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요약

이 프로토콜은 약물 전달체 설계를 위한 미세유체 장치를 사용하여 서로 다른 금속 이온과 가교된 알긴산 나트륨 미세구를 준비하는 방법을 설명합니다. 이러한 마이크로스피어의 항균 특성과 느린 약물 방출도 조사되었습니다.

초록

마이크로스피어는 마이크로미터 크기의 입자로, 물리적 캡슐화 또는 흡착을 통해 폴리머 표면과 폴리머 내에 약물을 로드하고 점진적으로 방출할 수 있습니다. 생물 의학 분야에서 하이드로겔 마이크로스피어는 약물 투여 빈도를 줄이고 부작용을 최소화하며 환자 순응도를 개선하는 능력으로 인해 약물 전달체로서의 응용을 위해 광범위하게 연구되었습니다. 알긴산나트륨(ALG)은 3개의 백본 글리코시드 결합을 가진 자연 발생 선형 다당류입니다. 중합체의 각 부분에는 두 개의 보조 수산기가 존재하며, 이들은 알코올 수산기 부분의 특성을 갖는다. 합성 ALG 단위는 금속 이온과 화학적 가교 반응을 거쳐 폴리머 스택의 가교 네트워크 구조를 형성하여 궁극적으로 하이드로겔을 형성할 수 있습니다. 하이드로겔 마이크로스피어는 ALG의 이온 가교 특성과 관련된 간단한 공정을 사용하여 준비할 수 있습니다. 이 연구에서는 미세유체 전착 전략을 사용하여 ALG 기반 하이드로겔 미세구(ALGMS)를 준비했습니다. 제조된 하이드로겔 마이크로스피어는 미세유체 전기분무 흐름의 정확한 제어로 인해 크기가 균일하고 잘 분산되었습니다. 미세유체와 고전기장을 결합한 미세유체 전기분무 기법을 이용하여 서로 다른 금속 이온과 가교결합된 ALGMS를 제조하였으며, 항균 특성, 느린 약물 방출 능력, 생체 적합성을 조사하였다. 이 기술은 첨단 약물 개발 및 생산에 적용할 수 있는 가능성을 가지고 있습니다.

서문

약물 전달 시스템은 약물 전달 효율과 효능을 개선하고 부작용 및 부작용을 줄이는 것을 목표로 하는 생체 조직 공학 분야의 연구 핫스팟입니다1. 이러한 시스템 중 우수한 생체 적합성, 조정 가능한 기계적 특성 및 기능적 가소성을 특징으로 하는 하이드로겔 마이크로스피어는 약물 적재 및 전달에 가장 일반적으로 사용되는 수단 중 하나입니다2. 약물의 느린 방출과 제어된 방출 모두에 사용할 수 있고, 약물에 대한 우수한 보호 효과를 제공하고, 다른 조직에서 약물의 비특이적 효과를 피하거나 최소화하고, 특정 조직 구조에 대한 약물 전달을 목표로 할 수 있습니다3. 따라서 하이드로겔 마이크로스피어는 새롭고 효율적인 약물 전달 시스템이 되었으며, 이 분야의 연구가 점차 부상하고 있습니다4.

하이드로겔 마이크로스피어는 일반적으로 다당류, 단백질 및 천연 고분자를 포함한 생분해성 물질로부터 합성됩니다5. 그 중 ALG는 해양 갈조류에서 추출한 생체 적합성, 생분해성 다당류입니다6. 분자 사슬에는 대부분의 2가 또는 다가 양이온과 가교 결합하여 3차원 네트워크를 가진 불용성 하이드로겔 구조를 형성할 수 있는 유리 수산기 및 카르복실기가 포함되어 있습니다5. ALG에 의해 형성된 하이드로겔 마이크로스피어는 중성 및 알칼리성 용액에서 음전하를 띤 고분자 전해질로 전환될 수 있습니다. 음전하 사이의 이러한 반발력으로 인해 미세구가 팽창하여 캡슐화된 활성 성분 또는 약물이 방출될 수 있습니다. 이러한 특성으로 인해 ALG 마이크로스피어는 약물 로딩 및 방출 조절에 널리 사용되는 유망한 약물 전달체로 고려되었다7.

