Preparação de microesferas de alginato de sódio reticulado com diferentes íons metálicos usando a tecnologia de eletrospray microfluídico

Resumo

O protocolo descreve a preparação de microesferas de alginato de sódio reticuladas com diferentes íons metálicos usando um dispositivo microfluídico para o projeto de transportadores de medicamentos. As propriedades antimicrobianas e a liberação lenta do fármaco dessas microesferas também foram investigadas.

Resumo

Microesferas são partículas do tamanho de micrômetros que podem carregar e liberar gradualmente medicamentos por meio de encapsulamento físico ou adsorção na superfície e dentro dos polímeros. No campo da biomedicina, as microesferas de hidrogel têm sido extensivamente estudadas para sua aplicação como transportadores de medicamentos devido à sua capacidade de reduzir a frequência de administração de medicamentos, minimizar os efeitos colaterais e melhorar a adesão do paciente. O alginato de sódio (ALG) é um polissacarídeo linear natural com três ligações glicosídicas de espinha dorsal. Existem dois grupos hidroxila auxiliares presentes em cada uma das porções do polímero, que possuem as características de uma porção hidroxila alcoólica. As unidades ALG sintéticas podem sofrer reações químicas de reticulação com íons metálicos, formando uma estrutura de rede reticulada de pilhas de polímeros, formando um hidrogel. As microesferas de hidrogel podem ser preparadas usando um processo simples envolvendo as propriedades de reticulação iônica do ALG. Neste estudo, preparamos microesferas de hidrogel à base de ALG (ALGMS) usando uma estratégia de eletrodeposição microfluídica. As microesferas de hidrogel preparadas eram de tamanho uniforme e bem dispersas, devido ao controle preciso do fluxo de eletrospray microfluídico. ALGMS reticulados com diferentes íons metálicos foram preparados usando uma técnica de eletrospray microfluídico combinando campo microfluídico e alto campo elétrico, e suas propriedades antimicrobianas, capacidade de liberação lenta de drogas e biocompatibilidade foram investigadas. Essa tecnologia é promissora para aplicação no desenvolvimento e produção de medicamentos avançados.

Introdução

Os sistemas de liberação de medicamentos são um hotspot de pesquisa no campo da engenharia de biotecidos, com o objetivo de melhorar a eficiência e eficácia da administração de medicamentos e reduzir reações adversas e efeitos colaterais¹. Dentre esses sistemas, as microesferas de hidrogel, caracterizadas por boa biocompatibilidade, propriedades mecânicas sintonizáveis e plasticidade funcional, são um dos veículos mais comumente utilizados para carregamento e liberação de medicamentos². Eles podem ser usados para liberação lenta e controlada de medicamentos, fornecer bons efeitos protetores para medicamentos, evitar ou minimizar efeitos inespecíficos de medicamentos em outros tecidos e direcionar a entrega de medicamentos a estruturas teciduais específicas³. Portanto, as microesferas de hidrogel tornaram-se um novo e eficiente sistema de liberação de medicamentos, com pesquisas nesse campo surgindo gradualmente⁴.

As microesferas de hidrogel são tipicamente sintetizadas a partir de materiais biodegradáveis, incluindo polissacarídeos, proteínas e polímeros naturais⁵. Entre eles, o ALG é um polissacarídeo biocompatível e biodegradável extraído de algas marrons marinhas⁶. Sua cadeia molecular contém grupos hidroxila e carboxila livres que podem se reticular com a maioria dos cátions divalentes ou multivalentes para formar uma estrutura de hidrogel insolúvel em água com uma rede tridimensional⁵. As microesferas de hidrogel formadas por ALG podem ser convertidas em polieletrólitos carregados negativamente em soluções neutras e alcalinas. Essa repulsão entre cargas negativas faz com que as microesferas inchem, permitindo a liberação do ingrediente ativo encapsulado ou medicamento. Essas propriedades levaram à consideração das microesferas de ALG como promissoras carreadoras de fármacos amplamente utilizadas para carga de fármacos e liberação controlada⁷.

