JoVE Logo
АВТОРЫ
СВЯЖИТЕСЬ С НАМИ

Войдите в систему

Для просмотра этого контента требуется подписка на Jove Войдите в систему или начните бесплатную пробную версию.

В этой статье

  • Резюме
  • Аннотация
  • Введение
  • протокол
  • Результаты
  • Обсуждение
  • Раскрытие информации
  • Благодарности
  • Материалы
  • Ссылки
  • Перепечатки и разрешения

Резюме

В протоколе описано получение микросфер альгината натрия, сшитых с различными ионами металлов с помощью микрофлюидного устройства для конструирования носителей лекарств. Также были исследованы антимикробные свойства и медленное высвобождение лекарств из этих микросфер.

Аннотация

Микросферы представляют собой частицы микрометрового размера, которые могут загружать и постепенно высвобождать лекарства посредством физической инкапсуляции или адсорбции на поверхности и внутри полимеров. В области биомедицины гидрогелевые микросферы широко изучаются на предмет их применения в качестве носителей лекарств благодаря их способности снижать частоту введения лекарств, сводить к минимуму побочные эффекты и улучшать комплаентность пациентов. Альгинат натрия (ALG) представляет собой встречающийся в природе линейный полисахарид с тремя основными гликозидными связями. В каждой из фракций полимера присутствуют две вспомогательные гидроксильные группы, которые обладают характеристиками спиртовой гидроксильной группы. Синтетические звенья ALG могут вступать в химические реакции сшивания с ионами металлов, образуя сшитую сетчатую структуру полимерных стеков, в конечном итоге образуя гидрогель. Гидрогелевые микросферы могут быть получены с помощью простого процесса, включающего ионные сшивающие свойства ALG. В этом исследовании мы получили гидрогелевые микросферы (АЛГМ) на основе АЛГ с использованием стратегии микрофлюидного электроосаждения. Подготовленные гидрогелевые микросферы имели одинаковый размер и хорошо диспергировались благодаря точному контролю потока микрофлюидного электроспрея. Методом микрофлюидного электрораспыления, сочетающего микрофлюидное и высокое электрическое поле, были получены ALGMS, сшитые с различными ионами металлов, и исследованы его антимикробные свойства, способность к медленному высвобождению лекарственного средства и биосовместимость. Эта технология перспективна для применения в разработке и производстве передовых лекарств.

Введение

Системы доставки лекарств являются горячей точкой исследований в области био-тканевой инженерии, направленной на повышение эффективности и результативности доставки лекарств и снижение побочных реакций и побочных эффектов1. Среди этих систем гидрогелевые микросферы, характеризующиеся хорошей биосовместимостью, перестраиваемыми механическими свойствами и функциональной пластичностью, являются одними из наиболее часто используемых средств для загрузкии доставки лекарств. Они могут использоваться как для медленного, так и для контролируемого высвобождения лекарств, обеспечивают хорошие защитные эффекты для лекарств, предотвращают или минимизируют неспецифические эффекты лекарств в других тканях, а также нацеливают доставку лекарств к конкретным тканевымструктурам. Таким образом, гидрогелевые микросферы стали новой и эффективной системой доставки лекарств, ипостепенно появляются исследования в этой области4.

Гидрогелевые микросферы обычно синтезируются из биоразлагаемых материалов, включая полисахариды, белки и природные полимеры5. Среди них ALG является биосовместимым, биоразлагаемым полисахаридом, извлеченным из морских бурых водорослей6. Его молекулярная цепь содержит свободные гидроксильные и карбоксильные группы, которые могут сшиваться с большинством двухвалентных или поливалентных катионов с образованием нерастворимой в воде гидрогелевой структуры с трехмерной сетью5. Гидрогелевые микросферы, образованные ALG, могут быть преобразованы в отрицательно заряженные полиэлектролиты в нейтральных и щелочных растворах. Это отталкивание между отрицательными зарядами приводит к набуханию микросфер, что позволяет высвобождать инкапсулированный активный ингредиент или лекарство. Эти свойства привели к рассмотрению микросфер ALG в качестве перспективных носителей лекарств, широко используемых для загрузки лекарств и контролируемого высвобождения7.

