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In questo articolo

  • Riepilogo
  • Abstract
  • Introduzione
  • Protocollo
  • Risultati
  • Discussione
  • Divulgazioni
  • Riconoscimenti
  • Materiali
  • Riferimenti
  • Ristampe e Autorizzazioni

Riepilogo

Il protocollo descrive la preparazione di microsfere di alginato di sodio reticolate con diversi ioni metallici utilizzando un dispositivo microfluidico per la progettazione di vettori di farmaci. Sono state studiate anche le proprietà antimicrobiche e il lento rilascio di farmaci di queste microsfere.

Abstract

Le microsfere sono particelle di dimensioni micrometriche che possono caricare e rilasciare gradualmente farmaci tramite incapsulamento fisico o adsorbimento sulla superficie e all'interno dei polimeri. Nel campo della biomedicina, le microsfere di idrogel sono state ampiamente studiate per la loro applicazione come vettori di farmaci grazie alla loro capacità di ridurre la frequenza di somministrazione del farmaco, minimizzare gli effetti collaterali e migliorare la compliance del paziente. L'alginato di sodio (ALG) è un polisaccaride lineare presente in natura con tre legami glicosidici dello scheletro. Ci sono due gruppi ossidrilici ausiliari presenti in ciascuna delle parti del polimero, che hanno le caratteristiche di una porzione ossidrilica alcolica. Le unità ALG sintetiche possono subire reazioni chimiche di reticolazione con ioni metallici, formando una struttura a rete reticolata di pile di polimeri, formando infine un idrogel. Le microsfere di idrogel possono essere preparate utilizzando un semplice processo che coinvolge le proprietà di reticolazione ionica dell'ALG. In questo studio, abbiamo preparato microsfere di idrogel a base di ALG (ALGMS) utilizzando una strategia di elettrodeposizione microfluidica. Le microsfere di idrogel preparate erano di dimensioni uniformi e ben disperse, grazie al controllo accurato del flusso di elettrospray microfluidico. Gli ALGMS reticolati con diversi ioni metallici sono stati preparati utilizzando una tecnica di elettrospray microfluidica che combina microfluidica e un elevato campo elettrico, e sono state studiate le sue proprietà antimicrobiche, la lenta capacità di rilascio del farmaco e la biocompatibilità. Questa tecnologia è promettente per l'applicazione nello sviluppo e nella produzione di farmaci avanzati.

Introduzione

I sistemi di somministrazione dei farmaci sono un punto di riferimento per la ricerca nel campo dell'ingegneria dei biotessuti, con l'obiettivo di migliorare l'efficienza e l'efficacia della somministrazione dei farmaci e ridurre le reazioni avverse e gli effetti collaterali1. Tra questi sistemi, le microsfere di idrogel, caratterizzate da buona biocompatibilità, proprietà meccaniche regolabili e plasticità funzionale, sono uno dei veicoli più comunemente utilizzati per il caricamento e la somministrazione di farmaci2. Possono essere utilizzati sia per il rilascio lento che controllato di farmaci, forniscono buoni effetti protettivi per i farmaci, evitano o riducono al minimo gli effetti non specifici dei farmaci in altri tessuti e mirano alla somministrazione di farmaci a specifiche strutture tissutali3. Pertanto, le microsfere di idrogel sono diventate un nuovo ed efficiente sistema di somministrazione di farmaci, con la ricerca in questo campo che sta gradualmente emergendo4.

Le microsfere di idrogel sono tipicamente sintetizzate da materiali biodegradabili, tra cui polisaccaridi, proteine e polimeri naturali5. Tra questi, l'ALG è un polisaccaride biocompatibile e biodegradabile estratto dalle alghe brune marine6. La sua catena molecolare contiene gruppi ossidrilici e carbossilici liberi che possono reticolare con la maggior parte dei cationi bivalenti o multivalenti per formare una struttura di idrogel insolubile in acqua con una rete tridimensionale5. Le microsfere di idrogel formate dall'ALG possono essere convertite in polielettroliti caricati negativamente in soluzioni neutre e alcaline. Questa repulsione tra le cariche negative provoca il rigonfiamento delle microsfere, consentendo il rilascio del principio attivo o del farmaco incapsulato. Queste proprietà hanno portato a considerare le microsfere di ALG come promettenti vettori di farmaci ampiamente utilizzati per il caricamento di farmaci e il rilascio controllato7.

