1C）。标记 Zn-ALGMS、Ca-ALGMS、Cu-ALGMS 和 Fe-ALGMS 管。
   注：通过调整电压、针尖直径、流速和溶液浓度等参数，可以获得不同直径的微球。
5. 取少量制备好的微球，在 PBS 中尽可能均匀地分散，并将它们置于显微镜下进行观察。
6. 在同一批次的微球中随机选取 10 个观察场，将需要测量的图像导入 ImageJ 软件，将图像转换为合适的灰度模式，并使用阈值分割技术准确定义目标颗粒的面积并启动分析颗粒的功能，以便 ImageJ 能够识别和测量目标颗粒。获取微球的数据，然后将数据导入 Origin 软件进行分析和粒度映射。

4. 抗菌性能测试

1. 使用液体 Luria-Bertani （LB） 培养基制备 5 mL 初始细菌浊度为 0.2 mcF 的 金黄色葡萄球 菌（金黄色葡萄球菌）和 大肠杆菌 （大肠杆菌）悬浮液。
2. 将 10 mL 每种细菌溶液添加到 4 个 15 mL 无菌离心管中。然后，向每个试管中加入 0.5 mL 的 Zn-ALGMS、Ca-ALGMS、Cu-ALGMS 和 Fe-ALGMS ALG，并将它们置于 37 °C 和 200 rpm 的恒温振荡器中 12 小时。向对照组中加入等量的盐水。
3. 用无菌水将每种细菌溶液稀释至 10⁵ 倍。使用无菌玻璃珠将 200 μL 细菌溶液铺布在 LB 固体培养基上。
4. 将溶液快速均匀地铺在包衣板上，避免在同一区域来回涂抹。然后，将板置于 37 °C 的培养箱中 12 小时。观察不同群体的菌落。
   注意：所有无菌程序都应在酒精灯附近进行。对微生物培养容器、接种器具和培养基进行消毒。

5. 药物释放测试

1. 为了评估不同微球的药物释放能力，使用牛血清白蛋白 （BSA） 作为负载模型药物。将 500 μL 的每个微球（Ca-ALGMS、Cu-ALGMS、Zn-ALGMS 和 Fe-ALGMS）添加到 1 mg/mL BSA 悬浮液中 24 小时。
2. 对于药物释放测定，将每个饱和样品加入 5.0 M 磷酸盐缓冲盐水 （PBS;pH 7.4） 中，然后在 37 °C 下搅拌 15 分钟，并以 80 rpm 的速度连续振荡。
3. 使用 100 μL 溶液，并在 1、3、6、12、24、36 和 48 小时用新鲜的培养基更换培养基。
4. 按照制造商的说明，使用 BCA 试剂盒在特定时间定量上清液蛋白浓度。经酶标定量测定释放的药物，得到相应的吸光度，并按标准曲线将实测值转换为实际药物浓度。使用以下公式计算药物释放速率：
   药物释放百分比 = （特定时间点释放的药物浓度 / 初始药物浓度） x 100%
5. 定期从每个孔中取出等体积的 PBS，并用等体积的新鲜培养基替换。

6. 溶血试验

1. 将制备好的 Ca-ALGMS、Cu-ALGMS、Zn-ALGMS 和 Fe-ALGMS 放入 PBS 中，并在 37 °C 下孵育 24 小时以配制孵育溶液。
2. 通过眼静脉切开术从健康的 BALB/c 小鼠获得全血，收集在含有柠檬酸钠的抗凝管中。涡旋并以 1509 x g 离心 15 分钟以获得红细胞。
3. 用 PBS 冲洗红细胞 2 次至 3 次，并用 PBS 制备 10% 红细胞溶液。
4. 各种 ALGMS 的制备：实验组每个微球 500 μL，阳性对照组 1 mL 超纯水 （ddH₂O），阴性对照组 1 mL PBS 溶液，每个与 20 μL 血细胞溶液混合。
5. 将样品在 37 °C 下孵育 4 小时，以 1509 x g 离心，15 分钟。将上清液放在一边，并在溶血后拍摄每组中的红细胞。
6. 取阳性对照组溶血率为100%，阴性对照组为0%。测量每组中上清液的吸光度值，并使用以下公式计算溶血速率：
   溶血 （%） =（每组上清液的吸光度值 -
   单独蒸馏水的吸光度值）/（阳性对照组的吸光度值 - 单独蒸馏水的吸光度值）x 100