하이드로겔 마이크로스피어의 제조를 위한 다양한 방법이 존재합니다. 전통적인 ALGMS 제조 방법에는 일반적으로 졸-겔 방법 또는 에멀젼-졸 방법이 포함됩니다. 이러한 방법은 표적 마이크로스피어(8)를 얻기 위한 침전(precipitation), 공용전(co-precipitation) 및 겔화 반응(gelation reaction)과 같은 단계를 포함한다. 최근 몇 년 동안 미세유체 기술의 지속적인 발전으로 미세유체 전기분무 방법은 점차 효율적이고 정밀한 미세구 제조 방법9가 되었습니다. 이 방법은 미세유체 기술을 활용하여 미세미세 노즐을 통해 폴리머 용액을 전기 분무하여 후속 경화 또는 가교 공정10 동안 마이크로미터 크기의 액적 및 미세구를 형성합니다. 기존 방법과 비교하여 미세유체 전기 분무는 용액 유량, 전압 및 미세 노즐 크기11과 같은 매개변수를 조정하여 미세구 입자 크기 및 형태를 정밀하게 제어할 수 있습니다. 또한 마이크로스피어를 고속으로 연속적으로 준비할 수 있어 준비 효율성을 개선하고 온화한 반응 조건을 유지할 수 있습니다. 또한, ALGMS는 서방성 약물, loaded catalyst 등 다양한 기능을 보유할 수 있도록 제조할 수 있어 다양한 분야에서 쉽게 응용할 수 있습니다.

여기에서는 미세유체 전기분무 방법을 사용하여 ALG 마이크로스피어를 제조하기 위한 프로토콜을 제시합니다. 이 과정에는 미세유체 장치를 통해 ALG 용액을 통과시키고 전기 분무를 실시하는 것이 포함됩니다. 생성된 액적을 서로 다른 금속 이온(Ca2+, Cu2+, Zn2+ 및 Fe3+)을 포함하는 용액에 수집하여 가교 반응을 시작했습니다. 이 반응은 마이크로스피어의 안정성과 접착력을 향상시키고 다양한 기능을 부여합니다. 이 방법은 수행하기 쉽고 합성된 마이크로스피어는 형태에서 우수한 크기 균일성을 나타냅니다. 또한 항균 특성, 느린 약물 방출 능력 및 생체 적합성을 조사했습니다. 이 프로토콜은 향후 약물 개발 및 생산에 유용할 것입니다.

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프로토콜

실험에 사용된 혈액은 체중이 20-25g이고 약 7주령인 SPF 등급 BALB/c 암컷 마우스에서 얻은 것입니다. Zhejiang Shuren College의 동물 실험 윤리 위원회는 모든 동물 보호 및 실험 절차를 승인했습니다.

1. 솔루션 준비

  1. ALG의 무게를 측정하고 50°C의 수조에서 저어 2% ALG 용액을 얻기 위해 초순수에 용해시킵니다.
  2. 초순수에서 CaCl2, FeCl3, ZnSO4 및 CuSO5 의 5%(또는 몰 질량 농도가 0.3M) 용액으로 질량 분율을 별도로 준비합니다. 각 용액을 수집 접시에 개별적으로 붓습니다.

