Mikroakışkan Elektrosprey Teknolojisi Kullanılarak Farklı Metal İyonları ile Çapraz Bağlı Sodyum Aljinat Mikroküreciklerinin Hazırlanması

Özet

Protokol, ilaç taşıyıcı tasarımı için bir mikroakışkan cihaz kullanılarak farklı metal iyonları ile çapraz bağlanmış sodyum aljinat mikrokürelerinin hazırlanmasını açıklar. Bu mikrokürelerin antimikrobiyal özellikleri ve yavaş ilaç salınımı da araştırıldı.

Özet

Mikroküreler, fiziksel kapsülleme veya adsorpsiyon yoluyla ilaçları yüzeye ve polimerlerin içine yükleyebilen ve kademeli olarak serbest bırakabilen mikrometre büyüklüğünde parçacıklardır. Biyotıp alanında, hidrojel mikroküreler, ilaç uygulama sıklığını azaltma, yan etkileri en aza indirme ve hasta uyumunu iyileştirme yetenekleri nedeniyle ilaç taşıyıcıları olarak uygulamaları için kapsamlı bir şekilde incelenmiştir. Sodyum aljinat (ALG), üç omurga glikozidik bağına sahip, doğal olarak oluşan doğrusal bir polisakkarittir. Polimerin parçalarının her birinde, bir alkol hidroksil parçasının özelliklerine sahip olan iki yardımcı hidroksil grubu bulunur. Sentetik ALG birimleri, metal iyonları ile kimyasal çapraz bağlama reaksiyonlarına girebilir, polimer yığınlarının çapraz bağlı bir ağ yapısını oluşturur ve sonuçta bir hidrojel oluşturur. Hidrojel mikro küreler, ALG'nin iyonik çapraz bağlama özelliklerini içeren basit bir işlem kullanılarak hazırlanabilir. Bu çalışmada, bir mikroakışkan elektrodepozisyon stratejisi kullanarak ALG tabanlı hidrojel mikroküreler (ALGMS) hazırladık. Hazırlanan hidrojel mikro kürecikler, mikroakışkan elektrosprey akışının doğru kontrolü sayesinde eşit şekilde boyutlandırıldı ve iyi dağıldı. Mikroakışkan ve yüksek elektrik alanını birleştiren bir mikroakışkan elektrosprey tekniği kullanılarak farklı metal iyonları ile çapraz bağlanmış ALGMS, antimikrobiyal özellikleri, yavaş ilaç salınım kabiliyeti ve biyouyumluluğu araştırılmıştır. Bu teknoloji, ileri ilaç geliştirme ve üretiminde uygulama için umut vaat ediyor.

Giriş

İlaç dağıtım sistemleri, biyo-doku mühendisliği alanında, ilaç dağıtım verimliliğini ve etkinliğini artırmayı ve advers reaksiyonları ve yan etkileri azaltmayı amaçlayan bir araştırma noktasıdır¹. Bu sistemler arasında, iyi biyouyumluluk, ayarlanabilir mekanik özellikler ve fonksiyonel plastisite ile karakterize edilen hidrojel mikro küreler, ilaç yükleme ve dağıtımı için en yaygın kullanılan araçlardan biridir². İlaçların hem yavaş hem de kontrollü salınımı için kullanılabilirler, ilaçlar için iyi koruyucu etkiler sağlayabilirler, ilaçların diğer dokulardaki spesifik olmayan etkilerini önleyebilir veya en aza indirebilirler ve belirli doku yapılarına ilaç iletimini hedeflerler³. Bu nedenle, hidrojel mikrokürecikler yeni ve verimli bir ilaç dağıtım sistemi haline gelmiştir ve bu alandaki araştırmalar yavaş yavaş ortaya çıkmaktadır⁴.

Hidrojel mikroküreler tipik olarak polisakkaritler, proteinler ve doğal polimerler dahil olmak üzere biyolojik olarak parçalanabilen malzemelerden sentezlenir⁵. Bunlar arasında ALG, deniz kahverengi alglerinden^ekstrakte edilen biyouyumlu, biyolojik olarak parçalanabilen bir polisakkarittir 6. Moleküler zinciri, üç boyutlu bir ağa sahip suda çözünmeyen bir hidrojel yapısı oluşturmak için en iki değerlikli veya çok değerlikli katyonlarla çapraz bağlanabilen serbest hidroksil ve karboksil grupları içerir⁵. ALG tarafından oluşturulan hidrojel mikro küreler, nötr ve alkali çözeltilerde negatif yüklü polielektrolitlere dönüştürülebilir. Negatif yükler arasındaki bu itme, mikro kürelerin şişmesine neden olarak kapsüllenmiş aktif bileşenin veya ilacın salınmasına izin verir. Bu özellikler, ALG mikrokürelerinin ilaç yükleme ve kontrollü salım⁷ için yaygın olarak kullanılan umut verici ilaç taşıyıcıları olarak değerlendirilmesine yol açmıştır.

