Herstellung von vernetzten Natriumalginat-Mikrosphären mit unterschiedlichen Metallionen unter Verwendung der mikrofluidischen Elektrospray-Technologie

Zusammenfassung

Das Protokoll beschreibt die Herstellung von Natriumalginat-Mikrosphären, die mit verschiedenen Metallionen vernetzt sind, unter Verwendung eines mikrofluidischen Geräts für das Wirkstoffträgerdesign. Untersucht wurden auch die antimikrobiellen Eigenschaften und die langsame Wirkstofffreisetzung dieser Mikrosphären.

Zusammenfassung

Mikrosphären sind mikrometergroße Partikel, die Medikamente durch physikalische Verkapselung oder Adsorption auf die Oberfläche und innerhalb von Polymeren laden und allmählich freisetzen können. Im Bereich der Biomedizin wurden Hydrogel-Mikrosphären aufgrund ihrer Fähigkeit, die Häufigkeit der Arzneimittelverabreichung zu reduzieren, Nebenwirkungen zu minimieren und die Compliance der Patienten zu verbessern, umfassend auf ihre Anwendung als Arzneimittelträger untersucht. Natriumalginat (ALG) ist ein natürlich vorkommendes lineares Polysaccharid mit drei glykosidischen Rückgratbindungen. In jeder der Einheiten des Polymers sind zwei Hilfshydroxylgruppen vorhanden, die die Eigenschaften einer Alkoholhydroxyleinheit aufweisen. Die synthetischen ALG-Einheiten können chemische Vernetzungsreaktionen mit Metallionen durchlaufen, wodurch eine vernetzte Netzwerkstruktur aus Polymerstapeln gebildet wird, die schließlich ein Hydrogel bildet. Hydrogel-Mikrosphären können mit einem einfachen Verfahren hergestellt werden, bei dem die ionischen Vernetzungseigenschaften von ALG genutzt werden. In dieser Studie haben wir ALG-basierte Hydrogel-Mikrosphären (ALGMS) unter Verwendung einer mikrofluidischen Elektroabscheidungsstrategie hergestellt. Die vorbereiteten Hydrogel-Mikrosphären waren gleichmäßig dimensioniert und gut dispergiert, was auf eine genaue Kontrolle des mikrofluidischen Elektrospray-Flusses zurückzuführen ist. ALGMS, die mit verschiedenen Metallionen vernetzt sind, wurden unter Verwendung einer mikrofluidischen Elektrospray-Technik hergestellt, die Mikrofluidik und hohes elektrisches Feld kombiniert, und ihre antimikrobiellen Eigenschaften, ihre langsame Wirkstofffreisetzungsfähigkeit und ihre Biokompatibilität untersucht. Diese Technologie ist vielversprechend für den Einsatz in der fortschrittlichen Arzneimittelentwicklung und -produktion.

Einleitung

Drug-Delivery-Systeme sind ein Forschungsschwerpunkt auf dem Gebiet des Bio-Tissue Engineering, der darauf abzielt, die Effizienz und Wirksamkeit der Arzneimittelverabreichung zu verbessern und Nebenwirkungen und Nebenwirkungen^{zu reduzieren 1}. Unter diesen Systemen sind Hydrogel-Mikrosphären, die sich durch gute Biokompatibilität, einstellbare mechanische Eigenschaften und funktionelle Plastizität auszeichnen, eines der am häufigsten verwendeten Vehikel für das Laden und Verabreichen von Medikamenten². Sie können sowohl für die langsame als auch für die kontrollierte Freisetzung von Arzneimitteln verwendet werden, bieten eine gute Schutzwirkung für Arzneimittel, vermeiden oder minimieren unspezifische Wirkungen von Arzneimitteln in anderen Geweben und zielen auf die Verabreichung von Arzneimitteln an bestimmte Gewebestrukturen^{ab 3}. Daher sind Hydrogel-Mikrosphären zu einem neuen und effizienten System zur Verabreichung von Medikamenten geworden, wobei die Forschung auf diesem Gebiet nach und nach entsteht⁴.

