Etablierung eines Embryoimplantationsmodells in vitro

Zusammenfassung

Dieses Protokoll beschreibt Methoden zur Erstellung eines einfachen und effizienten In-vitro-Modells für die Embryoimplantation zur Bewertung der relevanten Moleküle, die den Einnistungsprozess des Embryos beeinflussen.

Zusammenfassung

Die Einnistung des Embryos ist der erste Schritt auf dem Weg zu einer erfolgreichen Schwangerschaft. Ein In-vitro-Modell für die Embryoimplantation ist entscheidend für die biologische Grundlagenforschung, die Arzneimittelentwicklung und das Screening. In dieser Arbeit wird ein einfaches, schnelles und hocheffizientes in vitro Modell für die Embryonenimplantation vorgestellt. In diesem Protokoll stellen wir zunächst die Blastozystenakquisition von Mäusen und die Vorbereitung der humanen Endometrium-Adenokarzinomzellen (Ishikawa) für die Implantation vor, gefolgt von der Co-Kultur-Methode für Mausembryonen und Ishikawa-Zellen. Schließlich führten wir eine Studie durch, um den Einfluss unterschiedlicher Konzentrationen von 17-β-Östradiol (E₂) und Progesteron (P4) auf die Adhäsionsraten der Embryonen auf der Grundlage dieses Modells zu bewerten. Unsere Ergebnisse zeigten, dass hohe Konzentrationen von E₂ die Adhäsion des Embryos signifikant reduzierten, während die Zugabe von Progesteron die Adhäsionsrate wiederherstellen konnte. Dieses Modell bietet eine einfache und schnelle Plattform für die Bewertung und das Screening von Molekülen, die am Adhäsionsprozess beteiligt sind, wie z. B. Zytokine, Medikamente und Transkriptionsfaktoren, die die Implantation und die Empfänglichkeit des Endometriums steuern.

Einleitung

Die Einnistung des Embryos, der erste Schritt einer erfolgreichen Schwangerschaft, ist entscheidend für das Verständnis der biologischen Grundlagen und die Bewältigung der Herausforderungen der Unfruchtbarkeit. Ethische Zwänge stellen jedoch erhebliche Einschränkungen bei der Entnahme von klinischen Embryonenproben am Menschen dar und behindern die Erforschung der komplizierten Wechselwirkungen zwischen menschlichen Embryonen und dem Endometrium während der frühen Schwangerschaft¹. Ein tiefgreifendes Verständnis dieser komplexen Mechanismen ist unerlässlich, um die biologische Grundlagenforschung, die Arzneimittelforschung und die reproduktive Gesundheit voranzutreiben.

Frühere In-vitro-Modelle verwendeten Adhäsionsmodelle, bei denen monoschichtige humane Endometriumepithelzellen (RL95-2)² mit embryonalen Ersatzzellen wie BeWo-, JAr- oder Jeg-3 3-Choriokarzinomzellen cokultiviert wurden. Dennoch war die Auswahl der Größe der Sphäroide im Bereich von 70-100 μm entscheidend, da größere oder kleinere Zellaggregate die Genauigkeit des Experiments beeinträchtigen könnten. Bemerkenswert ist, dass nur 25 % der Sphäroide in jedem Präparat den Standard für die geeignete Größe⁴ erfüllten, und es gab signifikante Unterschiede im Vergleich zu den physiologischen Bedingungen von Blastozysten.

Darüber hinaus bieten dreidimensionale (3D) Kultursysteme für das Endometrium und die Blastozyste eine physiologisch relevantere Umgebung⁵, erfordern jedoch ein hohes technisches Know-how, ein langsames Zellwachstum, hohe Ressourcen- und Wartungskosten, Schwierigkeiten bei der Standardisierung und eine geringe Reproduzierbarkeit⁶.

