マイクロ流体エレクトロスプレー技術を用いた異なる金属イオンを有する架橋アルギン酸ナトリウムミクロスフェアの調製

要約

このプロトコルは、薬物担体設計のためのマイクロ流体デバイスを使用して、異なる金属イオンと架橋されたアルギン酸ナトリウムマイクロスフェアの調製について説明しています。これらのマイクロスフェアの抗菌特性とゆっくりとした薬物放出についても調査しました。

要約

マイクロスフェアはマイクロメートルサイズの粒子で、表面やポリマー内で物理的なカプセル化や吸着によって薬物をロードし、徐々に放出することができます。生物医学の分野では、ハイドロゲルマイクロスフェアは、薬物投与の頻度を減らし、副作用を最小限に抑え、患者のコンプライアンスを向上させる能力があるため、薬物担体としての応用について広く研究されてきました。アルギン酸ナトリウム(ALG)は、3つの骨格グリコシド結合を持つ天然に存在する線状多糖類です。ポリマーの各部分には2つの補助ヒドロキシル基が存在し、これらはアルコールヒドロキシル部分の特性を持っています。合成ALGユニットは、金属イオンとの化学架橋反応を起こし、ポリマースタックの架橋ネットワーク構造を形成し、最終的にハイドロゲルを形成することができます。ハイドロゲルミクロスフェアは、ALGのイオン性架橋特性を含む簡単なプロセスを使用して調製できます。本研究では、マイクロ流体電着法を用いてALGベースのハイドロゲルマイクロスフェア(ALGMS)を作製しました。調製したヒドロゲルマイクロスフェアは、マイクロ流体エレクトロスプレーの流れを正確に制御するため、サイズが均一で十分に分散していました。異なる金属イオンと架橋したALGMSを、マイクロ流体と高電場を組み合わせたマイクロ流体エレクトロスプレー技術を用いて調製し、その抗菌特性、薬物放出遅延能、生体適合性について検討した。この技術は、高度な医薬品の開発・生産への応用が期待されています。

概要

ドラッグデリバリーシステムは、バイオティッシュエンジニアリングの分野における研究のホットスポットであり、ドラッグデリバリーの効率と有効性を向上させ、副作用と副作用を減らすことを目指しています¹。これらの系の中で、良好な生体適合性、調整可能な機械的特性、および機能的可塑性を特徴とするハイドロゲルマイクロスフェアは、薬物のローディングおよび送達に最も一般的に使用されるビヒクルの1つです²。これらは、薬物の徐放と制御された放出の両方に使用され、薬物に良好な保護効果を提供し、他の組織における薬物の非特異的影響を回避または最小化し、特定の組織構造への薬物送達を標的とすることができる³。したがって、ハイドロゲルマイクロスフェアは新しく効率的な薬物送達システムになり、この分野の研究が徐々に出現しています⁴。

ハイドロゲルマイクロスフェアは、通常、多糖類、タンパク質、天然ポリマー5などの生分解性材料から合成^{されます。}その中でも、ALGは海産褐藻6から抽出された生体適合性のある生分解性多糖類^である。その分子鎖には遊離ヒドロキシル基とカルボキシル基が含まれており、ほとんどの二価または多価の陽イオンと架橋して、三^{次元ネットワーク5}を持つ水不溶性ヒドロゲル構造を形成することができます。ALGによって形成されたハイドロゲルマイクロスフェアは、中性およびアルカリ性溶液中で負に帯電した高分子電解質に変換することができます。この負電荷間の反発により、ミクロスフェアが膨らみ、カプセル化された有効成分または薬物が放出されます。これらの特性により、ALGマイクロスフェアは、薬物のローディング^{および制御放出}7に広く使用されている有望な薬物担体として考慮されるようになりました。