Existem vários métodos para a preparação de microesferas de hidrogel. Os métodos tradicionais de preparação do ALGMS geralmente incluem o método sol-gel ou o método emulsão-sol. Esses métodos envolvem etapas como precipitação, co-precipitação e reações de gelificação para obter as microesferas alvo⁸. Nos últimos anos, com o desenvolvimento contínuo da tecnologia microfluídica, o método de eletrospray microfluídico tornou-se gradualmente um método de preparação de microesferas eficiente e preciso⁹. Este método utiliza tecnologia microfluídica para eletropulverizar uma solução de polímero através de um bico microfino para formar gotículas e microesferas do tamanho de micrômetros durante o processo subsequente de cura ou reticulação¹⁰. Em comparação com o método tradicional, o eletrospray microfluídico oferece controle preciso do tamanho e morfologia das partículas da microesfera, ajustando parâmetros como taxa de fluxo da solução, tensão e tamanho fino do bico¹¹. Ele também permite a preparação contínua de microesferas em alta velocidade, melhorando a eficiência da preparação e mantendo condições de reação suaves. Além disso, o ALGMS pode ser preparado para possuir várias funções, como medicamentos de liberação controlada e catalisadores carregados, possibilitando sua fácil aplicação em diversos campos.

Aqui, apresentamos um protocolo para a preparação de microesferas ALG usando o método de eletrospray microfluídico. O processo envolve passar uma solução ALG por um dispositivo microfluídico e submetê-la a eletrospray. As gotículas resultantes foram coletadas na solução contendo diferentes íons metálicos (Ca²⁺,²⁺, Zn²⁺ e Fe³⁺) para iniciar a reação de reticulação. Essa reação melhora a estabilidade e a adesão das microesferas e as dota de diferentes funcionalidades. Este método é de fácil execução, e as microesferas sintetizadas exibem boa uniformidade de tamanho em sua morfologia. Além disso, investigamos suas propriedades antimicrobianas, capacidade de liberação lenta de medicamentos e biocompatibilidade. Este protocolo será útil para o desenvolvimento e produção de medicamentos.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocolo

O sangue utilizado nos experimentos foi obtido de camundongos fêmeas BALB/c de grau SPF, pesando 20-25 g e com aproximadamente 7 semanas de idade. O Comitê de Ética em Experimentação Animal do Zhejiang Shuren College aprovou todos os procedimentos experimentais e de cuidados com animais.

1. Preparação da solução

1. Pese ALG e dissolva em água ultrapura mexendo em banho-maria a 50 °C para obter uma solução ALG a 2%.
2. Prepare separadamente a fração de massa com soluções de 5% (ou concentração de massa molar é 0,3 M) de CaCl₂, FeCl₃, ZnSO₄ e CuSO₄ em água ultrapura. Despeje cada solução separadamente em um prato coletor.

2. Dispositivo de eletrospray microfluídico

1. Pegue um tubo capilar de vidro e coloque-o sobre uma chama de maçarico para amolecer e, em seguida, estique-o em vários diâmetros (50 μm-500 μm). Corte as partes finas com um cortador de vidro e polir suavemente a porta da ponta com uma lixa de carboneto de silício de alta qualidade. Após a limpeza, conecte a extremidade grossa do tubo capilar a um tubo longo e a outra extremidade do tubo a uma agulha dispensadora e uma seringa de 5 mL (Figura Suplementar 1).
   NOTA: As bordas afiadas dos cortes do tubo de vidro são difíceis de inserir na mangueira; assim, a quebra deve ser arredondada na borda da chama.
2. Conecte a seringa à bomba de seringa microfluídica e ao tubo capilar em uma extremidade do suporte. Conecte o clipe final vermelho de alta tensão da fonte de alimentação de alta tensão à agulha dispensadora da seringa e coloque o clipe prateado no fluido de coleta. Essa configuração cria um dispositivo de eletrospray microfluídico simples (Figura 1A).
   NOTA: Coloque o tubo capilar perpendicular à mesa.

3. Preparação de microesferas ALG

1. Coloque os pratos de coleta seletiva contendo diferentes íons metálicos diretamente sob o tubo capilar. Ligue a bomba de seringa microfluídica e selecione Fast Forward para preparar o tubo com o ALG e, em seguida, defina a taxa de fluxo apropriada (2 mL/h).
2. Ligue o interruptor de alimentação de alta tensão e gire o botão para definir a tensão apropriada (5-7 kV).
3. Adicione 20 mL de solução a cada uma das placas de Petri de 90 mm para coletar microesferas ALG para formar ALGMS reticulados com diferentes íons metálicos (Figura 1B).
4. O ALG forma microesferas sob a ação do campo elétrico e da gravidade em diferentes soluções coletoras de íons em poucos segundos. Aspire as microesferas com uma pipeta esterilizada e transfira-as para tubos de centrífuga individuais de 1,5 mL para obter microesferas de hidrogel Zn²⁺, Ca²⁺,²⁺ e Fe³⁺ -ALG (Figura 1C). Rotule os tubos Zn-ALGMS, Ca-ALGMS,-ALGMS e Fe-ALGMS.
   NOTA: Microesferas de diferentes diâmetros podem ser obtidas ajustando parâmetros como tensão, diâmetro da ponta, taxa de fluxo e concentração da solução.
5. Pegue uma pequena quantidade das microesferas preparadas, disperse-as o mais uniformemente possível em PBS e coloque-as sob um microscópio para visualização.
6. Selecione aleatoriamente 10 campos de observação no mesmo lote de microesferas, importe as imagens a serem medidas para o software ImageJ, converta as imagens para o modo de escala de cinza apropriado e use a tecnologia de segmentação de limite para definir com precisão a área das partículas alvo e iniciar a função de análise das partículas para que o ImageJ possa identificar e medir as partículas alvo. Obtenha dados sobre as microesferas e, em seguida, importe os dados para o software Origin para análise e mapeamento de tamanho de partícula.