Существуют различные методы получения гидрогелевых микросфер. К традиционным методам получения ALGMS обычно относятся золь-гель метод или эмульсионно-зольный метод. Эти методы включают в себя такие стадии, как реакции осаждения, совместного осаждения и гелеобразования для получения целевых микросфер8. В последние годы, с непрерывным развитием микрофлюидных технологий, метод микрофлюидного электрораспыления постепенно стал эффективным и точным методом подготовки микросфер9. В этом методе используется микрофлюидная технология для электрораспыления полимерного раствора через микротонкую сопло с образованием капель и микросфер микрометрового размера в ходе последующего процесса отверждения или сшивания10. По сравнению с традиционным методом, микрофлюидное электроспрей обеспечивает точный контроль размера и морфологии частиц микросфер путем регулировки таких параметров, как расход раствора, напряжение и размер соплатонкой очистки 11. Он также обеспечивает высокоскоростное непрерывное приготовление микросфер, повышая эффективность приготовления и поддерживая мягкие условия реакции. Кроме того, ALGMS может быть подготовлен для выполнения различных функций, таких как препараты с контролируемым высвобождением и загруженные катализаторы, что позволяет легко применять их в различных областях.

Здесь мы представляем протокол получения микросфер ALG методом микрофлюидного электрораспыления. Процесс включает в себя пропускание раствора ALG через микрофлюидное устройство и воздействие на него электрораспыления. Полученные капли собирали в растворе, содержащем различные ионы металлов (Ca2+, Cu2+, Zn2+ и Fe3+) для инициирования реакции сшивки. Эта реакция улучшает стабильность и адгезию микросфер и наделяет их различными функциональными возможностями. Этот метод прост в исполнении, и синтезированные микросферы демонстрируют хорошую однородность размеров в своей морфологии. Кроме того, мы исследовали их антимикробные свойства, медленную способность к высвобождению лекарств и биосовместимость. Этот протокол будет полезен для дальнейшей разработки и производства лекарств.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

протокол

Кровь, использованная в экспериментах, была получена от самок мышей BALB/c SPF-класса весом 20-25 г и возрастом около 7 недель. Комитет по этике экспериментов на животных колледжа Чжэцзян Шужэнь одобрил все процедуры по уходу за животными и эксперименты.

1. Приготовление раствора

  1. Взвесьте ALG и растворите в ультрачистой воде, помешивая на водяной бане при 50 °C до получения 2% раствора ALG.
  2. Отдельно готовят массовую фракцию с 5% (или молярной массовой концентрацией 0,3 М) растворами CaCl2, FeCl3, ZnSO4 и CuSO4 в ультрачистой воде. Каждый раствор вылейте отдельно в сборную посуду.

2. Устройство для микрожидкостного электрораспыления

  1. Возьмите стеклянную капиллярную трубку и поместите ее над пламенем паяльной лампы, чтобы она размягчилась, затем растяните ее до различных диаметров (50 мкм-500 мкм). Отрежьте мелкие части стеклорезом и аккуратно отполируйте отверстие наконечника высококачественной наждачной бумагой из карбида кремния. После очистки подсоедините толстый конец капиллярной трубки к длинной трубке, а другой конец трубки — к дозирующей игле и шприцу объемом 5 мл (дополнительный рисунок 1).
    ПРИМЕЧАНИЕ: Острые края порезов стеклянной трубки трудно вставить в шланг; Таким образом, излом должен быть закруглен по краю пламени.
  2. Прикрепите шприц к микрофлюидному шприцевому насосу, а капиллярную трубку с одного конца — к держателю. Подсоедините красный высоковольтный концевой зажим высоковольтного источника питания к дозирующей игле шприца и поместите серебряный зажим в жидкость для сбора. Такая конфигурация создает простое микрофлюидное электрораспыление (рис. 1A).
    ПРИМЕЧАНИЕ: Расположите капиллярную трубку перпендикулярно столу.

3. Подготовка микросфер ALG

  1. Поместите отдельные чашки для сбора, содержащие различные ионы металлов, непосредственно под капиллярную трубку. Включите микрофлюидный шприцевой насос и выберите Fast Forward, чтобы заполнить трубку ALG, затем установите соответствующую скорость потока (2 мл/ч).
  2. Включите высоковольтный выключатель питания и поверните ручку, чтобы установить соответствующее напряжение (5-7 кВ).
  3. Добавьте 20 мл раствора в каждую из 90 мм чашек Петри, чтобы собрать микросферы ALG и сформировать ALGMS, сшитые с различными ионами металлов (рис. 1B).
  4. АЛГ образует микросферы под действием электрического поля и гравитации в различных ионосборных растворах в течение нескольких секунд. Отасканируйте микросферы с помощью стерилизованной пипетки и перенесите их в отдельные центрифужные пробирки объемом 1,5 мл для получения гидрогелевых микросфер Zn2+, Ca2+, Cu2+ и Fe3+ -ALG (рис. 1C). Маркируйте пробирки Zn-ALGMS, Ca-ALGMS, Cu-ALGMS и Fe-ALGMS.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Микросферы различных диаметров могут быть получены путем регулировки таких параметров, как напряжение, диаметр наконечника, скорость потока и концентрация раствора.
  5. Возьмите небольшое количество подготовленных микросфер, распределите их как можно более равномерно в PBS и поместите под микроскоп для визуализации.
  6. Случайно выбранные 10 полей наблюдения в одной и той же партии микросфер, импортируйте изображения для измерения в программное обеспечение ImageJ, преобразуйте изображения в соответствующий режим оттенков серого и используйте технологию пороговой сегментации для точного определения площади целевых частиц и запустите функцию анализа частиц, чтобы ImageJ мог идентифицировать и измерить целевые частицы. Получите данные о микросферах, а затем импортируйте данные в программное обеспечение Origin для анализа и картирования размеров частиц.