In diesem Protokoll stellen wir ein kostengünstiges und schnelles In-vitro-Modell der Embryonenimplantation vor, das in den meisten Laboratorien entwickelt und eingesetzt werden kann. Das übergeordnete Ziel dieser Methode ist es, eine zuverlässige und reproduzierbare Plattform für die Untersuchung der Wechselwirkungen zwischen Embryonen und dem Endometrium in einer kontrollierten Umgebung bereitzustellen. Durch die Simulation von Schlüsselereignissen der Embryonenimplantation in vitro zielt dieses Modell darauf ab, die Lücke zwischen Tiermodellen und klinischen Umgebungen zu schließen und eine präzisere und gezieltere Forschung zu ermöglichen.

Im Vergleich zu embryonalen Substitutionen bietet die Verwendung von Maus-Blastozysten eine physiologisch relevantere Darstellung des in vivo Embryoimplantationsprozesses⁷. Darüber hinaus besitzt die Ishikawa-Zelllinie, die aus dem humanen Endometrium-Adenokarzinom gewonnen wird, gemischte Eigenschaften des Drüsenepithels und des uteruslumenen Epithels¹, die es ihr ermöglichen, Enzyme, Strukturproteine und funktionelle Steroidrezeptoren zu exprimieren, die denen im normalen Endometrium ähneln, und somit ein physiologisch relevantes Substrat für die Embryonalimplantation bereitzustellen. Die Einfachheit und Schnelligkeit des Co-Kultursystems ermöglicht Hochdurchsatz-Screenings und Wirkstofftests ^8,9,10. Durch die Bereitstellung einer robusten und reproduzierbaren Plattform bietet diese Methode die Möglichkeit, unser Verständnis der Embryonenimplantation und ihrer Auswirkungen auf die menschliche Gesundheit zu verbessern.

Protokoll

Der Umgang mit Mäusen und experimentelle Studien wurden im Rahmen von Protokollen durchgeführt, die vom Tierausschuss des Shanghai Institute for Biomedical and Pharmaceutical Technologies genehmigt wurden. Sicherheitsverfahren gewährleisten: Tragen Sie beim Umgang mit Chemikalien oder biologischen Materialien immer geeignete persönliche Schutzausrüstung (PSA).

1. Gewinnung von Mausembryonen

HINWEIS: In diesem Abschnitt wird der Prozess der Gewinnung von Mausembryonen beschrieben. Erwachsene weibliche Mäuse (6-8 Wochen alt, Hybride C57BL/6 und DBA/2) wurden unter Standardumgebungsbedingungen von 12 h hell und 12 h dunkel bei 20-25 °C und 40-60 % Luftfeuchtigkeit gehalten, wobei Futter und Wasser ad libitum bereitgestellt wurden.

1. Injizieren Sie weiblichen Mäusen intraperitoneal 10 I.E. Serumgonadotropin (PMSG) der trächtigen Stute und injizieren Sie dann 10 I.E. humanes Choriongonadotropin (HCG) im Abstand von 42-48 Stunden.
2. Verpaaren Sie jede weibliche Maus mit einem Männchen vergleichbaren Alters und prüfen Sie am nächsten Morgen auf einen Vaginalpfropfen.
   HINWEIS: Der Vaginalpfropfen ist ein hellgelber Klumpen Zäpfchen, der gebildet wird, nachdem sich der Samen an der Vaginalöffnung verfestigt hat.
3. Einschläferung der weiblichen Mäuse mit Vaginalpfropfen durch CO₂ -Inhalation.
4. Öffnen Sie den Bauch und lokalisieren Sie die weiblichen Genitalien; Dehnen Sie den Eileiter, den Eierstock und die Fettpolster mit einer Pinzette; Schneiden Sie den Eileiter und den Eierstock mit einer Schere durch. und dann den Eileiter und die Gebärmutter durchtrennen (Abbildung 1).
5. Übertragen Sie den erhaltenen Eileiter in eine 35 mm Petrischale, die mit M2-Medium vorgefüllt ist.
   HINWEIS: M2 medium sollte in einem Inkubator (37 °C, 5 % CO₂) für 30 min vorgewärmt werden.
6. Die vergrößerte Ampulle des Eileiters wird mit einer 25-G-Nadel punktiert, um den Kumulus-Zygoten-Komplex freizugeben oder einzuklemmen (Abbildung 2).
7. Übertragen Sie den Kumulus-Zygoten-Komplex mit einer Pinzette in eine M2-Lösung, die 0,5 mg/ml Hyaluronidase enthält, und inkubieren Sie ihn einige Minuten lang, bis die Kumuluszellen dissoziieren (Abbildung 3).
8. Sammeln Sie die Zygoten mit einer Eitransferpipette und waschen Sie sie in M2-Medium mit 4 mg/ml BSA, um verbleibende Hyaluronidase, Kumuluszellen und Verunreinigungen zu entfernen.