Esistono vari metodi per la preparazione di microsfere di idrogel. I metodi tradizionali di preparazione degli ALGMS di solito includono il metodo sol-gel o il metodo emulsione-sol. Questi metodi prevedono fasi come la precipitazione, la co-precipitazione e le reazioni di gelificazione per ottenere le microsfere bersaglio8. Negli ultimi anni, con il continuo sviluppo della tecnologia microfluidica, il metodo elettrospray microfluidico è diventato gradualmente un metodo di preparazione delle microsfere efficiente e preciso9. Questo metodo utilizza la tecnologia microfluidica per spruzzare elettromedicalmente una soluzione polimerica attraverso un ugello microfine per formare goccioline e microsfere di dimensioni micrometriche durante il successivo processo di polimerizzazione o reticolazione10. Rispetto al metodo tradizionale, l'elettrospray microfluidico offre un controllo preciso della dimensione e della morfologia delle particelle di microsfera, regolando parametri quali la portata della soluzione, la tensione e la dimensione dell'ugello fine11. Consente inoltre la preparazione continua ad alta velocità delle microsfere, migliorando l'efficienza della preparazione e mantenendo condizioni di reazione blande. Inoltre, gli ALGMS possono essere preparati per possedere varie funzioni, come farmaci a rilascio controllato e catalizzatori caricati, consentendo la loro facile applicazione in vari campi.

Qui presentiamo un protocollo per la preparazione di microsfere ALG utilizzando il metodo dell'elettrospray microfluidico. Il processo prevede il passaggio di una soluzione ALG attraverso un dispositivo microfluidico e la sottoposizione a elettrospray. Le goccioline risultanti sono state raccolte nella soluzione contenente diversi ioni metallici (Ca2+, Cu2+, Zn2+ e Fe3+) per avviare la reazione di reticolazione. Questa reazione migliora la stabilità e l'adesione delle microsfere e le dota di diverse funzionalità. Questo metodo è facile da eseguire e le microsfere sintetizzate mostrano una buona uniformità dimensionale nella loro morfologia. Inoltre, abbiamo studiato le loro proprietà antimicrobiche, la lenta capacità di rilascio del farmaco e la biocompatibilità. Questo protocollo sarà utile per l'ulteriore sviluppo e produzione di farmaci.

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Protocollo

Il sangue utilizzato negli esperimenti è stato ottenuto da topi femmina BALB/c di grado SPF del peso di 20-25 g e di circa 7 settimane. Il Comitato Etico per la Sperimentazione Animale dello Zhejiang Shuren College ha approvato tutte le procedure sperimentali e di cura degli animali.

1. Preparazione della soluzione

  1. Pesare l'ALG e scioglierlo in acqua ultrapura agitando a bagnomaria a 50 °C per ottenere una soluzione di ALG al 2%.
  2. Preparare separatamente la frazione di massa con soluzioni al 5% (o la concentrazione di massa molare è 0,3 M) di CaCl2, FeCl3, ZnSO4 e CuSO4 in acqua ultrapura. Versare ogni soluzione separatamente in una vasca di raccolta.