4. Тест на антимикробную эффективность

  1. Приготовьте 5 мл суспензий золотистого стафилококка (S. aureus) и кишечной палочки (E. coli) с исходным бактериальным помутнением 0,2 мкФ с использованием жидкой среды Лурия-Бертани (LB).
  2. Добавьте по 10 мл каждого бактериального раствора в 4 отдельные стерильные центрифужные пробирки объемом 15 мл. Затем добавьте 0,5 мл Zn-ALGMS, Ca-ALGMS, Cu-ALGMS и Fe-ALGMS ALG в каждую пробирку и поместите их в шейкер с постоянной температурой при 37 °C и 200 об/мин на 12 часов. Добавьте равное количество физиологического раствора в контрольную группу.
  3. Разведите каждый бактериальный раствор до 105 раз стерильной водой. С помощью стерильной стеклянной бусины распределите 200 мкл бактериального раствора по твердой среде LB.
  4. Быстро и равномерно распределите раствор по пластине для покрытия, избегая движения вперед и назад на одном и том же участке. Затем поместите планшеты в инкубатор при температуре 37 °C на 12 часов. Наблюдайте за колониями разных групп.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Все асептические процедуры следует проводить вблизи спиртовой лампы. Стерилизуйте сосуды для микробных культур, посуду для посевов и питательные среды.

5. Тестирование на высвобождение лекарственного средства

  1. Чтобы оценить способность различных микросфер к высвобождению лекарственных средств, используйте бычий сывороточный альбумин (БСА) в качестве загруженного модельного препарата. Добавьте по 500 мкл каждой микросферы (Ca-ALGMS, Cu-ALGMS, Zn-ALGMS и Fe-ALGMS) в суспензию 1 мг/мл BSA в течение 24 ч.
  2. Для анализа высвобождения лекарственного препарата каждый насыщенный образец добавляют в 5,0 М фосфатно-солевого буфера (PBS; pH 7,4) с последующим перемешиванием в течение 15 мин при 37 °C с непрерывным встряхиванием при 80 об/мин.
  3. Используйте 100 μл раствора и замените среду на свежую через 1, 3, 6, 12, 24, 36 и 48 часов.
  4. Количественно оценивайте концентрации белка надосадочной жидкости в определенное время с помощью набора BCA в соответствии с инструкциями производителя. Количественно измерьте высвобождаемое лекарственное средство по ферментному маркеру для получения соответствующей абсорбции и переведите измеренное значение в фактическую концентрацию лекарственного средства по стандартной кривой. Рассчитайте скорость высвобождения препарата по следующей формуле:
    Процент высвобождения наркотика = (концентрация высвобождаемого наркотика в определенный момент времени / начальная концентрация наркотика) x 100%
  5. Через равные промежутки времени извлекайте равный объем PBS из каждой лунки и заменяйте его равным объемом свежей среды.