2. Microfluidic electrospray 장치

  1. 유리 모세관을 가져 와서 토치 화염 위에 올려 놓고 부드럽게한 다음 다양한 직경 (50 μm-500 μm)으로 늘립니다. 유리 절단기로 미세한 부분을 잘라내고 고품질 탄화규소 사포로 팁 포트를 부드럽게 연마합니다. 세척 후 모세관의 두꺼운 끝을 긴 튜브에 연결하고 튜브의 다른 쪽 끝을 디스펜싱 바늘과 5mL 주사기에 연결합니다(보충 그림 1).
    알림: 유리관 절단의 날카로운 모서리는 호스에 삽입하기 어렵습니다. 따라서 브레이크는 화염 가장자리에서 둥글게 처리되어야 합니다.
  2. 주사기를 미세유체 주사기 펌프에 부착하고 모세관 튜브의 한쪽 끝을 홀더에 부착합니다. 빨간색 고전압 엔드 클립을 연결합니다.tage 전원 공급 장치의 끝 클립을 주사기의 분배 바늘에 연결하고 은색 클립을 수집 유체에 넣습니다. 이 구성은 간단한 미세유체 전기 분무 장치를 생성합니다(그림 1A).
    알림: 모세관을 테이블에 수직으로 놓습니다.

3. ALG 마이크로스피어 준비

  1. 다른 금속 이온이 포함된 별도의 수집 접시를 모세관 바로 아래에 놓습니다. 미세유체 주사기 펌프를 켜고 빨리 감기를 선택하여 ALG로 튜브를 프라이밍한 다음 적절한 유속(2mL/h)을 설정합니다.
  2. 고전압 전원 스위치를 켜고 손잡이를 돌려 적절한 전압(5-7kV)을 설정합니다.
  3. 90mm 페트리 접시 각각에 20mL 용액을 추가하여 ALG 마이크로구를 수집하여 서로 다른 금속 이온과 가교 결합된 ALGMS를 형성합니다(그림 1B).
  4. ALG는 전기장과 중력의 작용으로 몇 초 내에 다양한 이온 수집 용액에서 미세구를 형성합니다. 멸균된 피펫으로 마이크로스피어를 흡입하고 개별 1.5mL 원심분리기 튜브로 옮겨 Zn2+, Ca2+, Cu2+ 및 Fe3+ -ALG 하이드로겔 마이크로스피어를 얻습니다(그림 1C). Zn-ALGMS, Ca-ALGMS, Cu-ALGMS 및 Fe-ALGMS 튜브에 라벨을 부착합니다.
    참고: 직경이 다른 마이크로스피어는 전압, 팁 직경, 유속 및 용액 농도와 같은 매개변수를 조정하여 얻을 수 있습니다.
  5. 준비된 마이크로스피어를 소량 가져다가 PBS에 가능한 한 고르게 분산시키고 시각화를 위해 현미경 아래에 놓습니다.
  6. 동일한 마이크로스피어 배치에서 무작위로 선택된 10개의 관찰 필드를 측정할 이미지를 ImageJ 소프트웨어로 가져오고, 이미지를 적절한 그레이스케일 모드로 변환하고, 임계값 세분화 기술을 사용하여 대상 입자의 면적을 정확하게 정의하고 입자 분석 기능을 시작하여 ImageJ가 대상 입자를 식별하고 측정할 수 있도록 합니다. 마이크로스피어에 대한 데이터를 얻은 다음 분석 및 입자 크기 매핑을 위해 데이터를 Origin 소프트웨어로 가져옵니다.

4. 항균 성능 시험

  1. 액체 Luria-Bertani(LB) 배지를 사용하여 초기 박테리아 탁도가 0.2mcF인 황색포도상구균 (S. aureus) 및 대장 균(E. coli)의 5mL 현탁액을 준비합니다.
  2. 각 박테리아 용액 10mL를 4개의 개별 15mL 멸균 원심분리 튜브에 추가합니다. 그런 다음 각 튜브에 0.5mL의 Zn-ALGMS, Ca-ALGMS, Cu-ALGMS 및 Fe-ALGMS ALG를 추가하고 37°C 및 200rpm의 항온 셰이커에 12시간 동안 넣습니다. 대조군에 같은 양의 식염수를 추가합니다.
  3. 멸균수로 각 박테리아 용액을 105 번 희석합니다. 멸균 유리 비드를 사용하여 LB 고체 매체에 200μL의 박테리아 용액을 펴 바릅니다.
  4. 용액을 코팅판에 빠르고 고르게 펴 바르고 같은 영역에서 앞뒤로 움직이지 않도록 합니다. 그런 다음 플레이트를 37°C의 인큐베이터에 12시간 동안 넣습니다. 다른 그룹의 식민지를 관찰하십시오.
    알림: 모든 무균 절차는 알코올 램프 근처에서 수행해야 합니다. 미생물 배양 용기, 접종 기구 및 배양 배지를 멸균합니다.