ヒドロゲルマイクロスフェアの調製には、さまざまな方法が存在します。従来のALGMS調製方法には、通常、ゾルゲル法またはエマルジョンゾル法が含まれます。これらの方法は、標的のミクロスフェア8を得るための沈殿、共沈、ゲル化反応などのステップ^を含む。近年、マイクロ流体技術の継続的な発展に伴い、マイクロ流体エレクトロスプレー法は徐々に効率的で正確なマイクロスフェア調製方法⁹になりました。この方法は、マイクロ流体技術を利用して、マイクロファインノズルを介してポリマー溶液をエレクトロスプレーし、その後の硬化または架橋プロセス¹⁰中にマイクロメートルサイズの液滴およびマイクロスフェアを形成する。従来の方法と比較して、マイクロ流体エレクトロスプレーは、溶液の流量、電圧、微細ノズルサイズ¹¹などのパラメータを調整することにより、マイクロスフェアの粒子サイズと形態を正確に制御できます。また、ミクロスフェアの高速連続調製が可能となり、調製効率が向上し、温和な反応条件が維持されます。また、ALGMSは、放出制御薬や充填触媒など、さまざまな機能を持つように準備することができ、様々な分野での応用が容易です。

ここでは、マイクロ流体エレクトロスプレー法を用いたALGマイクロスフェアの調製に関するプロトコールを紹介します。このプロセスでは、ALG溶液をマイクロ流体デバイスに通し、エレクトロスプレーにかけます。得られた液滴を、異なる金属イオン(Ca²⁺、Cu²⁺、Zn²⁺、Fe³⁺)を含む溶液に集めて、架橋反応を開始しました。この反応により、ミクロスフェアの安定性と接着性が向上し、マイクロスフェアにさまざまな機能が付与されます。この方法は簡単に実行でき、合成されたミクロスフェアは、その形態において良好なサイズ均一性を示します。さらに、それらの抗菌特性、緩慢な薬物放出能力、および生体適合性を調査しました。このプロトコールは、さらなる医薬品の開発と生産に役立ちます。

プロトコル

実験で使用した血液は、体重20〜25g、生後約7週間のSPFグレードのBALB/c雌マウスから採取しました。浙江樹仁大学の動物実験倫理委員会は、すべての動物の世話と実験手順を承認しました。

1. 溶液の調製

1. ALGを礁量し、50°Cのウォーターバスで攪拌して超純水に溶解し、2%ALG溶液を得ます。
2. 超純水中のCaCl₂、FeCl₃、ZnSO₄、CuSO₄ の5%(または分子量濃度が0.3 M)溶液で質量分画を調製します。各溶液を別々に収集皿に注ぎます。

2. マイクロ流体エレクトロスプレー装置

1. ガラス製の毛細管を取り、ブロートーチの炎の上に置いて柔らかくしてから、さまざまな直径(50μm〜500μm)に伸ばします。細かい部分をガラスカッターで切り落とし、先端ポートを高品質の炭化ケイ素サンドペーパーで優しく磨きます。洗浄後、キャピラリーチューブの太い端を長いチューブに接続し、チューブのもう一方の端を分注針と5mLシリンジに接続します(補足図1)。
   注意: ガラス管のカットの鋭いエッジは、ホースに挿入するのが困難です。したがって、ブレークは炎の端で丸みを帯びている必要があります。
2. シリンジをマイクロ流体シリンジポンプに取り付け、キャピラリーチューブの一方の端をホルダーに取り付けます。高電圧電源の赤い高電圧エンドクリップをシリンジの分注針に接続し、銀色のクリップを収集液に入れます。この構成により、単純なマイクロ流体エレクトロスプレーデバイスが作成されます(図1A)。
   注意: キャピラリーチューブをテーブルに対して垂直に置きます。

