体外胚胎植入模型的建立

摘要

该协议描述了建立简单有效的胚胎植入 体外 模型的方法，用于评估影响胚胎植入过程的相关分子。

摘要

胚胎植入是成功怀孕的第一步。胚胎植入的 体外 模型对于基础生物学研究、药物开发和筛选至关重要。本文提出了一种简单、快速、高效的 胚胎 植入体外模型。在该方案中，我们首先介绍小鼠囊胚获取和人子宫内膜腺癌细胞 （Ishikawa） 植入制剂，然后是小鼠胚胎和 Ishikawa 细胞的共培养方法。最后，我们进行了一项研究，以评估不同浓度的 17-β-雌二醇 （E₂） 和孕酮 （P4） 对基于该模型的胚胎粘附率的影响。我们的研究结果表明，高浓度的 E₂ 显着降低了胚胎粘附，而添加黄体酮可以恢复粘附率。该模型提供了一个简单快速的平台，用于评估和筛选参与粘附过程的分子，例如细胞因子、药物和控制着床和子宫内膜容受性的转录因子。

引言

胚胎植入是成功怀孕的第一步，对于了解其生物学基础和应对不孕症的挑战至关重要。然而，伦理限制对收集人类临床胚胎样本构成了重大限制，阻碍了对怀孕早期人类胚胎与子宫内膜之间复杂相互作用的研究¹。对这些复杂机制的深刻理解对于推进基础生物学研究、药物发现和生殖健康至关重要。

以前的体外模型采用粘附模型，其中单层人子宫内膜上皮细胞 （RL95-2）² 与胚胎替代品（如 BeWo、JAr 或 Jeg-3³ 绒毛膜癌细胞）共培养。然而，球体大小的选择（范围为 70-100 μm）至关重要，因为更大或更小的细胞聚集体可能会影响实验的准确性。值得注意的是，每种制剂中只有 25% 的球体符合合适大小⁴ 的标准，并且与囊胚的生理条件相比存在显着差异。

此外，子宫内膜和囊胚的三维 （3D） 培养系统提供了更具生理相关性的环境⁵，但它们需要高技术专长、细胞生长缓慢、资源和维护成本高、标准化困难和可重复性低⁶。

在该协议中，我们提出了一种经济高效且快速的胚胎植入体外模型，该模型可以在大多数实验室中开发和使用。该方法的总体目标是为在受控环境中研究胚胎和子宫内膜之间的相互作用提供一个可靠且可重复的平台。通过模拟 体外胚胎植入的关键事件，该模型旨在弥合动物模型和临床环境之间的差距，从而实现更精确和有针对性的研究。

与胚胎替代品相比，小鼠囊胚的使用提供了体内胚胎植入过程的更生理相关性的表示⁷。此外，源自人子宫内膜腺癌的 Ishikawa 细胞系具有腺上皮和子宫腔上皮¹ 的混合特性，使其能够表达类似于正常子宫内膜中的酶、结构蛋白和功能性类固醇受体，从而为胚胎植入提供生理相关的底物。共培养系统的简单性和快速性可实现高通量筛选和药物检测 ^8,9,10。通过提供一个强大且可重复的平台，这种方法为促进我们对胚胎植入及其对人类健康影响的理解提供了机会。

研究方案

小鼠处理和实验研究根据上海生物医学与制药技术研究所动物委员会批准的方案进行。确保安全程序: 处理化学品或生物材料时，请始终佩戴适当的个人防护设备 （PPE）。

1. 小鼠胚胎的获取

注意:本节介绍获取小鼠胚胎的过程。成年雌性小鼠 （6-8 周龄，杂交 C57BL/6 和 DBA/2） 在 20-25 °C 和 40-60% 湿度下维持 12 小时光照和 12 小时黑暗的标准环境条件下， 随意提供食物和水。

1. 腹膜内注射雌性小鼠 10 IU 妊娠母马血清促性腺激素 （PMSG），然后以 42-48 小时的间隔注射 10 IU 人绒毛膜促性腺激素 （HCG）。
2. 将每只雌性小鼠与同等年龄的雄性小鼠交配，并在第二天早上检查阴道塞。
   注意:阴道栓是精液在阴道口凝固后形成的浅黄色栓剂块。
3. 通过吸入 CO₂ 对带有阴道塞的雌性小鼠实施安乐死。
4. 打开腹部，找到女性生殖器;用镊子拉伸输卵管、卵巢和脂肪垫;用剪刀剪断输卵管和卵巢;然后，切开输卵管和子宫（图 1）。
5. 将获得的输卵管转移到预装有 M2 培养基的 35 mm 培养皿中。
   注:M2 培养基应在培养箱（37 °C，5% CO₂ ）中预热 30 分钟。
6. 用 25 G 针刺穿扩大的输卵管壶腹，以释放或捏住卵丘-受精卵复合物（图 2）。
7. 使用镊子将卵丘-合子复合物转移到含有 0.5 mg/mL 透明质酸酶的 M2 溶液中，并孵育几分钟直至卵丘细胞解离（图 3）。
8. 使用鸡蛋转移移液管收集受精卵，并在含有 4 mg/mL BSA 的 M2 培养基中洗涤，以去除残留的透明质酸酶、卵丘细胞和杂质。