5. 약물 방출 테스트

  1. 다양한 마이크로스피어의 약물 방출 능력을 평가하려면 소 혈청 알부민(BSA)을 로드된 모델 약물로 사용하십시오. 각 마이크로스피어(Ca-ALGMS, Cu-ALGMS, Zn-ALGMS 및 Fe-ALGMS) 500μL를 24시간 동안 1mg/mL BSA 현탁액에 추가합니다.
  2. 약물 방출 분석을 위해 각 포화 샘플을 5.0M의 인산염 완충 식염수(PBS, pH 7.4)에 첨가한 다음 37°C에서 80rpm에서 연속 진탕하면서 15분 동안 교반합니다.
  3. 100μL의 용액을 사용하고 1, 3, 6, 12, 24, 36 및 48시간 때 배지를 새 것으로 교체합니다.
  4. 제조업체의 지침에 따라 BCA 키트를 사용하여 특정 시간에 상층액 단백질 농도를 정량화합니다. 효소 마커로 방출된 약물을 정량적으로 측정하여 해당 흡광도를 얻고 측정값을 표준 곡선에 따라 실제 약물 농도로 변환합니다. 다음 공식을 사용하여 약물 방출 속도를 계산하십시오.
    약물 방출 비율 = (특정 시점에서 방출된 약물 농도 / 초기 약물 농도) x 100%
  5. 정기적으로 각 웰에서 동일한 양의 PBS를 제거하고 동일한 양의 새 매체로 교체합니다.

6. 용혈 검사

  1. 준비된 Ca-ALGMS, Cu-ALGMS, Zn-ALGMS 및 Fe-ALGMS를 PBS에 넣고 37°C에서 24시간 동안 배양하여 배양 용액을 배양합니다.
  2. 구연산나트륨이 함유된 항응고 튜브에 수집된 안구 정맥 절개술을 통해 건강한 BALB/c 마우스에서 전혈을 얻습니다. 볼텍스와 원심분리기를 1509 x g 에서 15분 동안 하여 적혈구를 얻습니다.
  3. PBS로 적혈구를 2x-3x 플러시하고 PBS로 10% 적혈구 용액을 준비합니다.
  4. 다양한 ALGMS 준비: 실험군에 대해 각 마이크로스피어 500μL, 양성 대조군에 대해 1mL 초순수(ddH2O), 음성 대조군에 대해 1mL의 PBS 용액을 각각 20μL의 혈액 세포 용액과 혼합합니다.
  5. 37°C에서 4시간 동안 시료를 배양하고 1509 x g에서 원심분리기를 15분 동안 배양합니다. 상층액을 따로 보관하고 용혈 후 각 그룹의 적혈구를 촬영합니다.
  6. 양성 대조군의 용혈률을 100%로, 음성 대조군의 용혈률을 0%로 취합니다. 각 그룹에서 상층액의 흡광도 값을 측정하고 다음 공식을 사용하여 용혈률을 계산합니다.
    용혈(%) = (각 그룹의 상층액의 흡광도 값-
    증류수 단독 흡광도 값) / (양성 대조군의 흡광도 값 - 증류수 단독 흡광도 값) x 100