Hydrogel-Mikrosphären werden in der Regel aus biologisch abbaubaren Materialien synthetisiert, darunter Polysaccharide, Proteine und natürliche Polymere⁵. Unter ihnen ist ALG ein biokompatibles, biologisch abbaubares Polysaccharid, das aus marinen Braunalgen gewonnen^{wird 6}. Seine Molekülkette enthält freie Hydroxyl- und Carboxylgruppen, die mit den meisten zweiwertigen oder mehrwertigen Kationen vernetzen können, um eine wasserunlösliche Hydrogelstruktur mit einem dreidimensionalen Netzwerk^{zu bilden 5}. Die durch ALG gebildeten Hydrogel-Mikrosphären können in neutralen und alkalischen Lösungen in negativ geladene Polyelektrolyte umgewandelt werden. Diese Abstoßung zwischen negativen Ladungen führt dazu, dass die Mikrosphären aufquellen und der verkapselte Wirkstoff oder das Medikament freigesetzt werden kann. Diese Eigenschaften haben dazu geführt, dass ALG-Mikrosphären als vielversprechende Wirkstoffträger angesehen werden, die häufig für das Laden von Wirkstoffen und die kontrollierte Freisetzung eingesetzt werden⁷.

Für die Herstellung von Hydrogel-Mikrosphären existieren verschiedene Methoden. Zu den traditionellen ALGMS-Präparationsmethoden gehören in der Regel die Sol-Gel-Methode oder die Emulsion-Sol-Methode. Diese Verfahren umfassen Schritte wie Fällung, Mitfällung und Gelierungsreaktionen, um die Zielmikrosphären⁸ zu erhalten. In den letzten Jahren hat sich das mikrofluidische Elektrospray-Verfahren mit der kontinuierlichen Entwicklung der Mikrofluidik-Technologie allmählich zu einer effizienten und präzisen Methode zur Herstellung von Mikrosphären^{entwickelt 9}. Bei diesem Verfahren wird die mikrofluidische Technologie verwendet, um eine Polymerlösung durch eine mikrofeine Düse elektrozu sprühen, um mikrometergroße Tröpfchen und Mikrokugeln während des anschließenden Aushärtungs- oder Vernetzungsprozesses¹⁰ zu bilden. Im Vergleich zur herkömmlichen Methode bietet das mikrofluidische Elektrospray eine präzise Kontrolle der Partikelgröße und -morphologie der Mikrosphären durch Anpassung von Parametern wie Lösungsdurchflussrate, Spannung und feiner Düsengröße¹¹. Es ermöglicht auch die kontinuierliche Hochgeschwindigkeitsvorbereitung von Mikrosphären, verbessert die Präparationseffizienz und hält milde Reaktionsbedingungen aufrecht. Darüber hinaus können ALGMS so vorbereitet werden, dass sie verschiedene Funktionen besitzen, wie z. B. Medikamente mit kontrollierter Freisetzung und beladene Katalysatoren, was eine einfache Anwendung in verschiedenen Bereichen ermöglicht.

Im Folgenden stellen wir ein Protokoll für die Herstellung von ALG-Mikrosphären mit dem mikrofluidischen Elektrosprayverfahren vor. Bei diesem Verfahren wird eine ALG-Lösung durch ein mikrofluidisches Gerät geleitet und mit Elektrospray besprüht. Die resultierenden Tröpfchen wurden in der Lösung gesammelt, die verschiedene Metallionen (Ca²⁺, Cu²⁺, Zn²⁺ und Fe³⁺) enthielt, um die Vernetzungsreaktion zu initiieren. Diese Reaktion verbessert die Stabilität und Haftung der Mikrosphären und stattet sie mit unterschiedlichen Funktionalitäten aus. Diese Methode ist einfach durchzuführen, und die synthetisierten Mikrosphären weisen eine gute Größengleichmäßigkeit in ihrer Morphologie auf. Darüber hinaus untersuchten wir ihre antimikrobiellen Eigenschaften, ihre langsame Wirkstofffreisetzungsfähigkeit und ihre Biokompatibilität. Dieses Protokoll wird für die weitere Entwicklung und Produktion von Arzneimitteln nützlich sein.