6. Тест на гемолиз

  1. Приготовленные Ca-ALGMS, Cu-ALGMS, Zn-ALGMS и Fe-ALGMS поместите в PBS и инкубируйте их при 37 °C в течение 24 ч для приготовления инкубационного раствора.
  2. Получить цельную кровь от здоровых мышей BALB/c методом флеботомии глаза, собранную в антикоагулированные пробирки, содержащие цитрат натрия. Вортекс и центрифуги при 1509 х г в течение 15 мин для получения эритроцитов.
  3. Промойте эритроциты в 2-3 раза PBS и приготовьте 10% раствор эритроцитов с PBS.
  4. Приготовление различных ALGMS: Возьмите по 500 мкл каждой микросферы для опытной группы, 1 мл сверхчистой воды (ddH2O) для положительной контрольной группы и 1 мл раствора PBS для отрицательной контрольной группы и смешайте каждую с 20 μл раствора клеток крови.
  5. Образцы инкубировать при 37 °C в течение 4 ч, центрифугировать при 1509 x g, 15 мин. Отложите надосадочную жидкость в сторону и сфотографируйте эритроциты в каждой группе после гемолиза.
  6. Примите уровень гемолиза в группе положительного контроля за 100% и в группе отрицательного контроля за 0%. Измерьте значения абсорбции надосадочной жидкости в каждой группе и рассчитайте скорость гемолиза по формуле:
    Гемолиз (%) = (Значения поглощения надосадочной жидкости каждой группы
    Значения поглощения только дистиллированной воды) / (Значения поглощения положительной контрольной группы - Значения поглощения только дистиллированной воды) x 100

7. Тест на цитобиосовместимость

  1. Промойте различные ALGMS 2x с PBS и поместите в чашку Петри объемом 5 мл на 15 минут и выбросьте надосадочную жидкость.
  2. Отдельно добавить различные ALGMS по 0,2 мл в полнокультуральную среду (DMEM), содержащую 10% FBS, инкубировать при 37 °C в течение 24 ч и отфильтровать раствор до получения фильтрата.
  3. Культивируют клетки NIH3T3 примерно до 70% плотности в 24-луночных планшетах, обрабатывают клетки NIH3T3 раствором для выщелачивания микросфер и продолжают культивирование полной средой в течение еще 24 ч.
  4. Удалите среду для культивирования клеток и промойте клетки PBS.
  5. Оцените жизнеспособность клеток с помощью анализа Calcein-AM/PI. Возьмите 2,5 мкл раствора Кальцеин-АМ (4 мМ) и 12,5 мкл раствора ПИ (2 мМ) и добавьте их к 5 мл 1х ПБС и хорошо перемешайте до получения рабочего раствора с 2 мкМ Кальцеин-АМ и 5 мкМ ПИ.
  6. Добавьте рабочий раствор в предварительно засеянные клеточные культуральные планшеты из расчета 500 μл на лунку, инкубируйте при 37 °C под светозащитой в течение 15 минут, наблюдайте и фотографируйте под инвертированным флуоресцентным микроскопом. Настройте три репликации для каждой группы.
  7. Рассчитать жизнеспособность клеток можно по следующей формуле:
    Жизнеспособность клеток (%) = количество жизнеспособных клеток / (количество жизнеспособных клеток + количество мертвых клеток)

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Результаты

Определение характеристик сшитых ALGMS с различными ионами металлов
Оптическая морфология Ca-ALGMS, Cu-ALGMS, Zn-ALGMS и Fe-ALGMS показана на рисунке 2, демонстрируя хорошую сферичность, гладкую поверхность, равномерное распределение частиц по размерам (дополнительный ри...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Обсуждение

В данном протоколе мы представляем способ приготовления АЛГМ на основе технологии микрофлюидного электрораспыления. Метод прост в эксплуатации и позволяет получить большое количество микросфер с равномерной округлостью и контролируемым диаметром. Такой подход обеспечивает удобств...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Раскрытие информации

Конфликты интересов не подлежат разглашению.

Благодарности

Эта работа была поддержана исследовательским проектом Чжэцзянского университета Шужэнь (2023R053 и 2023KJ237).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Материалы

NameCompanyCatalog NumberComments
120 mesh screenSolarbio,ChinaYA0946
Alcohol burnerSolarbio,ChinaYA2320
BALB/c miceWukong Biotechnology,China
Bicinchoninic Acid Assay reagentMeilunbio,ChinaMA0082
Bovine Serum AlbuminLablead,China9048-46-8
CaCl2  powderAladdin,China10043-52-4
Calcein-AM/PIBiosharp,ChinaBL130A
Centrifuge tubesCorning,America430290
CuSO4  powderJnxinyuehuagong,China7758-99-8
DMEMGibicol,ChinaC11995500BT
FeCl3  powderAladdin,China7705-08-0
Fetal Bovine SerumHAKATA,ChinaHN-FBS
Glass tubesSartorius,GermanyCC0028
Light microscopyEvidentscientific,JapanBX53(LED)
Microfluidic syringe pumpLongerpump,EnglandLSP01-3A
NIH3T3HyGyte,ChinaTCM-C752
Petri dishThermofisher,America150464
Phosphate buffer salineThermofisher,America3002
Scanning electron microscopeThermofisher,AmericaAxia ChemiSEM
Sodium alginate powder Bjbalb,ChinaY13095
ZnSO4 powderJnxinyuehuagong,China7733-02-0