2. In-vitro-Kultur von Mausembryonen

HINWEIS: In diesem Abschnitt wird der Prozess der In-vitro-Kultivierung von Mausembryonen von Zygoten bis zu Blastozysten beschrieben. KSOM-Kultur-Mikrotropfen sollten 24 Stunden im Voraus hergestellt werden, um das Temperatur- und Gasgleichgewicht zu gewährleisten.

1. Bereiten Sie 12 Mikrotröpfchen KSOM-Medium mit einem Volumen von jeweils 20 μl am Boden einer 35-mm-Petrischale vor. Bedecken Sie die Mikrotröpfchen mit 3-5 mL Mineralöl (Abbildung 4) und stellen Sie die Petrischalen zur Äquilibrierung bei 37 °C mit 5 % CO₂ in einen Inkubator.
2. Übertragen Sie die Mausembryonen mit einer Transferpipette vom M2-Medium auf das KSOM-Medium, um sie gründlich zu waschen.
   HINWEIS: Für diesen Schritt ist ein Stereomikroskop mit einem Heiztisch von 37 °C erforderlich. Minimieren Sie die Dauer der Embryonenhandhabung außerhalb des Inkubators.
3. Legen Sie die gewaschenen Embryonen in die vorbereiteten KSOM-Mikrotröpfchen und inkubieren Sie sie bei 37 °C mit 5% CO₂ für 4 Tage.
   HINWEIS: Um eine angemessene Ernährung zu gewährleisten, kultivieren Sie 5-10 Embryonen pro 20 μl Mikrotropfen.
4. Wählen Sie die vorteilhaften Blastozysten nach ihrer Größe (100-130 μm), ihrer inneren Zellmasse (die innere Zellmasse besteht aus vielen Zellen, die alle verdichtet sind), der Anzahl der Trophoblastzellen (die Trophektodermie besteht aus vielen Zellen, die zusammenhängend und gepackt sind) und dem Grad der Expansion (Blastocoel nimmt 80-100% des Embryos ein).

3. Vorbereitung der Endometriumzellen

1. In einer Biosicherheitswerkbank 1 ml 2 % Gelatine mit einer Pipette aspirieren und in eine 12-Well-Kulturplatte geben. Drehen Sie die Platte vorsichtig, um sicherzustellen, dass der Boden vollständig mit der Gelatine bedeckt ist. Stellen Sie die Platte für 30 min in einen 37 °C heißen Inkubator. Anschließend die überschüssige Gelatine absaugen und den Boden der Platte vollständig trocknen lassen.
2. Nach Abschluss des Beschichtungsprozesses kultivieren Sie humane Endometrium-Adenokarzinomzellen (Ishikawa) mit DMEM/F12 (siehe Materialtabelle für Details), 1 mM Natriumpyruvat, 2 mM L-Glutamin, 100 μg/ml Streptomycin und 100 IE/ml Penicillin, säen Sie sie in die gelatinebeschichteten 12-Well-Platten (2 × 10⁵Zellen/Well) und inkubieren Sie sie 24 Stunden lang.