2. Dispositivo elettrospray microfluidico

  1. Prendete un tubo capillare di vetro e posizionatelo sulla fiamma di una fiamma ossidrica per ammorbidirlo, quindi allungatelo a vari diametri (50 μm-500 μm). Tagliare le parti fini con un tagliavetro e lucidare delicatamente la porta della punta con carta vetrata al carburo di silicio di alta qualità. Dopo la pulizia, collegare l'estremità spessa del tubo capillare a un tubo lungo e l'altra estremità del tubo a un ago di erogazione e una siringa da 5 ml (Figura supplementare 1).
    NOTA: Gli spigoli vivi dei tagli dei tubi di vetro sono difficili da inserire nel tubo; Pertanto, la rottura dovrebbe essere arrotondata sul bordo della fiamma.
  2. Collegare la siringa alla pompa a siringa microfluidica e il tubo capillare a un'estremità al supporto. Collegare la clip terminale rossa ad alta tensione dell'alimentatore ad alta tensione all'ago di erogazione della siringa e posizionare la clip argentata nel liquido di raccolta. Questa configurazione crea un semplice dispositivo elettrospray microfluidico (Figura 1A).
    NOTA: Posizionare il tubo capillare perpendicolarmente al tavolo.

3. Preparazione delle microsfere ALG

  1. Posizionare le piastre di raccolta differenziata contenenti diversi ioni metallici direttamente sotto il tubo capillare. Accendere la pompa a siringa microfluidica e selezionare Avanti veloce per adescare la provetta con l'ALG, quindi impostare la portata appropriata (2 mL/h).
  2. Accendere l'interruttore di alimentazione ad alta tensione e ruotare la manopola per impostare la tensione appropriata (5-7 kV).
  3. Aggiungere 20 mL di soluzione a ciascuna delle piastre di Petri da 90 mm per raccogliere le microsfere di ALG e formare ALGMS reticolati con diversi ioni metallici (Figura 1B).
  4. L'ALG forma microsfere sotto l'azione del campo elettrico e della gravità in diverse soluzioni di raccolta ionica in pochi secondi. Aspirare le microsfere con una pipetta sterilizzata e trasferirle in singole provette da centrifuga da 1,5 ml per ottenere microsfere di idrogel Zn2+, Ca2+, Cu2+ e Fe3+ -ALG (Figura 1C). Etichettare le provette Zn-ALGMS, Ca-ALGMS, Cu-ALGMS e Fe-ALGMS.
    NOTA: Microsfere di diverso diametro possono essere ottenute regolando parametri quali tensione, diametro della punta, portata e concentrazione della soluzione.
  5. Prelevare una piccola quantità delle microsfere preparate, disperderle il più uniformemente possibile in PBS e posizionarle al microscopio per la visualizzazione.
  6. Selezionando casualmente 10 campi di osservazione nello stesso lotto di microsfere, importare le immagini da misurare nel software ImageJ, convertire le immagini nella modalità in scala di grigi appropriata e utilizzare la tecnologia di segmentazione della soglia per definire con precisione l'area delle particelle target e avviare la funzione di analisi delle particelle in modo che ImageJ possa identificare e misurare le particelle target. Ottenere i dati sulle microsfere e quindi importare i dati nel software Origin per l'analisi e la mappatura delle dimensioni delle particelle.

4. Test delle prestazioni antimicrobiche

  1. Preparare 5 mL di sospensioni di Staphylococcus aureus (S. aureus) ed Escherichia coli (E. coli) con una torbidità batterica iniziale di 0,2 mcF utilizzando un terreno liquido Luria-Bertani (LB).
  2. Aggiungere 10 mL di ciascuna soluzione batterica a 4 provette da centrifuga sterili da 15 mL. Quindi, aggiungere 0,5 mL di Zn-ALGMS, Ca-ALGMS, Cu-ALGMS e Fe-ALGMS ALG a ciascuna provetta e metterli in un agitatore a temperatura costante a 37 °C e 200 giri/min per 12 ore. Aggiungere una quantità uguale di soluzione fisiologica al gruppo di controllo.
  3. Diluire ogni soluzione batterica a 105 volte con acqua sterile. Utilizzare una perla di vetro sterile per spargere 200 μL di soluzione batterica su un mezzo solido LB.
  4. Stendere la soluzione in modo rapido e uniforme sulla lastra di rivestimento, evitando avanti e indietro nella stessa zona. Quindi, porre le piastre in un'incubatrice a 37 °C per 12 ore. Osserva le colonie di diversi gruppi.
    NOTA: Tutte le procedure asettiche devono essere eseguite vicino a una lampada ad alcool. Sterilizzare i recipienti di coltura microbica, gli utensili per l'inoculazione e i terreni di coltura.