Ссылки

  1. Gong, J., et al. A review of recent advances of cellulose-based intelligent-responsive hydrogels as vehicles for controllable drug delivery system. Int J BiolMacromol. 264 (2), 130525(2024).
  2. Zhao, Z., et al. Injectable microfluidic hydrogel microspheres for cell and drug delivery. Adv Funct. 31 (31), 2103339(2021).
  3. Qiao, S., Chen, W., Zheng, X., Ma, L. Preparation of pH-sensitive alginate-based hydrogel by microfluidic technology for intestinal targeting drug delivery. Int J Biol Macromol. 254 (2), 127649(2024).
  4. Lei, L., et al. Antimicrobial hydrogel microspheres for protein capture and wound healing. Mater Design. 215, 110478(2022).
  5. Ju, Y., et al. Zn2+ incorporated composite polysaccharide microspheres for sustained growth factor release and wound healing. Mater Today Bio. 22, 100739(2023).
  6. El-Sayed, N. S., Hashem, A. H., Khattab, T. A., Kamel, S. New antibacterial hydrogels based on sodium alginate. Int. J Biol Macromol. 248, 125872(2023).
  7. Olukman Şahin, M., Şanlı, O. In vitro 5-fluorouracil release properties investigation from pH sensitive sodium alginate coated and uncoated methyl cellulose/chitosan microspheres. Int J Biol Macromol. 258 (1), 128895(2024).
  8. Chi, H., Qiu, Y., Ye, X., Shi, J., Li, Z. Preparation strategy of hydrogel microsphere and its application in skin repair. Front Bioeng Biotechnol. 11, 1239183(2023).
  9. Yang, L., et al. Bio-inspired dual-adhesive particles from microfluidic electrospray for bone regeneration. Nano Res. 16 (4), 5292-5299 (2022).
  10. Zheng, H., et al. Celastrol-encapsulated microspheres prepared by microfluidic electrospray for alleviating inflammatory pain. Biomater Adv. 149, 213398(2023).
  11. Yang, L., Yang, W., Xu, W., Zhao, Y., Shang, L. Bio-inspired Janus microcarriers with sequential actives release for bone regeneration. Chem Eng J. 476, 146797(2023).
  12. Yang, L., Sun, L., Zhang, H., Bian, F., Zhao, Y. Ice-inspired lubricated drug delivery particles from microfluidic electrospray for osteoarthritis treatment. ACS Nano. 15 (12), 20600-20606 (2021).
  13. Li, S., et al. Ultra-flexible stretchable liquid metal circuits with antimicrobial properties through selective laser activation for health monitoring. Chem Eng J. 482, 149173(2024).
  14. Sukhodub, L., Kumeda, M., Sukhodub, L., Bielai, V., Lyndin, M. Metal ions doping effect on the physicochemical, antimicrobial, and wound healing profiles of alginate-based composite. Carbohydr Polym. 304, 120486(2023).
  15. Daly, A. C., Riley, L., Segura, T., Burdick, J. A. Hydrogel microparticles for biomedical applications. Nat Rev Mater. 5 (1), 20-43 (2020).
  16. Bertsch, P., Diba, M., Mooney, D. J., Leeuwenburgh, S. C. G. Self-healing injectable hydrogels for tissue regeneration. Chem Rev. 123 (2), 834-873 (2023).
  17. Yang, L., et al. Biomass microcapsules with stem cell encapsulation for bone repair. Nanomicro Lett. 14 (1), 4(2021).
  18. Wu, D., et al. NK-Cell-Encapsulated porous microspheres via microfluidic electrospray for tumor immunotherapy. ACS Appl Mater. 11 (37), 33716-33724 (2019).
  19. Nan, L., Zhang, H., Weitz, D. A., Shum, H. C. Development and future of droplet microfluidics. LOC. 24 (5), 1135-1153 (2024).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Перепечатки и разрешения

Запросить разрешение на использование текста или рисунков этого JoVE статьи

Запросить разрешение

Смотреть дополнительные статьи

208

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Конфиденциальность

Условия эксплуатации

Политика

СВЯЖИТЕСЬ С НАМИ

РЕКОМЕНДОВАТЬ БИБЛИОТЕКЕ

НОВОСТИ JoVE

Исследования

Образование

АВТОРЫ

Библиотекарь

О JoVE

Авторские права © 2025 MyJoVE Corporation. Все права защищены