4. Anheftung des Embryos

1. Geben Sie vorsichtig 5-15 frische Blastozysten in jede Vertiefung der 12-Well-Platte mit Ishikawa-Zellen, die im vorherigen Schritt für die Co-Kultur vorbereitet wurden (Abbildung 5).
2. Beobachten Sie die Embryonen nach 48 Stunden Inkubation unter dem Mikroskop, um ihren Anheftungsstatus zu beurteilen. Um die Anheftung des Embryos zu beobachten, bewegen Sie die Platte dreimal schnell. Ungebundene Embryonen zeigen eine schwebende oder rollende Bewegung über die Oberfläche der Ishikawa-Zellen.
3. Berechnen Sie die Einnistungsrate des Embryos anhand von Gleichung (1); Verwenden Sie die Adhäsionsrate des Embryos, um den Einnistungseffekt darzustellen.
   Einnistungsrate des Embryos = (Anhaftende Embryonen/Gesamtzahl der implantierten Embryonen) × 100% (1)

Ergebnisse

Bei der assistierten Reproduktion ist die kontrollierte ovarielle Hyperstimulation (COH) ein entscheidender Schritt, der bei Patientinnen zu einem signifikant erhöhten Östrogenspiegel um mehr als das 10- bis 20-fache im Vergleich zum natürlichen Zyklus führt¹¹. Vor diesem Hintergrund fragten wir, ob hohe Serumöstrogenkonzentrationen die Einnistung des Embryos während des Transfers frischer Embryonen beeinflussen. Basierend auf diesem Embryoimplantationsmodell untersuchten wir die Auswirkunge...

Diskussion

Die Einfachheit und Schnelligkeit des vorgeschlagenen In-vitro-Modells für die Embryonenimplantation bietet bemerkenswerte Vorteile für das Wirkstoffscreening in der Frühphase und andere Forschungsanwendungen. Das unkomplizierte Protokoll, gepaart mit dem hohen Durchsatz der Ishikawa-Zelllinien, macht es zu einem idealen Kandidaten für groß angelegte Screenings, insbesondere in den frühen Stadien der Wirkstoffforschung. Liang¹³ fand heraus, dass der TAGLN2-Knockdown die Invasionsfä...

Materialien

Name	Company	Catalog Number	Comments
17-β-estradiol	SIGMA	3301	Most potent mammalian estrogenic hormone
BD Falcon	BD	353001	Bacteriological Petri Dishes 35 x 10 mm style w/tight lid, crystal-grade virgin polystyrene, sterile
Biosafety Cabinet	ESCO	class BSC	Aseptic operations, making culture dishes, aliquoting reagents, etc
CO2 Incubator	Thermo	8000DH	Embryo culture
Culture plate	Corning	3506	Cell culture
DMEM/F12	Gibco	1133032	DMEM/F12 (1x), liquid 1:1,Contains L-glutamine and 15 mM HEPES buffer
Fetal Bovine Serum	Gibco	10099141	Fetal Bovine Serum, Qualified, Australia Origin
Gelatin	SIGMA	G9391	Type B, powder, BioReagent, suitable for cell culture
HCG	Nanjing Aibei	M2520	Sterilization reagent, intraperitoneal injection, 50 IU/mL
Hyaluronidase	SIGMA	V900833	Reagent grade, powder
KSOM	Merck	MR-020P-D	(1x), Powder, w/o Phenol Red, 5 x 10 mL
L-glutamine	Gibco	25030081	L-glutamine-200 mM (100x), liquid
M2	Merck	MR-015-D	EmbryoMax M2 Medium (1x), Liquid, with Phenol Red
Mineral oil	SIGMA	M8410	Mineral oil is suitable for use as a cover layer to control evaporation and cross-contamination in various molecular biology applications
Penicillin-Streptomycin, liquid	Gibco	15140122	10,000 Units penicillin (base) and 10,000 units streptomycin (base), utilizing penicillin G (sodium salt) and streptomycin sulfate in 0.85% saline
PMSG	Nanjing Aibei	M2620	Sterilization reagent ,intraperitoneal injection, 50 IU/mL
Progesterone	SIGMA	5341	Steroid hormone secreted by the corpus luteum during the latter half of the menstrual cycle
Sodium pyruvate	Gibco	11360070	Sodium pyruvate is commonly added to cell culture media as a carbon source in addition to glucose
Stereomicroscope	Olympus	SZX7	Embryo retrieval and observation of embryo development