7. 细胞生物相容性试验

1. 用 PBS 洗涤不同的 ALGMS 2 次，放入 5 mL 培养皿中 15 分钟，弃去上清液。
2. 在含有 10% FBS 的完全培养基 （DMEM） 中分别加入 0.2 mL 的不同 ALGMS，在 37 °C 下孵育 24 小时，并过滤溶液以获得渗滤液。
3. 在 24 孔板中将 NIH3T3 细胞培养至约 70% 的细胞密度，用微球浸出溶液处理 NIH3T3 细胞，并继续用完全培养基再培养 24 小时。
4. 取出细胞培养基并用 PBS 洗涤细胞。
5. 使用钙黄绿素-AM/PI 测定法评估细胞活力。取 2.5 μL 钙黄绿素-AM 溶液 （4 mM） 和 12.5 μL PI 溶液 （2 mM），将它们加入 5 mL 的 1x PBS 中并充分混合，以获得含有 2 μM 钙黄绿素-AM 和 5 μM PI 的工作溶液。
6. 将工作溶液以每孔 500 μL 的浓度添加到先前接种的细胞培养板中，在 37 °C 下避光孵育 15 分钟，并在倒置荧光显微镜下观察和拍照。为每个组设置三个仿行。
7. 根据以下公式计算细胞活力：
   细胞活力 （%） = 活细胞数 / （活细胞数 + 死细胞数）

结果

与不同金属离子交联的 ALGMS 的表征
Ca-ALGMS、Cu-ALGMS、Zn-ALGMS 和 Fe-ALGMS 的光学形貌如图 2 所示，表现出良好的球形度、光滑的表面、均匀的粒径分布（补充图 2）和优异的单分散性。我们进一步使用扫描电子显微镜 （SEM） 和能量色散光谱 （EDS） 分析进行了显微表征。如图 3 所示，微球通常是球形的，具有明确的圆度。Zn-ALGMS...

讨论

在该协议中，我们提出了一种基于微流体电喷雾技术制备 ALGMS 的方法。该方法操作简单，可产生大量圆度均匀、直径可控的微球。这种方法为研究人员提供了便利，可以促进水凝胶微球的研究和应用。此外，通过与不同的金属离子交联，ALGMS 的稳定性和生物活性得到提高。在抗菌实验中，Cu-ALGMS 和 Zn-ALGMS 表现出显著的细菌抑制作用。

水凝胶微球是具有出色可塑性的柔性微结...

材料

Name	Company	Catalog Number	Comments
120 mesh screen	Solarbio,China	YA0946
Alcohol burner	Solarbio,China	YA2320
BALB/c mice	Wukong Biotechnology,China
Bicinchoninic Acid Assay reagent	Meilunbio,China	MA0082
Bovine Serum Albumin	Lablead,China	9048-46-8
CaCl2  powder	Aladdin,China	10043-52-4
Calcein-AM/PI	Biosharp,China	BL130A
Centrifuge tubes	Corning,America	430290
CuSO4  powder	Jnxinyuehuagong,China	7758-99-8
DMEM	Gibicol,China	C11995500BT
FeCl3  powder	Aladdin,China	7705-08-0
Fetal Bovine Serum	HAKATA,China	HN-FBS
Glass tubes	Sartorius,Germany	CC0028
Light microscopy	Evidentscientific,Japan	BX53(LED)
Microfluidic syringe pump	Longerpump,England	LSP01-3A
NIH3T3	HyGyte,China	TCM-C752
Petri dish	Thermofisher,America	150464
Phosphate buffer saline	Thermofisher,America	3002
Scanning electron microscope	Thermofisher,America	Axia ChemiSEM
Sodium alginate powder	Bjbalb,China	Y13095
ZnSO4 powder	Jnxinyuehuagong,China	7733-02-0