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Protokoll

Das in den Experimenten verwendete Blut wurde von weiblichen BALB/c-Mäusen mit Lichtschutzfaktor mit einem Gewicht von 20-25 g und einem Alter von etwa 7 Wochen gewonnen. Die Ethikkommission für Tierversuche des Zhejiang Shuren College genehmigte alle Tierpflege- und Versuchsverfahren.

1. Vorbereitung der Lösung

1. ALG wiegen und in Reinstwasser auflösen, indem man in einem Wasserbad bei 50 °C umrührt, um eine 2%ige ALG-Lösung zu erhalten.
2. Die Massenfraktion wird separat mit 5%igen Lösungen (oder molare Massenkonzentration beträgt 0,3 M) von CaCl₂, FeCl₃, ZnSO₄ und CuSO₄ in Reinstwasser hergestellt. Gießen Sie jede Lösung separat in eine Auffangschale.

2. Mikrofluidisches Elektrospray-Gerät

1. Nehmen Sie ein Glaskapillarrohr und legen Sie es über eine Lötlampenflamme, um es zu erweichen, und dehnen Sie es dann auf verschiedene Durchmesser (50 μm-500 μm). Schneiden Sie die feinen Teile mit einem Glasschneider ab und polieren Sie die Spitzenöffnung vorsichtig mit hochwertigem Siliziumkarbid-Schleifpapier. Verbinden Sie nach der Reinigung das dicke Ende des Kapillarschlauchs mit einem langen Schlauch und das andere Ende des Schlauchs mit einer Abgabenadel und einer 5-ml-Spritze (Ergänzende Abbildung 1).
   HINWEIS: Scharfe Kanten von Glasrohrschnitten lassen sich nur schwer in den Schlauch einführen. Daher sollte der Bruch an der Flammenkante abgerundet sein.
2. Befestigen Sie die Spritze an der mikrofluidischen Spritzenpumpe und den Kapillarschlauch an einem Ende an der Halterung. Verbinden Sie den roten Hochspannungs-Endclip des Hochspannungsnetzteils mit der Abgabenadel der Spritze und legen Sie den silbernen Clip in die Auffangflüssigkeit. Diese Konfiguration schafft eine einfache mikrofluidische Elektrospray-Vorrichtung (Abbildung 1A).
   HINWEIS: Platzieren Sie das Kapillarrohr senkrecht zum Tisch.