5. Test di rilascio del farmaco

  1. Per valutare la capacità di rilascio del farmaco di diverse microsfere, utilizzare l'albumina sierica bovina (BSA) come farmaco modello caricato. Aggiungere 500 μl di ciascuna microsfera (Ca-ALGMS, Cu-ALGMS, Zn-ALGMS e Fe-ALGMS) a 1 mg/mL di sospensione di BSA per 24 ore.
  2. Per il test di rilascio del farmaco, aggiungere ciascun campione saturo a 5,0 M di soluzione salina tamponata con fosfato (PBS; pH 7,4), seguita da agitazione per 15 minuti a 37 °C con agitazione continua a 80 giri/min.
  3. Utilizzare 100 μl della soluzione e sostituire il terreno con uno nuovo a 1, 3, 6, 12, 24, 36 e 48 ore.
  4. Quantificare le concentrazioni di proteine surnatanti in momenti specifici utilizzando un kit BCA secondo le istruzioni del produttore. Misurare quantitativamente il farmaco rilasciato mediante marcatore enzimatico per ottenere l'assorbanza corrispondente e convertire il valore misurato in concentrazione effettiva del farmaco secondo la curva standard. Calcola il tasso di rilascio del farmaco utilizzando la seguente formula:
    Percentuale di rilascio di farmaco = (concentrazione di farmaco rilasciato in un momento specifico / concentrazione iniziale del farmaco) x 100%
  5. A intervalli regolari, rimuovere un volume uguale di PBS da ciascun pozzetto e sostituirlo con un volume uguale di terreno fresco.

6. Test di emolisi

  1. Porre i Ca-ALGMS, i Cu-ALGMS, gli Zn-ALGMS e i Fe-ALGMS preparati in PBS e incubarli a 37 °C per 24 ore per formulare la soluzione di incubazione.
  2. Ottenere sangue intero da topi sani BALB/c mediante flebotomia oculare, raccolto in provette anticoagulate contenenti citrato di sodio. Agitare e centrifugare a 1509 x g per 15 min per ottenere globuli rossi.
  3. Lavare i globuli rossi 2x-3x con PBS e preparare una soluzione di globuli rossi al 10% con PBS.
  4. Preparazione di vari ALGMS: Prelevare 500 μL di ciascuna microsfera per il gruppo sperimentale, 1 mL di acqua ultrapura (ddH2O) per il gruppo di controllo positivo e 1 mL di soluzione di PBS per il gruppo di controllo negativo e mescolare ciascuno con 20 μL di soluzione di cellule del sangue.
  5. Incubare i campioni a 37 °C per 4 ore, centrifugare a 1509 x g, 15 min. Tenere da parte il surnatante e fotografare i globuli rossi di ciascun gruppo dopo l'emolisi.
  6. Prendi il tasso di emolisi del gruppo di controllo positivo come 100% e il gruppo di controllo negativo come 0%. Misurare i valori di assorbanza dei surnatanti in ciascun gruppo e calcolare il tasso di emolisi utilizzando la formula:
    Emolisi (%) = (Valori di assorbanza dei surnatanti di ciascun gruppo-
    Valori di assorbanza della sola acqua distillata) / (Valori di assorbanza del gruppo di controllo positivo - Valori di assorbanza della sola acqua distillata) x 100