4. Teste de desempenho antimicrobiano

1. Prepare suspensões de 5 mL de Staphylococcus aureus (S. aureus) e Escherichia coli (E. coli) com uma turbidez bacteriana inicial de 0,2 mcF usando um meio líquido Luria-Bertani (LB).
2. Adicione 10 mL de cada solução bacteriana a 4 tubos de centrífuga estéreis individuais de 15 mL. Em seguida, adicione 0,5 mL de Zn-ALGMS, Ca-ALGMS,-ALGMS e Fe-ALGMS ALG a cada tubo e coloque-os em um agitador de temperatura constante a 37 ° C e 200 rpm por 12 h. Adicione uma quantidade igual de solução salina ao grupo de controle.
3. Dilua cada solução bacteriana para 10⁵ vezes com água estéril. Use uma esfera de vidro estéril para espalhar 200 μL de solução bacteriana em um meio sólido LB.
4. Espalhe a solução de forma rápida e uniforme na placa de revestimento, evitando idas e vindas na mesma área. Em seguida, coloque as placas em uma incubadora a 37 °C por 12 h. Observe as colônias de diferentes grupos.
   NOTA: Todos os procedimentos assépticos devem ser realizados perto de uma lâmpada de álcool. Esterilize vasos de cultura microbiana, utensílios de inoculação e meios de cultura.

5. Teste de liberação de drogas

1. Para avaliar a capacidade de liberação de diferentes microesferas, use albumina de soro bovino (BSA) como um medicamento modelo carregado. Adicione 500 μL de cada microesfera (Ca-ALGMS,-ALGMS, Zn-ALGMS e Fe-ALGMS) a 1 mg/mL de suspensão BSA por 24 h.
2. Para o ensaio de liberação do fármaco, adicione cada amostra saturada a 5,0 M de solução salina tamponada com fosfato (PBS; pH 7,4), seguida de agitação por 15 min a 37 °C com agitação contínua a 80 rpm.
3. Use 100 μL da solução e substitua o meio por um novo em 1, 3, 6, 12, 24, 36 e 48 h.
4. Quantifique as concentrações de proteína sobrenadante em momentos específicos usando um kit de BCA de acordo com as instruções do fabricante. Meça quantitativamente o medicamento liberado pelo marcador enzimático para obter a absorbância correspondente e converta o valor medido em concentração real do medicamento de acordo com a curva padrão. Calcule a taxa de liberação do medicamento usando a seguinte fórmula:
   Porcentagem de liberação do medicamento = (concentração do medicamento liberado em um ponto de tempo específico / concentração inicial do medicamento) x 100%
5. Em intervalos regulares, remova um volume igual de PBS de cada poço e substitua-o por um volume igual de meio fresco.

6. Teste de hemólise

1. Colocar os Ca-ALGMS,-ALGMS, Zn-ALGMS e Fe-ALGMS preparados em PBS e incubá-los a 37 °C durante 24 h para formular a solução de incubação.
2. Obter sangue total de camundongos BALB/c saudáveis por flebotomia ocular, coletado em tubos anticoagulados contendo citrato de sódio. Vórtice e centrifugue a 1509 x g por 15 min para obter glóbulos vermelhos.
3. Lave os glóbulos vermelhos 2x-3x com PBS e prepare uma solução de glóbulos vermelhos a 10% com PBS.
4. Preparação de vários ALGMS: Pegue 500 μL de cada microesfera para o grupo experimental, 1 mL de água ultrapura (ddH₂O) para o grupo de controle positivo e 1 mL de solução de PBS para o grupo de controle negativo e misture cada um com 20 μL de solução de células sanguíneas.
5. Incubar as amostras a 37 °C durante 4 h, centrifugar a 1509 x g, 15 min. Mantenha o sobrenadante de lado e fotografe os glóbulos vermelhos em cada grupo após a hemólise.
6. Considere a taxa de hemólise do grupo de controle positivo como 100% e o grupo de controle negativo como 0%. Medir os valores de absorvância dos sobrenadantes em cada grupo e calcular a taxa de hemólise utilizando a fórmula:
   Hemólise (%) = (Valores de absorbância dos sobrenadantes de cada grupo-
   Valores de absorvância da água destilada isoladamente) / (Valores de absorvância do grupo de controle positivo - Valores de absorbância da água destilada isoladamente) x 100