2. 小鼠胚胎的 体外 培养

注:本节详细介绍了从受精卵到囊胚的 小鼠 胚胎体外培养的过程。KSOM 培养微滴应提前 24 小时制备，以确保温度和气体平衡。

1. 在 35 mm 培养皿的底部准备 12 个 KSOM 培养基微滴，每个微滴的体积为 20 μL。用 3-5 mL 矿物油覆盖微滴（图 4），并将培养皿放入 37 °C 和 5% CO₂ 的培养箱中以平衡。
2. 使用移液管将小鼠胚胎从 M2 培养基转移到 KSOM 培养基中，以进行彻底洗涤。
   注意:此步骤需要具有 37 °C 加热台的立体显微镜。尽量减少在培养箱外处理胚胎的时间。
3. 将洗涤过的胚胎放入准备好的 KSOM 微滴中，并在 37 °C 和 5% CO₂ 下孵育 4 天。
   注:为确保营养充足，每 20 μL 微滴培养 5-10 个胚胎。
4. 根据它们的大小 （100-130 μm）、内细胞质量（内细胞团由许多全部压实的细胞组成）、滋养层细胞的数量（滋养外胚层由许多紧密结合并堆积在一起的细胞组成）和扩张程度（囊胚腔占据胚胎的 80-100%）选择有利的囊胚。

3. 子宫内膜细胞的制备

1. 在生物安全柜内，使用移液管吸出 1 mL 2% 明胶，并将其分配到 12 孔培养板中。轻轻旋转板以确保明胶完全覆盖底部。将板置于 37 °C 培养箱中 30 分钟。然后，吸出多余的明胶，让板底完全干燥。
2. 包被过程完成后，用 DMEM/F12（详见 材料表 ）、1 mM 丙酮酸钠、2 mM L-谷氨酰胺、100 μg/mL 链霉素和 100 IU/mL 青霉素培养人子宫内膜腺癌细胞（Ishikawa），将它们接种到明胶包被的 12 孔板（2 × 10⁵个细胞/孔）中，并孵育 24 小时。

4. 胚胎附着

1. 轻轻地将 5-15 个新鲜囊胚放入含有上一步制备用于共培养的 Ishikawa 细胞的 12 孔板的每个孔中（图 5）。
2. 孵育 48 小时后，在显微镜下观察胚胎以评估其附着状态。要观察胚胎附着，请快速移动板 3 次。未附着的胚胎将在 Ishikawa 细胞表面表现出漂浮或滚动运动。
3. 使用等式 （1） 计算胚胎着床率;使用胚胎粘附率表示植入效果。
   胚胎着床率 = （附着的胚胎数/植入的胚胎总数） × 100% （1）

结果

在辅助生殖技术过程中，受控卵巢过度刺激 （COH） 是关键步骤，与自然周期相比，导致患者的雌激素水平显着升高 10-20 倍以上¹¹。鉴于此，我们询问了高血清雌激素浓度是否会影响新鲜胚胎移植过程中的胚胎着床。基于这个胚胎植入模型，我们研究了不同浓度的 E₂ 和 P4 对胚胎着床率的影响¹²。饥饿处理后，将 Ishikawa 细胞与 E₂ （0、0.1、 1、10 ?...

讨论

所提出的胚胎植入体外模型的简单性和快速性为早期药物筛选和其他研究应用提供了显着的优势。简单的方案，加上 Ishikawa 细胞系的高通量特性，使其成为大规模筛选的理想选择，尤其是在药物发现的早期阶段。Liang¹³ 发现 TAGLN2 敲低降低了滋养层细胞的侵袭能力。Green¹⁴ 表明胰岛素样生长因子提高了基于小鼠胚胎-Ishikawa 细胞系统的小鼠囊胚的粘附能力?...

材料

Name	Company	Catalog Number	Comments
17-β-estradiol	SIGMA	3301	Most potent mammalian estrogenic hormone
BD Falcon	BD	353001	Bacteriological Petri Dishes 35 x 10 mm style w/tight lid, crystal-grade virgin polystyrene, sterile
Biosafety Cabinet	ESCO	class BSC	Aseptic operations, making culture dishes, aliquoting reagents, etc
CO2 Incubator	Thermo	8000DH	Embryo culture
Culture plate	Corning	3506	Cell culture
DMEM/F12	Gibco	1133032	DMEM/F12 (1x), liquid 1:1,Contains L-glutamine and 15 mM HEPES buffer
Fetal Bovine Serum	Gibco	10099141	Fetal Bovine Serum, Qualified, Australia Origin
Gelatin	SIGMA	G9391	Type B, powder, BioReagent, suitable for cell culture
HCG	Nanjing Aibei	M2520	Sterilization reagent, intraperitoneal injection, 50 IU/mL
Hyaluronidase	SIGMA	V900833	Reagent grade, powder
KSOM	Merck	MR-020P-D	(1x), Powder, w/o Phenol Red, 5 x 10 mL
L-glutamine	Gibco	25030081	L-glutamine-200 mM (100x), liquid
M2	Merck	MR-015-D	EmbryoMax M2 Medium (1x), Liquid, with Phenol Red
Mineral oil	SIGMA	M8410	Mineral oil is suitable for use as a cover layer to control evaporation and cross-contamination in various molecular biology applications
Penicillin-Streptomycin, liquid	Gibco	15140122	10,000 Units penicillin (base) and 10,000 units streptomycin (base), utilizing penicillin G (sodium salt) and streptomycin sulfate in 0.85% saline
PMSG	Nanjing Aibei	M2620	Sterilization reagent ,intraperitoneal injection, 50 IU/mL
Progesterone	SIGMA	5341	Steroid hormone secreted by the corpus luteum during the latter half of the menstrual cycle
Sodium pyruvate	Gibco	11360070	Sodium pyruvate is commonly added to cell culture media as a carbon source in addition to glucose
Stereomicroscope	Olympus	SZX7	Embryo retrieval and observation of embryo development