7. Test di citobiocompatibilità

  1. Lavare i diversi ALGM 2 volte con PBS e metterli in una capsula di Petri da 5 ml per 15 minuti e scartare il surnatante.
  2. Aggiungere separatamente diversi ALGM a 0,2 mL in terreno di coltura completo (DMEM) contenente il 10% di FBS, incubare a 37 °C per 24 ore e filtrare la soluzione per ottenere il percolato.
  3. Coltura di cellule NIH3T3 a circa il 70% di densità cellulare in piastre a 24 pozzetti, trattamento delle cellule NIH3T3 con una soluzione di lisciviazione a microsfere e continuazione della coltura con terreno completo per altre 24 ore.
  4. Rimuovere il terreno di coltura cellulare e lavare le cellule con PBS.
  5. Valutare la vitalità cellulare utilizzando il test Calcein-AM/PI. Prendere 2,5 μL di soluzione di Calceina-AM (4 mM) e 12,5 μL di soluzione PI (2 mM) e aggiungerli a 5 mL di 1x PBS e mescolare bene per ottenere una soluzione di lavoro con 2 μM di Calcein-AM e 5 μM di PI.
  6. Aggiungere la soluzione di lavoro alle piastre di coltura cellulare precedentemente seminate a 500 μl per pozzetto, incubare a 37 °C sotto protezione dalla luce per 15 minuti e osservare e fotografare al microscopio a fluorescenza invertita. Impostare tre repliche per ogni gruppo.
  7. Calcolare la vitalità cellulare secondo la seguente formula:
    Vitalità cellulare (%) = numero di cellule vitali / (numero di cellule vitali + numero di cellule morte)

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Risultati

Caratterizzazione di ALGMS reticolati con diversi ioni metallici
La morfologia ottica di Ca-ALGMS, Cu-ALGMS, Zn-ALGMS e Fe-ALGMS è mostrata nella Figura 2, mostrando una buona sfericità, superficie liscia, distribuzione granulometrica uniforme (Figura 2 supplementare) e un'eccellente monodispersività. Abbiamo inoltre eseguito la caratterizzazione microscopica utilizzando la microscopia elettronica a scansione (SEM) e l'analisi della spettroscopia a dis...

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Discussione

In questo protocollo, presentiamo un metodo per la preparazione di ALGMS basato sulla tecnologia microfluidica elettrospray. Il metodo è semplice da usare e produce un gran numero di microsfere con rotondità uniforme e diametro controllabile. Questo approccio offre convenienza ai ricercatori e può promuovere la ricerca e l'applicazione di microsfere di idrogel. Inoltre, attraverso la reticolazione con diversi ioni metallici, sono state migliorate la stabilità e la bioattività degli ALGMS. Negli esperimenti antimicro...

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Divulgazioni

Non devono essere divulgati conflitti di interesse.

Riconoscimenti

Questo lavoro è stato sostenuto da un progetto di ricerca della Zhejiang Shuren University (2023R053 e 2023KJ237).

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Materiali

NameCompanyCatalog NumberComments
120 mesh screenSolarbio,ChinaYA0946
Alcohol burnerSolarbio,ChinaYA2320
BALB/c miceWukong Biotechnology,China
Bicinchoninic Acid Assay reagentMeilunbio,ChinaMA0082
Bovine Serum AlbuminLablead,China9048-46-8
CaCl2  powderAladdin,China10043-52-4
Calcein-AM/PIBiosharp,ChinaBL130A
Centrifuge tubesCorning,America430290
CuSO4  powderJnxinyuehuagong,China7758-99-8
DMEMGibicol,ChinaC11995500BT
FeCl3  powderAladdin,China7705-08-0
Fetal Bovine SerumHAKATA,ChinaHN-FBS
Glass tubesSartorius,GermanyCC0028
Light microscopyEvidentscientific,JapanBX53(LED)
Microfluidic syringe pumpLongerpump,EnglandLSP01-3A
NIH3T3HyGyte,ChinaTCM-C752
Petri dishThermofisher,America150464
Phosphate buffer salineThermofisher,America3002
Scanning electron microscopeThermofisher,AmericaAxia ChemiSEM
Sodium alginate powder Bjbalb,ChinaY13095
ZnSO4 powderJnxinyuehuagong,China7733-02-0

Riferimenti

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