7. Teste de citobiocompatibilidade

1. Lave os diferentes ALGMS 2x com PBS e coloque em uma placa de Petri de 5 mL por 15 min e descarte o sobrenadante.
2. Adicione separadamente diferentes ALGMS a 0,2 mL em meio de cultura completo (DMEM) contendo 10% de FBS, incube a 37 ° C por 24 h e filtre a solução para obter o lixiviado.
3. Cultive células NIH3T3 com aproximadamente 70% de densidade celular em placas de 24 poços, trate as células NIH3T3 com solução de lixiviação de microesferas e continue a cultivar com meio completo por mais 24 horas.
4. Remova o meio de cultura de células e lave as células com PBS.
5. Avalie a viabilidade celular usando o ensaio Calcein-AM/PI. Pegue 2,5 μL de solução de calceína-AM (4 mM) e 12,5 μL de solução de PI (2 mM) e adicione-os a 5 mL de 1x PBS e misture bem para obter uma solução de trabalho com 2 μM de calceína-AM e 5 μM de PI.
6. Adicione a solução de trabalho a placas de cultura de células previamente semeadas a 500 μL por poço, incube a 37 ° C sob proteção contra luz por 15 min e observe e fotografe sob um microscópio de fluorescência invertida. Configure três réplicas para cada grupo.
7. Calcule a viabilidade celular de acordo com a seguinte fórmula:
   Viabilidade celular (%) = número de células viáveis / (número de células viáveis + número de células mortas)

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Resultados

Caracterização de ALGMS reticulado com diferentes íons metálicos
A morfologia óptica de Ca-ALGMS,-ALGMS, Zn-ALGMS e Fe-ALGMS é mostrada na Figura 2, exibindo boa esfericidade, superfície lisa, distribuição uniforme do tamanho das partículas (Figura Suplementar 2) e excelente monodispersidade. Além disso, realizamos a caracterização microscópica usando microscopia eletrônica de varredura (MEV) e análise de espectroscopia de energia dispersi...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussão

Neste protocolo, apresentamos um método para a preparação de ALGMS baseado na tecnologia de eletrospray microfluídico. O método é simples de operar e produz um grande número de microesferas com redondeza uniforme e diâmetro controlável. Essa abordagem oferece conveniência aos pesquisadores e pode promover a pesquisa e aplicação de microesferas de hidrogel. Além disso, por meio da reticulação com diferentes íons metálicos, a estabilidade e a bioatividade do ALGMS foram melhoradas. Nos experimentos antimic...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materiais

Name	Company	Catalog Number	Comments
120 mesh screen	Solarbio,China	YA0946
Alcohol burner	Solarbio,China	YA2320
BALB/c mice	Wukong Biotechnology,China
Bicinchoninic Acid Assay reagent	Meilunbio,China	MA0082
Bovine Serum Albumin	Lablead,China	9048-46-8
CaCl2  powder	Aladdin,China	10043-52-4
Calcein-AM/PI	Biosharp,China	BL130A
Centrifuge tubes	Corning,America	430290
CuSO4  powder	Jnxinyuehuagong,China	7758-99-8
DMEM	Gibicol,China	C11995500BT
FeCl3  powder	Aladdin,China	7705-08-0
Fetal Bovine Serum	HAKATA,China	HN-FBS
Glass tubes	Sartorius,Germany	CC0028
Light microscopy	Evidentscientific,Japan	BX53(LED)
Microfluidic syringe pump	Longerpump,England	LSP01-3A
NIH3T3	HyGyte,China	TCM-C752
Petri dish	Thermofisher,America	150464
Phosphate buffer saline	Thermofisher,America	3002
Scanning electron microscope	Thermofisher,America	Axia ChemiSEM
Sodium alginate powder	Bjbalb,China	Y13095
ZnSO4 powder	Jnxinyuehuagong,China	7733-02-0