3. Vorbereitung der ALG-Mikrosphären

1. Stellen Sie die getrennten Auffangschalen mit unterschiedlichen Metallionen direkt unter das Kapillarröhrchen. Schalten Sie die mikrofluidische Spritzenpumpe ein und wählen Sie Schneller Vorlauf , um den Schlauch mit dem ALG zu entlüften, und stellen Sie dann die entsprechende Durchflussrate (2 ml/h) ein.
2. Schalten Sie den Hochspannungsschalter ein und drehen Sie den Drehknopf, um die entsprechende Spannung (5-7 kV) einzustellen.
3. Geben Sie 20 ml Lösung in jede der 90-mm-Petrischale, um ALG-Mikrosphären zu sammeln, die mit verschiedenen Metallionen vernetzt sind (Abbildung 1B).
4. ALG bildet unter Einwirkung des elektrischen Feldes und der Schwerkraft innerhalb weniger Sekunden Mikrosphären in verschiedenen ionensammelnden Lösungen. Aspirieren Sie die Mikrosphären mit einer sterilisierten Pipette und übertragen Sie sie in einzelne 1,5-ml-Zentrifugenröhrchen, um Zn²⁺-, Ca2⁺-, Cu²⁺- und Fe³⁺ -ALG-Hydrogel-Mikrosphären zu erhalten (Abbildung 1C). Markieren Sie die Zn-ALGMS-, Ca-ALGMS-, Cu-ALGMS- und Fe-ALGMS-Rohre.
   HINWEIS: Mikrokugeln mit unterschiedlichen Durchmessern können durch Anpassen von Parametern wie Spannung, Spitzendurchmesser, Durchflussrate und Lösungskonzentration erhalten werden.
5. Nehmen Sie eine kleine Menge der vorbereiteten Mikrokügelchen, verteilen Sie sie so gleichmäßig wie möglich in PBS und legen Sie sie zur Visualisierung unter ein Mikroskop.
6. Wählen Sie 10 zufällig ausgewählte Beobachtungsfelder in derselben Charge von Mikrosphären aus, importieren Sie die zu messenden Bilder in die ImageJ-Software, konvertieren Sie die Bilder in den entsprechenden Graustufenmodus und verwenden Sie die Schwellenwertsegmentierungstechnologie, um den Bereich der Zielpartikel genau zu definieren und die Funktion zur Analyse der Partikel zu starten, damit ImageJ die Zielpartikel identifizieren und messen kann. Erhalten Sie Daten über die Mikrosphären und importieren Sie die Daten dann in die Origin-Software zur Analyse und Partikelgrößenkartierung.

4. Test der antimikrobiellen Wirksamkeit

1. Bereiten Sie 5 ml-Suspensionen von Staphylococcus aureus (S. aureus) und Escherichia coli (E. coli) mit einer anfänglichen bakteriellen Trübung von 0,2 mcF unter Verwendung eines flüssigen Luria-Bertani (LB)-Mediums vor.
2. Geben Sie 10 ml jeder Bakterienlösung in 4 einzelne sterile 15-ml-Zentrifugenröhrchen. Geben Sie dann 0,5 mL Zn-ALGMS, Ca-ALGMS, Cu-ALGMS und Fe-ALGMS ALG in jedes Röhrchen und legen Sie sie 12 h lang bei 37 °C und 200 U/min in einen Schüttler mit konstanter Temperatur. Geben Sie die gleiche Menge Kochsalzlösung in die Kontrollgruppe.
3. Verdünnen Sie jede Bakterienlösung auf 10 bis⁵ Mal mit sterilem Wasser. Verwenden Sie eine sterile Glaskugel, um 200 μl Bakterienlösung auf einem festen LB-Medium zu verteilen.
4. Verteilen Sie die Lösung schnell und gleichmäßig auf der Beschichtungsplatte, vermeiden Sie dabei ein Hin und Her in der gleichen Fläche. Legen Sie dann die Platten für 12 h bei 37 °C in einen Inkubator. Beobachte die Kolonien verschiedener Gruppen.
   HINWEIS: Alle aseptischen Eingriffe sollten in der Nähe einer Alkohollampe durchgeführt werden. Sterilisieren Sie mikrobielle Kulturgefäße, Impfutensilien und Nährmedien.