7. 세포생체적합성 검사

  1. 다른 ALGMS를 PBS로 2x 세척하고 5mL 페트리 접시에 15분 동안 넣고 상층액을 버립니다.
  2. 10% FBS를 함유한 완전 배양 배지(DMEM)에 0.2mL의 다른 ALGMS를 별도로 추가하고 37°C에서 24시간 동안 배양한 다음 용액을 여과하여 침출수를 얻습니다.
  3. 24웰 플레이트에서 NIH3T3 세포를 약 70%의 세포 밀도로 배양하고, NIH3T3 세포를 마이크로스피어 침출 용액으로 처리하고, 완전한 배지로 24시간 동안 계속 배양합니다.
  4. 세포 배양 배지를 제거하고 PBS로 세포를 세척합니다.
  5. Calcein-AM/PI 분석을 사용하여 세포 생존율을 평가합니다. 2.5μL의 Calcein-AM 용액(4mM)과 12.5μL의 PI 용액(2mM)을 5mL의 1x PBS에 넣고 잘 섞어 2μM Calcein-AM 및 5μM PI가 있는 작동 용액을 얻습니다.
  6. 웰당 500μL로 이전에 파종된 세포 배양 플레이트에 작업 용액을 추가하고, 37°C에서 15분 동안 빛을 차단하여 배양하고, 도립 형광 현미경으로 관찰하고 사진을 촬영합니다. 각 그룹에 대해 3번의 반복실험을 설정합니다.
  7. 다음 공식에 따라 세포 생존율을 계산하십시오.
    세포 생존율(%) = 생존 가능한 세포의 수 / (생존 가능한 세포의 수 + 죽은 세포의 수)

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결과

다양한 금속 이온과 가교 결합된 ALGMS의 특성 분석
Ca-ALGMS, Cu-ALGMS, Zn-ALGMS 및 Fe-ALGMS의 광학 형태는 그림 2와 같으며, 우수한 구형도, 매끄러운 표면, 균일한 입자 크기 분포(보충 그림 2) 및 우수한 단분산성을 나타냅니다. 또한 주사전자현미경(SEM) 및 에너지 분산 분광법(EDS) 분석을 사용하여 현미경 특성 분석을 수행했습니다. 그림 3<...

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토론

이 프로토콜에서는 미세유체 전기분무 기술을 기반으로 ALGMS를 준비하는 방법을 제시합니다. 이 방법은 작동이 간단하고 균일한 진원도와 제어 가능한 직경을 가진 많은 수의 마이크로구를 생성합니다. 이 접근 방식은 연구자에게 편의성을 제공하고 하이드로겔 마이크로스피어의 연구 및 응용을 촉진할 수 있습니다. 또한 다른 금속 이온과 가교함으로써 ALGMS의 안정성과 생체 활성을 향상시켰습?...

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공개

이해 상충은 공개되지 않습니다.

감사의 말

이 연구는 Zhejiang Shuren University 연구 프로젝트(2023R053 및 2023KJ237)의 지원을 받았습니다.

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자료

NameCompanyCatalog NumberComments
120 mesh screenSolarbio,ChinaYA0946
Alcohol burnerSolarbio,ChinaYA2320
BALB/c miceWukong Biotechnology,China
Bicinchoninic Acid Assay reagentMeilunbio,ChinaMA0082
Bovine Serum AlbuminLablead,China9048-46-8
CaCl2  powderAladdin,China10043-52-4
Calcein-AM/PIBiosharp,ChinaBL130A
Centrifuge tubesCorning,America430290
CuSO4  powderJnxinyuehuagong,China7758-99-8
DMEMGibicol,ChinaC11995500BT
FeCl3  powderAladdin,China7705-08-0
Fetal Bovine SerumHAKATA,ChinaHN-FBS
Glass tubesSartorius,GermanyCC0028
Light microscopyEvidentscientific,JapanBX53(LED)
Microfluidic syringe pumpLongerpump,EnglandLSP01-3A
NIH3T3HyGyte,ChinaTCM-C752
Petri dishThermofisher,America150464
Phosphate buffer salineThermofisher,America3002
Scanning electron microscopeThermofisher,AmericaAxia ChemiSEM
Sodium alginate powder Bjbalb,ChinaY13095
ZnSO4 powderJnxinyuehuagong,China7733-02-0

참고문헌

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