Preparación de microesferas de alginato de sodio reticulado con diferentes iones metálicos utilizando la tecnología de electrospray microfluídico

Resumen

El protocolo describe la preparación de microesferas de alginato de sodio reticuladas con diferentes iones metálicos utilizando un dispositivo microfluídico para el diseño de portadores de fármacos. También se investigaron las propiedades antimicrobianas y la liberación lenta de estos fármacos.

Resumen

Las microesferas son partículas del tamaño de un micrómetro que pueden cargarse y liberarse gradualmente fármacos a través de la encapsulación física o la adsorción en la superficie y dentro de los polímeros. En el campo de la biomedicina, las microesferas de hidrogel han sido ampliamente estudiadas para su aplicación como portadores de fármacos debido a su capacidad para reducir la frecuencia de administración de fármacos, minimizar los efectos secundarios y mejorar el cumplimiento del paciente. El alginato de sodio (ALG) es un polisacárido lineal natural con tres enlaces glucosídicos fundamentales. Hay dos grupos hidroxilo auxiliares presentes en cada una de las fracciones del polímero, que tienen las características de una fracción hidroxilo de alcohol. Las unidades sintéticas de ALG pueden sufrir reacciones químicas de reticulación con iones metálicos, formando una estructura de red reticulada de pilas de polímeros, formando finalmente un hidrogel. Las microesferas de hidrogel se pueden preparar utilizando un proceso simple que involucra las propiedades de reticulación iónica de ALG. En este estudio, preparamos microesferas de hidrogel basadas en ALG (ALGMS) utilizando una estrategia de electrodeposición microfluídica. Las microesferas de hidrogel preparadas tenían un tamaño uniforme y estaban bien dispersas, gracias a un control preciso del flujo de electrospray microfluídico. Se prepararon ALGMS reticulados con diferentes iones metálicos utilizando una técnica de electrospray microfluídico que combina microfluídica y campo eléctrico alto, y se investigaron sus propiedades antimicrobianas, capacidad de liberación lenta del fármaco y biocompatibilidad. Esta tecnología es prometedora para su aplicación en el desarrollo y la producción de fármacos avanzados.

Introducción

Los sistemas de administración de fármacos son un foco de investigación en el campo de la ingeniería de biotejidos, con el objetivo de mejorar la eficiencia y la eficacia de la administración de fármacos y reducir las reacciones adversas y los efectos secundarios¹. Entre estos sistemas, las microesferas de hidrogel, caracterizadas por buena biocompatibilidad, propiedades mecánicas sintonizables y plasticidad funcional, son uno de los vehículos más utilizados para la carga y administración de fármacos². Pueden utilizarse tanto para la liberación lenta como controlada de fármacos, proporcionar buenos efectos protectores para los fármacos, evitar o minimizar los efectos inespecíficos de los fármacos en otros tejidos y dirigir la administración de fármacos a estructuras tisulares específicas³. Por lo tanto, las microesferas de hidrogel se han convertido en un nuevo y eficiente sistema de administración de fármacos, con una investigación en este campo que emerge gradualmente⁴.

Las microesferas de hidrogel se sintetizan normalmente a partir de materiales biodegradables, como polisacáridos, proteínas y polímeros naturales⁵. Entre ellos, ALG es un polisacárido biocompatible y biodegradable extraído de algas pardas marinas⁶. Su cadena molecular contiene grupos hidroxilo y carboxilo libres que pueden reticularse con la mayoría de los cationes divalentes o multivalentes para formar una estructura de hidrogel insoluble en agua con una red tridimensional⁵. Las microesferas de hidrogel formadas por ALG se pueden convertir en polielectrolitos cargados negativamente en soluciones neutras y alcalinas. Esta repulsión entre cargas negativas hace que las microesferas se hinchen, permitiendo la liberación del principio activo encapsulado o fármaco. Estas propiedades han llevado a considerar las microesferas de ALG como prometedoras portadoras de fármacos ampliamente utilizadas para la carga de fármacos y la liberación controlada⁷.