Hidrojel mikroküreciklerin hazırlanması için çeşitli yöntemler mevcuttur. Geleneksel ALGMS hazırlama yöntemleri genellikle sol-jel yöntemini veya emülsiyon-sol yöntemini içerir. Bu yöntemler, hedef mikro küreleri elde etmek için çökeltme, birlikte çökeltme ve jelleşme reaksiyonları gibi adımları içerir⁸. Son yıllarda, mikroakışkan teknolojisinin sürekli gelişmesiyle birlikte, mikroakışkan elektrosprey yöntemi yavaş yavaş verimli ve hassas bir mikroküre hazırlama yöntemi haline gelmiştir⁹. Bu yöntem, sonraki kürleme veya çapraz bağlama işlemi¹⁰ sırasında mikrometre boyutunda damlacıklar ve mikro küreler oluşturmak için bir polimer çözeltisini mikro ince bir nozuldan elektrosprey hale getirmek için mikroakışkan teknolojisini kullanır. Geleneksel yöntemle karşılaştırıldığında, mikroakışkan elektrosprey, çözelti akış hızı, voltaj ve ince nozul boyutu¹¹ gibi parametreleri ayarlayarak mikroküre parçacık boyutunun ve morfolojisinin hassas kontrolünü sunar. Ayrıca, mikro küreciklerin yüksek hızlı sürekli hazırlanmasını sağlayarak hazırlama verimliliğini artırır ve hafif reaksiyon koşullarını korur. Ek olarak, ALGMS, kontrollü salimli ilaçlar ve yüklü katalizörler gibi çeşitli işlevlere sahip olacak şekilde hazırlanabilir ve bu da çeşitli alanlarda kolay uygulanmasını sağlar.

Burada, mikroakışkan elektrosprey yöntemi kullanılarak ALG mikrokürelerinin hazırlanması için bir protokol sunuyoruz. İşlem, bir ALG çözeltisinin bir mikroakışkan cihazdan geçirilmesini ve elektrospreye tabi tutulmasını içerir. Elde edilen damlacıklar, çapraz bağlama reaksiyonunu başlatmak için farklı metal iyonları (Ca^{2 +}, Cu^{2 +}, Zn^{2 +} ve Fe^{3 +}) içeren çözelti içinde toplandı. Bu reaksiyon, mikro kürelerin stabilitesini ve yapışmasını geliştirir ve onlara farklı işlevler kazandırır. Bu yöntemin gerçekleştirilmesi kolaydır ve sentezlenen mikro küreler, morfolojilerinde iyi bir boyut homojenliği sergiler. Ek olarak, antimikrobiyal özelliklerini, yavaş ilaç salma yeteneklerini ve biyouyumluluklarını araştırdık. Bu protokol daha fazla ilaç geliştirme ve üretimi için faydalı olacaktır.

Protokol

Deneylerde kullanılan kan, 20-25 g ağırlığında ve yaklaşık 7 haftalık SPF dereceli BALB/c dişi farelerden elde edildi. Zhejiang Shuren Koleji Hayvan Deneyleri Etik Kurulu, tüm hayvan bakımı ve deney prosedürlerini onayladı.

1. Çözelti hazırlama

1. ALG'yi tartın ve %2 ALG çözeltisi elde etmek için 50 °C'de bir su banyosunda karıştırarak ultra saf suda çözün.
2. Ultra saf suda %5 (veya molar kütle konsantrasyonu 0.3 M'dir) CaCl₂, FeCl₃, ZnS04 ve CuS04 çözeltileri ile ayrı ayrı kütle fraksiyonu hazırlayın. Her çözeltiyi ayrı ayrı bir toplama kabına dökün.