5. Testen der Wirkstofffreisetzung

1. Um die Wirkstofffreisetzungsfähigkeit verschiedener Mikrosphären zu bewerten, verwenden Sie Rinderserumalbumin (BSA) als beladenes Modellmedikament. Geben Sie 500 μl jeder Mikrosphäre (Ca-ALGMS, Cu-ALGMS, Zn-ALGMS und Fe-ALGMS) für 24 h in 1 mg/ml BSA-Suspension.
2. Für den Wirkstofffreisetzungsassay wird jede gesättigte Probe in 5,0 M phosphatgepufferte Kochsalzlösung (PBS; pH 7,4) gegeben, gefolgt von einem 15-minütigen Rühren bei 37 °C und kontinuierlichem Schütteln bei 80 U/min.
3. Verwenden Sie 100 μl der Lösung und ersetzen Sie das Medium nach 1, 3, 6, 12, 24, 36 und 48 Uhr durch ein frisches.
4. Quantifizieren Sie die überstehenden Proteinkonzentrationen zu bestimmten Zeiten mit einem BCA-Kit gemäß den Anweisungen des Herstellers. Messen Sie das freigesetzte Arzneimittel quantitativ mit Hilfe eines Enzymmarkers, um die entsprechende Absorption zu erhalten, und rechnen Sie den gemessenen Wert gemäß der Standardkurve in die tatsächliche Arzneimittelkonzentration um. Berechnen Sie die Freisetzungsrate des Arzneimittels mit der folgenden Formel:
   Prozentsatz der Wirkstofffreisetzung = (Konzentration des zu einem bestimmten Zeitpunkt freigesetzten Arzneimittels / anfängliche Arzneimittelkonzentration) x 100 %
5. Entfernen Sie in regelmäßigen Abständen das gleiche Volumen PBS aus jeder Vertiefung und ersetzen Sie es durch ein gleiches Volumen frisches Medium.

6. Hämolyse-Test

1. Die vorbereiteten Ca-ALGMS, Cu-ALGMS, Zn-ALGMS und Fe-ALGMS werden in PBS eingelegt und 24 Stunden lang bei 37 °C inkubiert, um die Inkubationslösung zu formulieren.
2. Gewinnung von Vollblut von gesunden BALB/c-Mäusen durch okuläre Phlebotomie, gesammelt in antikoagulierten Röhrchen, die Natriumcitrat enthalten. Vortex und zentrifugieren bei 1509 x g für 15 min, um rote Blutkörperchen zu erhalten.
3. Spülen Sie die roten Blutkörperchen 2x-3x mit PBS und bereiten Sie eine 10%ige Lösung für rote Blutkörperchen mit PBS vor.
4. Herstellung verschiedener ALGMS: Nehmen Sie 500 μl jeder Mikrosphäre für die Versuchsgruppe, 1 ml Reinstwasser (ddH₂O) für die Positivkontrollgruppe und 1 ml PBS-Lösung für die Negativkontrollgruppe und mischen Sie jeweils mit 20 μL Blutzelllösung.
5. Inkubieren Sie die Proben bei 37 °C für 4 h, zentrifugieren Sie sie bei 1509 x g, 15 min. Halten Sie den Überstand beiseite und fotografieren Sie die roten Blutkörperchen in jeder Gruppe nach der Hämolyse.
6. Nehmen Sie die Hämolyserate der positiven Kontrollgruppe mit 100 % und der negativen Kontrollgruppe mit 0 % an. Messen Sie die Absorptionswerte der Überstände in jeder Gruppe und berechnen Sie die Hämolyserate nach folgender Formel:
   Hämolyse (%) = (Absorptionswerte der Überstände jeder Gruppe-
   Absorptionswerte von destilliertem Wasser allein) / (Absorptionswerte der positiven Kontrollgruppe - Absorptionswerte von destilliertem Wasser allein) x 100