Existen varios métodos para la preparación de microesferas de hidrogel. Los métodos tradicionales de preparación de ALGMS suelen incluir el método sol-gel o el método emulsión-sol. Estos métodos implican etapas como la precipitación, la coprecipitación y las reacciones de gelificación para obtener las microesferas objetivo⁸. En los últimos años, con el desarrollo continuo de la tecnología microfluídica, el método de electropulverización microfluídica se ha convertido gradualmente en un método de preparación de microesferas eficiente y preciso⁹. Este método utiliza la tecnología microfluídica para electrorociar una solución de polímero a través de una boquilla microfina para formar gotas y microesferas del tamaño de un micrómetro durante el posterior proceso de curado o reticulación¹⁰. En comparación con el método tradicional, el electrospray microfluídico ofrece un control preciso del tamaño y la morfología de las partículas de las microesferas mediante el ajuste de parámetros como el caudal de la solución, el voltaje y el tamaño fino de la boquilla¹¹. También permite la preparación continua de microesferas a alta velocidad, mejorando la eficiencia de la preparación y manteniendo condiciones de reacción suaves. Además, los ALGMS pueden prepararse para poseer diversas funciones, como fármacos de liberación controlada y catalizadores cargados, lo que permite su fácil aplicación en diversos campos.

En este trabajo se presenta un protocolo para la preparación de microesferas de ALG mediante el método de electrospray microfluídico. El proceso consiste en hacer pasar una solución de ALG a través de un dispositivo microfluídico y someterla a electropulverización. Las gotas resultantes se recogieron en la solución que contenía diferentes iones metálicos (Ca²⁺, Cu²⁺, Zn²⁺ y Fe³⁺) para iniciar la reacción de reticulación. Esta reacción mejora la estabilidad y adherencia de las microesferas y las dota de diferentes funcionalidades. Este método es fácil de realizar y las microesferas sintetizadas exhiben una buena uniformidad de tamaño en su morfología. Además, investigamos sus propiedades antimicrobianas, su lenta capacidad de liberación de fármacos y su biocompatibilidad. Este protocolo será útil para el desarrollo y la producción de fármacos.

Protocolo

La sangre utilizada en los experimentos se obtuvo de ratones hembra BALB/c de grado SPF con un peso de 20-25 g y aproximadamente 7 semanas de edad. El Comité de Ética de Experimentación Animal del Colegio Zhejiang Shuren aprobó todos los procedimientos experimentales y de cuidado animal.

1. Preparación de la solución

1. Pesar el ALG y disolverlo en agua ultrapura agitándolo en un baño de agua a 50 °C para obtener una solución de ALG al 2%.
2. Prepare por separado la fracción de masa con soluciones al 5% (o la concentración de masa molar es de 0,3 M) de CaCl₂, FeCl₃, ZnSO₄ y CuSO₄ en agua ultrapura. Vierta cada solución por separado en un plato colector.

2. Dispositivo de electropulverización microfluídica

1. Tome un tubo capilar de vidrio y colóquelo sobre la llama de un soplete para que se ablande, luego estírelo a varios diámetros (50 μm-500 μm). Corta las partes finas con un cortador de vidrio y pule suavemente el puerto de la punta con papel de lija de carburo de silicona de alta calidad. Después de la limpieza, conecte el extremo grueso del tubo capilar a un tubo largo y el otro extremo del tubo a una aguja dispensadora y una jeringa de 5 ml (Figura complementaria 1).
   NOTA: Los bordes afilados de los cortes de los tubos de vidrio son difíciles de insertar en la manguera; Por lo tanto, la rotura debe redondearse en el borde de la llama.
2. Conecte la jeringa a la bomba de jeringa microfluídica y el tubo capilar en un extremo al soporte. Conecte el clip rojo de alto voltaje de la fuente de alimentación de alto voltaje a la aguja dispensadora de la jeringa y coloque el clip plateado en el líquido de recolección. Esta configuración crea un dispositivo de electropulverización microfluídica simple (Figura 1A).
   NOTA: Coloque el tubo capilar perpendicular a la mesa.

3. Preparación de microesferas de ALG

1. Coloque los platos de recogida selectiva que contienen diferentes iones metálicos directamente debajo del tubo capilar. Encienda la bomba de jeringa microfluídica y seleccione Avance rápido para cebar el tubo con el ALG, luego configure el caudal adecuado (2 mL/h).
2. Encienda el interruptor de alimentación de alto voltaje y gire la perilla para configurar el voltaje apropiado (5-7 kV).
3. Agregue 20 mL de solución a cada una de las placas de Petri de 90 mm para recolectar microesferas de ALG y formar ALGMS reticulados con diferentes iones metálicos (Figura 1B).
4. ALG forma microesferas bajo la acción del campo eléctrico y la gravedad en diferentes soluciones colectoras de iones en unos pocos segundos. Aspire las microesferas con una pipeta esterilizada y transfiéralas a tubos de centrífuga individuales de 1,5 ml para obtener microesferas de hidrogel de Zn²⁺, Ca²⁺, Cu²⁺ y Fe³⁺ -ALG (Figura 1C). Etiquete los tubos de Zn-ALGMS, Ca-ALGMS, Cu-ALGMS y Fe-ALGMS.
   NOTA: Se pueden obtener microesferas de diferentes diámetros ajustando parámetros como el voltaje, el diámetro de la punta, el caudal y la concentración de la solución.
5. Tome una pequeña cantidad de las microesferas preparadas, distribúyalas lo más uniformemente posible en PBS y colóquelas bajo un microscopio para su visualización.
6. Seleccionado al azar 10 campos de observación en el mismo lote de microesferas, importe las imágenes que se medirán en el software ImageJ, convierta las imágenes al modo de escala de grises apropiado y utilice la tecnología de segmentación de umbral para definir con precisión el área de las partículas objetivo e iniciar la función de análisis de las partículas para que ImageJ pueda identificar y medir las partículas objetivo. Obtenga datos sobre las microesferas y luego importe los datos al software Origin para el análisis y el mapeo del tamaño de las partículas.