2. Mikroakışkan elektrosprey cihazı

1. Bir cam kılcal boru alın ve yumuşatmak için bir kaynak makinesi alevinin üzerine yerleştirin, ardından çeşitli çaplara (50 μm-500 μm) gerin. İnce parçaları bir cam kesici ile kesin ve uç portunu yüksek kaliteli silisyum karbür zımpara kağıdı ile nazikçe parlatın. Temizledikten sonra, kılcal borunun kalın ucunu uzun bir boruya ve borunun diğer ucunu bir dağıtım iğnesine ve 5 mL'lik bir şırıngaya bağlayın (Ek Şekil 1).
   NOT: Cam tüp kesiklerinin keskin kenarlarının hortuma yerleştirilmesi zordur; Bu nedenle, kırılma alev kenarında yuvarlanmalıdır.
2. Şırıngayı mikroakışkan şırınga pompasına ve bir ucundaki kılcal boruyu tutucuya takın. Yüksek voltajlı güç kaynağının kırmızı yüksek voltajlı uç klipsini şırınganın dağıtım iğnesine bağlayın ve gümüş klipsi toplama sıvısına yerleştirin. Bu konfigürasyon, basit bir mikroakışkan elektrosprey cihazı oluşturur (Şekil 1A).
   NOT: Kılcal boruyu masaya dik olarak yerleştirin.

3. ALG mikro küreciklerinin hazırlanması

1. Farklı metal iyonları içeren ayrı toplama kaplarını doğrudan kılcal borunun altına yerleştirin. Mikroakışkan şırınga pompasını açın ve tüpü ALG ile doldurmak için Hızlı İleri öğesini seçin, ardından uygun akış hızını (2 mL/s) ayarlayın.
2. Yüksek voltajlı güç anahtarını açın ve uygun voltajı (5-7 kV) ayarlamak için düğmeyi çevirin.
3. Farklı metal iyonları ile çapraz bağlı ALGM'ler oluşturmak üzere ALG mikrokürelerini toplamak için 90 mm'lik Petri kaplarının her birine 20 mL çözelti ekleyin (Şekil 1B).
4. ALG, birkaç saniye içinde farklı iyon toplama çözeltilerinde elektrik alanı ve yerçekimi etkisi altında mikro küreler oluşturur. Mikroküreleri sterilize edilmiş bir pipetle aspire edin ve Zn^{2 +}, Ca^{2 +}, Cu^{2 +} ve Fe^{3 +} -ALG hidrojel mikroküreleri elde etmek için bunları ayrı ayrı 1.5 mL santrifüj tüplerine aktarın (Şekil 1C). Zn-ALGMS, Ca-ALGMS, Cu-ALGMS ve Fe-ALGMS tüplerini etiketleyin.
   NOT: Voltaj, uç çapı, akış hızı ve çözelti konsantrasyonu gibi parametreler ayarlanarak farklı çaplarda mikro küreler elde edilebilir.
5. Hazırlanan mikro kürelerden küçük bir miktar alın, bunları PBS'de mümkün olduğunca eşit bir şekilde dağıtın ve görselleştirme için mikroskop altına yerleştirin.
6. Aynı mikro küre partisinde rastgele seçilen 10 gözlem alanı, ölçülecek görüntüleri ImageJ yazılımına aktarın, görüntüleri uygun gri tonlama moduna dönüştürün ve hedef parçacıkların alanını doğru bir şekilde tanımlamak için eşik segmentasyon teknolojisini kullanın ve ImageJ'in hedef parçacıkları tanımlayabilmesi ve ölçebilmesi için parçacıkları analiz etme işlevini başlatın. Mikro küreler hakkında veri elde edin ve ardından verileri analiz ve parçacık boyutu haritalaması için Origin yazılımına aktarın.

4. Antimikrobiyal performans testi

1. Staphylococcus aureus (S. aureus) ve Escherichia coli'nin (E. coli) 5 mL süspansiyonlarını sıvı bir Luria-Bertani (LB) ortamı kullanarak 0.2 mcF'lik bir başlangıç bakteriyel bulanıklığı ile hazırlayın.
2. 4 ayrı 15 mL steril santrifüj tüpüne her bakteri çözeltisinden 10 mL ekleyin. Ardından, her tüpe 0,5 mL Zn-ALGMS, Ca-ALGMS, Cu-ALGMS ve Fe-ALGMS ALG ekleyin ve bunları 12 saat boyunca 37 ° C ve 200 rpm'de sabit sıcaklıklı bir çalkalayıcıya yerleştirin. Kontrol grubuna eşit miktarda salin ekleyin.
3. Her bakteri çözeltisini steril su ile^{10 5} kez seyreltin. Bir LB katı ortama 200 μL bakteri çözeltisi yaymak için steril bir cam boncuk kullanın.
4. Solüsyonu kaplama plakasına hızlı ve eşit bir şekilde yayın, aynı alanda ileri geri kaçının. Ardından, plakaları 12 saat boyunca 37 ° C'de bir inkübatöre yerleştirin. Farklı grupların kolonilerini gözlemleyin.
   NOT: Tüm aseptik prosedürler bir alkol lambasının yakınında yapılmalıdır. Mikrobiyal kültür kaplarını, aşılama kaplarını ve kültür ortamlarını sterilize edin.