7. Test der Zytobiokompatibilität

1. Waschen Sie die verschiedenen ALGMS 2x mit PBS und legen Sie sie für 15 min in eine 5 mL Petrischale und entsorgen Sie den Überstand.
2. Separat werden verschiedene ALGMS mit 0,2 ml in einem vollständigen Kulturmedium (DMEM) mit 10 % FBS zugegeben, 24 Stunden lang bei 37 °C inkubiert und die Lösung filtriert, um das Sickerwasser zu erhalten.
3. Kultivieren Sie NIH3T3-Zellen mit einer Zelldichte von etwa 70 % in 24-Well-Platten, behandeln Sie die NIH3T3-Zellen mit Mikrosphären-Laugungslösung und kultivieren Sie weitere 24 Stunden lang mit vollständigem Medium.
4. Entfernen Sie das Zellkulturmedium und waschen Sie die Zellen mit PBS.
5. Beurteilen Sie die Lebensfähigkeit der Zellen mit dem Calcein-AM/PI-Assay. Nehmen Sie 2,5 μl Calcein-AM-Lösung (4 mM) und 12,5 μl PI-Lösung (2 mM) und fügen Sie sie zu 5 mL 1x PBS hinzu und mischen Sie gut, um eine Arbeitslösung mit 2 μM Calcein-AM und 5 μM PI zu erhalten.
6. Die Arbeitslösung auf zuvor ausgesäte Zellkulturplatten mit 500 μl pro Vertiefung geben, 15 Minuten lang bei 37 °C unter Lichtschutz inkubieren und unter einem inversen Fluoreszenzmikroskop beobachten und fotografieren. Richten Sie drei Replikate für jede Gruppe ein.
7. Berechnen Sie die Zellviabilität nach der folgenden Formel:
   Lebensfähigkeit der Zellen (%) = Anzahl lebensfähiger Zellen / (Anzahl lebensfähiger Zellen + Anzahl toter Zellen)

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Ergebnisse

Charakterisierung von ALGMS, die mit verschiedenen Metallionen vernetzt sind
Die optische Morphologie von Ca-ALGMS, Cu-ALGMS, Zn-ALGMS und Fe-ALGMS ist in Abbildung 2 dargestellt und weist eine gute Sphärizität, eine glatte Oberfläche, eine gleichmäßige Partikelgrößenverteilung (Ergänzende Abbildung 2) und eine ausgezeichnete Monodispersität auf. Darüber hinaus führten wir eine mikroskopische Charakterisierung mit Hilfe der Rasterelektronenmikr...

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Diskussion

In diesem Protokoll stellen wir eine Methode zur Herstellung von ALGMS vor, die auf der mikrofluidischen Elektrospray-Technologie basiert. Das Verfahren ist einfach zu bedienen und liefert eine große Anzahl von Mikrokugeln mit gleichmäßiger Rundheit und kontrollierbarem Durchmesser. Dieser Ansatz bietet Forschern Komfort und kann die Erforschung und Anwendung von Hydrogel-Mikrosphären fördern. Darüber hinaus wurde durch die Vernetzung mit verschiedenen Metallionen die Stabilität und Bioaktivität des ALGMS verbess...

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Materialien

Name	Company	Catalog Number	Comments
120 mesh screen	Solarbio,China	YA0946
Alcohol burner	Solarbio,China	YA2320
BALB/c mice	Wukong Biotechnology,China
Bicinchoninic Acid Assay reagent	Meilunbio,China	MA0082
Bovine Serum Albumin	Lablead,China	9048-46-8
CaCl2  powder	Aladdin,China	10043-52-4
Calcein-AM/PI	Biosharp,China	BL130A
Centrifuge tubes	Corning,America	430290
CuSO4  powder	Jnxinyuehuagong,China	7758-99-8
DMEM	Gibicol,China	C11995500BT
FeCl3  powder	Aladdin,China	7705-08-0
Fetal Bovine Serum	HAKATA,China	HN-FBS
Glass tubes	Sartorius,Germany	CC0028
Light microscopy	Evidentscientific,Japan	BX53(LED)
Microfluidic syringe pump	Longerpump,England	LSP01-3A
NIH3T3	HyGyte,China	TCM-C752
Petri dish	Thermofisher,America	150464
Phosphate buffer saline	Thermofisher,America	3002
Scanning electron microscope	Thermofisher,America	Axia ChemiSEM
Sodium alginate powder	Bjbalb,China	Y13095
ZnSO4 powder	Jnxinyuehuagong,China	7733-02-0