3. ALGマイクロスフェアの準備

1. 異なる金属イオンを含む別々の収集皿をキャピラリーチューブの真下に置きます。マイクロ流体シリンジポンプをオンにし、[ Fast Forward ]を選択してALGでチューブをプライミングし、適切な流量(2 mL / h)を設定します。
2. 高容量のスイッチを入れますtage電源スイッチをオンにし、ノブを回して適切なボリュームを設定しますtage(5〜7 kV)。
3. 90 mmのペトリ皿のそれぞれに20 mLの溶液を加えてALGマイクロスフェアを収集し、異なる金属イオンと架橋されたALGMSを形成します(図1B)。
4. ALGは、電場と重力の作用下で、さまざまなイオン収集溶液中で数秒以内にマイクロスフェアを形成します。滅菌したピペットでミクロスフェアを吸引し、個々の1.5 mL遠心分離チューブに移して、Zn²⁺、Ca²⁺、Cu²⁺、およびFe³⁺ -ALGハイドロゲルマイクロスフェアを取得します(図1C)。Zn-ALGMS、Ca-ALGMS、Cu-ALGMS、Fe-ALGMSチューブにラベルを付けます。
   注:電圧、先端径、流量、溶液濃度などのパラメータを調整することにより、異なる直径のミクロスフェアを取得できます。
5. 調製した微小球を少量取り、PBSにできるだけ均一に分散させ、顕微鏡下に置いて可視化します。
6. 同じバッチのマイクロスフェアでランダムに選択された10の観察フィールド、測定する画像をImageJソフトウェアにインポートし、画像を適切なグレースケールモードに変換し、しきい値セグメンテーション技術を使用してターゲット粒子の領域を正確に定義し、ImageJがターゲット粒子を識別および測定できるように粒子を分析する機能を開始します。ミクロスフェアに関するデータを取得し、そのデータをOriginソフトウェアにインポートして、分析と粒子サイズマッピングを行います。

4.抗菌性能試験

1. 黄色ブドウ球菌(黄色ブドウ球菌)および大腸菌(E.coli)の懸濁液5 mLを調製し、初期細菌の濁度が0.2 mcFの場合、液体Luria-Bertani(LB)培地を使用します。
2. 各細菌溶液10 mLを4本の個別の15 mL滅菌遠心チューブに加えます。次に、0.5 mLのZn-ALGMS、Ca-ALGMS、Cu-ALGMS、およびFe-ALGMS ALGを各チューブに加え、37°C、200rpmの恒温シェーカーに12時間入れます。コントロールグループに同量の生理食塩水を追加します。
3. 各細菌溶液を滅菌水で^{10 5} 倍に希釈します。滅菌ガラスビーズを使用して、LB固体培地に200μLの細菌溶液を広げます。
4. 溶液をコーティングプレート上に迅速かつ均一に広げ、同じ領域で前後にならないようにします。次に、プレートを37°Cのインキュベーターに12時間置きます。さまざまなグループのコロニーを観察します。
   注:すべての無菌手順は、アルコールランプの近くで実行する必要があります。微生物培養容器、接種器具、培地の滅菌を行います。

5. 薬物放出試験

1. さまざまなミクロスフェアの薬物放出能を評価するには、ロードモデル薬物としてウシ血清アルブミン(BSA)を使用します。各マイクロスフェア(Ca-ALGMS、Cu-ALGMS、Zn-ALGMS、およびFe-ALGMS)500 μLを1 mg/mL BSA懸濁液に24時間加えます。
2. 薬物放出アッセイでは、各飽和サンプルを5.0 Mのリン酸緩衝生理食塩水(PBS;pH 7.4)に加え、続いて37°Cで15分間攪拌し、80 rpmで連続振とうします。
3. 100 μLの溶液を使用し、1、3、6、12、24、36、および48時間後に培地を新しいものと交換します。
4. 製造元の指示に従って、BCAキットを使用して特定の時間における上清タンパク質濃度を定量します。放出された薬物を酵素マーカーで定量的に測定して対応する吸光度を取得し、測定値を標準曲線に従って実際の薬物濃度に変換します。次の式を使用して薬物放出率を計算します。
   薬物放出率=(特定の時点で放出された薬物の濃度/初期薬物濃度)×100%
5. 一定の間隔で、各ウェルから等量のPBSを取り出し、等量の新鮮な培地と交換します。

6. 溶血検査

1. 調製したCa-ALGMS、Cu-ALGMS、Zn-ALGMS、Fe-ALGMSをPBSに入れ、37°Cで24時間インキュベートしてインキュベーション溶液を調製します。
2. クエン酸ナトリウムを含む抗凝固チューブに集めた眼瀉血により、健康なBALB/cマウスから全血を採取します。ボルテックスし、1509 x g で15分間遠心分離して、赤血球を取得します。
3. 赤血球をPBSで2〜3倍洗い流し、PBSで10%赤血球溶液を調製します。
4. 各種ALGMSの調製:実験群には各マイクロスフェアに500μL、ポジティブコントロール群には超純水(_ddH2O)1mL、ネガティブコントロールグループにはPBS溶液1mLを摂取し、それぞれに20μLの血球溶液を混合します。
5. サンプルを37°Cで4時間インキュベートし、1509 x gで15分間遠心分離します。上清を脇に置いて、溶血後の各グループの赤血球を撮影します。
6. 陽性対照群の溶血率を100%、陰性対照群の溶血率を0%とすると。各グループの上清の吸光度値を測定し、次の式を使用して溶血速度を計算します。
   溶血(%)=(各グループの上清の吸光度値-
   蒸留水単独の吸光度値)/(ポジティブコントロール群の吸光度値-蒸留水のみの吸光度値)×100