5. İlaç salım testi

1. Farklı mikrokürelerin ilaç salma kabiliyetini değerlendirmek için, yüklü bir model ilaç olarak sığır serum albümini (BSA) kullanın. 24 saat boyunca 1 mg / mL BSA süspansiyonuna her mikroküreden (Ca-ALGMS, Cu-ALGMS, Zn-ALGMS ve Fe-ALGMS) 500 μL ekleyin.
2. İlaç salım tahlili için, her doymuş numuneyi 5.0 M fosfat tamponlu salin (PBS; pH 7.4) içine ekleyin, ardından 80 rpm'de sürekli çalkalama ile 37 ° C'de 15 dakika çalkalayın.
3. 100 μL çözelti kullanın ve ortamı 1, 3, 6, 12, 24, 36 ve 48 saatte yeni bir tane ile değiştirin.
4. Üreticinin talimatlarına göre bir BCA kiti kullanarak süpernatan protein konsantrasyonlarını belirli zamanlarda ölçün. Karşılık gelen emiciliği elde etmek için salınan ilacı enzim markörü ile kantitatif olarak ölçün ve ölçülen değeri standart eğriye göre gerçek ilaç konsantrasyonuna dönüştürün. Aşağıdaki formülü kullanarak ilaç salım oranını hesaplayın:
   İlaç salınım yüzdesi = (belirli bir zaman noktasında salınan ilaç konsantrasyonu / ilk ilaç konsantrasyonu) x %100
5. Düzenli aralıklarla, her bir oyuktan eşit miktarda PBS çıkarın ve eşit hacimde taze ortamla değiştirin.

6. Hemoliz testi

1. Hazırlanan Ca-ALGMS, Cu-ALGMS, Zn-ALGMS ve Fe-ALGMS'yi PBS'ye yerleştirin ve inkübasyon solüsyonunu formüle etmek için 37 ° C'de 24 saat inkübe edin.
2. Sodyum sitrat içeren antikoagüle tüplerde toplanan oküler flebotomi ile sağlıklı BALB/c farelerinden tam kan elde edin. Kırmızı kan hücreleri elde etmek için 15 dakika boyunca 1509 x g'da vorteks ve santrifüj edin.
3. Kırmızı kan hücrelerini PBS ile 2x-3x yıkayın ve PBS ile% 10'luk bir kırmızı kan hücresi çözeltisi hazırlayın.
4. Çeşitli ALGM'lerin hazırlanması: Deney grubu için her mikroküreden 500 μL, pozitif kontrol grubu için 1 mL ultra saf su (ddH₂O) ve negatif kontrol grubu için 1 mL PBS çözeltisi alın ve her birini 20 μL kan hücresi çözeltisi ile karıştırın.
5. Numuneleri 37 °C'de 4 saat inkübe edin, 1509 x g'da santrifüjleyin, 15 dakika. Süpernatanı bir kenara bırakın ve hemolizden sonra her gruptaki kırmızı kan hücrelerini fotoğraflayın.
6. Pozitif kontrol grubunun hemoliz oranını %100 ve negatif kontrol grubunun hemoliz oranını %0 olarak alınız. Her gruptaki süpernatanların absorbans değerlerini ölçün ve aşağıdaki formülü kullanarak hemoliz oranını hesaplayın:
   Hemoliz (%) = (Her grubun süpernatantlarının absorbans değerleri-
   Tek başına damıtılmış suyun absorbans değerleri) / (Pozitif kontrol grubunun absorbans değerleri- Sadece distile suyun absorbans değerleri) x 100