4. Prueba de rendimiento antimicrobiano

1. Prepare suspensiones de 5 mL de Staphylococcus aureus (S. aureus) y Escherichia coli (E. coli) con una turbidez bacteriana inicial de 0,2 mcF utilizando un medio líquido Luria-Bertani (LB).
2. Agregue 10 mL de cada solución bacteriana a 4 tubos de centrífuga estériles individuales de 15 mL. A continuación, añada 0,5 mL de Zn-ALGMS, Ca-ALGMS, Cu-ALGMS y Fe-ALGMS ALG a cada tubo y colóquelos en un agitador de temperatura constante a 37 °C y 200 rpm durante 12 h. Agregue una cantidad igual de solución salina al grupo de control.
3. Diluya cada solución bacteriana de 10^{a 5} veces con agua estéril. Utilice una perla de vidrio estéril para esparcir 200 μL de solución bacteriana en un medio sólido LB.
4. Extienda la solución rápida y uniformemente sobre la placa de recubrimiento, evitando ir y venir en la misma área. A continuación, coloque las placas en una incubadora a 37 °C durante 12 h. Observa las colonias de diferentes grupos.
   NOTA: Todos los procedimientos asépticos deben realizarse cerca de una lámpara de alcohol. Esterilice los recipientes de cultivo microbiano, los utensilios de inoculación y los medios de cultivo.

5. Pruebas de liberación de drogas

1. Para evaluar la capacidad de liberación de fármacos de diferentes microesferas, utilice la albúmina sérica bovina (BSA) como fármaco modelo cargado. Añadir 500 μL de cada microesfera (Ca-ALGMS, Cu-ALGMS, Zn-ALGMS y Fe-ALGMS) a 1 mg/mL de suspensión de BSA durante 24 h.
2. Para el ensayo de liberación del fármaco, añadir cada muestra saturada a 5,0 M de solución salina tamponada con fosfato (PBS; pH 7,4), seguida de agitación durante 15 min a 37 °C con agitación continua a 80 rpm.
3. Utilice 100 μL de la solución y sustituya el medio por uno nuevo a las 1, 3, 6, 12, 24, 36 y 48 h.
4. Cuantifique las concentraciones de proteínas sobrenadantes en momentos específicos utilizando un kit de BCA según las instrucciones del fabricante. Mida cuantitativamente el fármaco liberado por marcador enzimático para obtener la absorbancia correspondiente y convierta el valor medido en la concentración real del fármaco de acuerdo con la curva estándar. Calcule la tasa de liberación del fármaco utilizando la siguiente fórmula:
   Porcentaje de liberación del fármaco = (concentración del fármaco liberado en un momento específico / concentración inicial del fármaco) x 100%
5. A intervalos regulares, retire un volumen igual de PBS de cada pocillo y reemplácelo con un volumen igual de medio fresco.

6. Prueba de hemólisis

1. Coloque los Ca-ALGMS, Cu-ALGMS, Zn-ALGMS y Fe-ALGMS preparados en PBS e incube a 37 °C durante 24 h para formular la solución de incubación.
2. Obtención de sangre completa de ratones BALB/c sanos mediante flebotomía ocular, recogida en tubos anticoagulados que contienen citrato de sodio. Vórtice y centrífuga a 1509 x g durante 15 min para obtener glóbulos rojos.
3. Enjuague los glóbulos rojos 2x-3x con PBS y prepare una solución de glóbulos rojos al 10% con PBS.
4. Preparación de varios ALGMS: Tomar 500 μL de cada microesfera para el grupo experimental, 1 mL de agua ultrapura (ddH₂O) para el grupo de control positivo y 1 mL de solución de PBS para el grupo de control negativo y mezclar cada uno con 20 μL de solución de glóbulos sanguíneos.
5. Incubar las muestras a 37 °C durante 4 h, centrifugar a 1509 x g, 15 min. Mantenga el sobrenadante a un lado y fotografíe los glóbulos rojos de cada grupo después de la hemólisis.
6. Tome la tasa de hemólisis del grupo de control positivo como 100% y la del grupo de control negativo como 0%. Mida los valores de absorbancia de los sobrenadantes en cada grupo y calcule la tasa de hemólisis usando la fórmula:
   Hemólisis (%) = (Valores de absorbancia de los sobrenadantes de cada grupo-
   Valores de absorbancia del agua destilada sola) / (Valores de absorbancia del grupo de control positivo- Valores de absorbancia del agua destilada sola) x 100