7. 細胞生体適合性試験

1. さまざまなALGMS 2xをPBSで洗浄し、5 mLのペトリ皿に15分間入れて、上清を捨てます。
2. 10% FBSを含む完全培地(DMEM)に0.2 mLで異なるALGMSを別途添加し、37°Cで24時間インキュベートし、溶液をろ過して浸出液を得ます。
3. NIH3T3細胞を24ウェルプレートで約70%の細胞密度で培養し、NIH3T3細胞をマイクロスフェア浸出溶液で処理し、さらに24時間完全培地で培養を続けます。
4. 細胞培養培地を取り出し、PBSで細胞を洗浄します。
5. Calcein-AM/PIアッセイを用いて細胞生存率を評価します。2.5 μL の Calcein-AM 溶液 (4 mM) と 12.5 μL の PI 溶液 (2 mM) を取り、5 mL の 1x PBS に加えてよく混合し、2 μM Calcein-AM と 5 μM PI のワーキング溶液を得ます。
6. 以前に播種した細胞培養プレートにワーキング溶液をウェルあたり500 μLで加え、光保護下で37°Cで15分間インキュベートし、倒立蛍光顕微鏡で観察および撮影します。グループごとに 3 つのレプリケートを設定します。
7. 次の式に従って細胞生存率を計算します。
   細胞生存率(%)=生存細胞の数/(生存細胞の数+死んだ細胞の数)

結果

異なる金属イオンと架橋されたALGMSの特性評価
Ca-ALGMS、Cu-ALGMS、Zn-ALGMS、およびFe-ALGMSの光学形態を 図2に示すと、良好な球形度、滑らかな表面、均一な粒度分布(補足図2)、および優れた単分散性を示します。さらに、走査型電子顕微鏡(SEM)とエネルギー分散型分光法(EDS)分析を用いた顕微鏡的評価を行いました。 図3に示?...

ディスカッション

このプロトコルでは、マイクロ流体エレクトロスプレー技術に基づくALGMSの調製方法を紹介します。この方法は操作が簡単で、均一な真円度と制御可能な直径を持つ多数のミクロスフェアが得られます。このアプローチは、研究者に利便性を提供し、ハイドロゲルマイクロスフェアの研究と応用を促進することができます。さらに、異なる金属イオンと架橋することにより、ALGMSの安定性と生...

資料

Name	Company	Catalog Number	Comments
120 mesh screen	Solarbio,China	YA0946
Alcohol burner	Solarbio,China	YA2320
BALB/c mice	Wukong Biotechnology,China
Bicinchoninic Acid Assay reagent	Meilunbio,China	MA0082
Bovine Serum Albumin	Lablead,China	9048-46-8
CaCl2  powder	Aladdin,China	10043-52-4
Calcein-AM/PI	Biosharp,China	BL130A
Centrifuge tubes	Corning,America	430290
CuSO4  powder	Jnxinyuehuagong,China	7758-99-8
DMEM	Gibicol,China	C11995500BT
FeCl3  powder	Aladdin,China	7705-08-0
Fetal Bovine Serum	HAKATA,China	HN-FBS
Glass tubes	Sartorius,Germany	CC0028
Light microscopy	Evidentscientific,Japan	BX53(LED)
Microfluidic syringe pump	Longerpump,England	LSP01-3A
NIH3T3	HyGyte,China	TCM-C752
Petri dish	Thermofisher,America	150464
Phosphate buffer saline	Thermofisher,America	3002
Scanning electron microscope	Thermofisher,America	Axia ChemiSEM
Sodium alginate powder	Bjbalb,China	Y13095
ZnSO4 powder	Jnxinyuehuagong,China	7733-02-0