7. Sitobiyouyumluluk testi

1. Farklı ALGMS 2x'i PBS ile yıkayın ve 15 dakika boyunca 5 mL'lik bir Petri kabına koyun ve süpernatanı atın.
2. % 10 FBS içeren tam kültür ortamında (DMEM) 0.2 mL'de farklı ALGMS'leri ayrı ayrı ekleyin, 37 ° C'de 24 saat inkübe edin ve sızıntı suyunu elde etmek için çözeltiyi süzün.
3. NIH3T3 hücrelerini 24 oyuklu plakalarda yaklaşık% 70 hücre yoğunluğuna kadar kültürleyin, NIH3T3 hücrelerini mikroküre liç çözeltisi ile muamele edin ve 24 saat daha tam ortamla kültüre devam edin.
4. Hücre kültürü ortamını çıkarın ve hücreleri PBS ile yıkayın.
5. Calcein-/PI testini kullanarak hücre canlılığını değerlendirin. 2.5 μL Calcein-çözeltisi (4 mM) ve 12.5 μL PI çözeltisi (2 mM) alın ve bunları 5 mL 1x PBS'ye ekleyin ve 2 μM Calcein-ve 5 μM PI ile çalışan bir çözelti elde etmek için iyice karıştırın.
6. Çalışma solüsyonunu oyuk başına 500 μL'de önceden ekilmiş hücre kültürü plakalarına ekleyin, ışık koruması altında 37 ° C'de 15 dakika inkübe edin ve ters çevrilmiş bir floresan mikroskobu altında gözlemleyin ve fotoğraflayın. Her grup için üç çoğaltma ayarlayın.
7. Hücre canlılığını aşağıdaki formüle göre hesaplayın:
   Hücre canlılığı (%) = canlı hücre sayısı / (canlı hücre sayısı + ölü hücre sayısı)

Sonuçlar

Farklı metal iyonları ile çapraz bağlı ALGMS'nin karakterizasyonu
Ca-ALGMS, Cu-ALGMS, Zn-ALGMS ve Fe-ALGMS'nin optik morfolojisi Şekil 2'de gösterilmiştir ve iyi küresellik, pürüzsüz yüzey, düzgün parçacık boyutu dağılımı (Ek Şekil 2) ve mükemmel monodispersite sergiler. Ayrıca taramalı elektron mikroskobu (SEM) ve enerji dağılımlı spektroskopi (EDS) analizi kullanarak mikroskobik karakterizasyon gerçekleştirdik.

Tartışmalar

Bu protokolde, mikroakışkan elektrosprey teknolojisine dayalı ALGMS hazırlamak için bir yöntem sunuyoruz. Yöntemin kullanımı basittir ve düzgün yuvarlaklığa ve kontrol edilebilir çapa sahip çok sayıda mikro küre verir. Bu yaklaşım araştırmacılara kolaylık sağlar ve hidrojel mikroküreciklerin araştırılmasını ve uygulanmasını teşvik edebilir. Ek olarak, farklı metal iyonları ile çapraz bağlanma yoluyla, ALGMS'nin stabilitesi ve biyoaktivitesi iyileştirildi. Antimikrobiyal deneylerde, C...

Malzemeler

Name	Company	Catalog Number	Comments
120 mesh screen	Solarbio,China	YA0946
Alcohol burner	Solarbio,China	YA2320
BALB/c mice	Wukong Biotechnology,China
Bicinchoninic Acid Assay reagent	Meilunbio,China	MA0082
Bovine Serum Albumin	Lablead,China	9048-46-8
CaCl2  powder	Aladdin,China	10043-52-4
Calcein-AM/PI	Biosharp,China	BL130A
Centrifuge tubes	Corning,America	430290
CuSO4  powder	Jnxinyuehuagong,China	7758-99-8
DMEM	Gibicol,China	C11995500BT
FeCl3  powder	Aladdin,China	7705-08-0
Fetal Bovine Serum	HAKATA,China	HN-FBS
Glass tubes	Sartorius,Germany	CC0028
Light microscopy	Evidentscientific,Japan	BX53(LED)
Microfluidic syringe pump	Longerpump,England	LSP01-3A
NIH3T3	HyGyte,China	TCM-C752
Petri dish	Thermofisher,America	150464
Phosphate buffer saline	Thermofisher,America	3002
Scanning electron microscope	Thermofisher,America	Axia ChemiSEM
Sodium alginate powder	Bjbalb,China	Y13095
ZnSO4 powder	Jnxinyuehuagong,China	7733-02-0