7. Prueba de citobiocompatibilidad

1. Lave los diferentes ALGMS 2 veces con PBS y colóquelos en una placa de Petri de 5 mL durante 15 min y deseche el sobrenadante.
2. Añadir por separado diferentes ALGMS a 0,2 mL en medio de cultivo completo (DMEM) que contenga un 10% de FBS, incubar a 37 °C durante 24 h y filtrar la solución para obtener el lixiviado.
3. Cultive las células NIH3T3 hasta aproximadamente el 70% de densidad celular en placas de 24 pocillos, trate las células NIH3T3 con una solución de lixiviación de microesferas y continúe cultivando con medio completo durante otras 24 h.
4. Retire el medio de cultivo celular y lave las células con PBS.
5. Evalúe la viabilidad celular mediante el ensayo Calcein-AM/PI. Tome 2,5 μL de solución de Calceína-AM (4 mM) y 12,5 μL de solución de PI (2 mM) y añádalos a 5 mL de 1x PBS y mezcle bien para obtener una solución de trabajo con 2 μM de Calceína-AM y 5 μM de PI.
6. Añadir la solución de trabajo a placas de cultivo celular previamente sembradas a 500 μL por pocillo, incubar a 37 °C bajo protección lumínica durante 15 min, y observar y fotografiar bajo un microscopio de fluorescencia invertida. Configure tres réplicas para cada grupo.
7. Calcule la viabilidad celular de acuerdo con la siguiente fórmula:
   Viabilidad celular (%) = número de células viables / (número de células viables + número de células muertas)

Resultados

Caracterización de ALGMS reticulados con diferentes iones metálicos
La morfología óptica de Ca-ALGMS, Cu-ALGMS, Zn-ALGMS y Fe-ALGMS se muestra en la Figura 2, exhibiendo buena esfericidad, superficie lisa, distribución uniforme del tamaño de partícula (Figura suplementaria 2) y excelente monodispersidad. Además, realizamos la caracterización microscópica mediante microscopía electrónica de barrido (SEM) y análisis de espectroscopia de dispers...

Discusión

En este protocolo, presentamos un método para la preparación de ALGMS basado en la tecnología de electrospray microfluídico. El método es fácil de operar y produce una gran cantidad de microesferas con una redondez uniforme y un diámetro controlable. Este enfoque ofrece comodidad a los investigadores y puede promover la investigación y la aplicación de microesferas de hidrogel. Además, al reticulación con diferentes iones metálicos, se mejoró la estabilidad y bioactividad de los ALGMS. En los experimentos an...

Materiales

Name	Company	Catalog Number	Comments
120 mesh screen	Solarbio,China	YA0946
Alcohol burner	Solarbio,China	YA2320
BALB/c mice	Wukong Biotechnology,China
Bicinchoninic Acid Assay reagent	Meilunbio,China	MA0082
Bovine Serum Albumin	Lablead,China	9048-46-8
CaCl2  powder	Aladdin,China	10043-52-4
Calcein-AM/PI	Biosharp,China	BL130A
Centrifuge tubes	Corning,America	430290
CuSO4  powder	Jnxinyuehuagong,China	7758-99-8
DMEM	Gibicol,China	C11995500BT
FeCl3  powder	Aladdin,China	7705-08-0
Fetal Bovine Serum	HAKATA,China	HN-FBS
Glass tubes	Sartorius,Germany	CC0028
Light microscopy	Evidentscientific,Japan	BX53(LED)
Microfluidic syringe pump	Longerpump,England	LSP01-3A
NIH3T3	HyGyte,China	TCM-C752
Petri dish	Thermofisher,America	150464
Phosphate buffer saline	Thermofisher,America	3002
Scanning electron microscope	Thermofisher,America	Axia ChemiSEM
Sodium alginate powder	Bjbalb,China	Y13095
ZnSO4 powder	Jnxinyuehuagong,China	7733-02-0