In Vitroでの胚着床モデルの確立

要約

このプロトコルは、胚移植プロセスに影響を与える関連分子を評価するためのシンプルで効率的な胚移植 in vitro モデルを確立するための方法論を説明しています。

要約

胚の着床は、妊娠を成功させるための最初のステップです。胚着床のための in vitro モデルは、基礎生物学研究、医薬品開発、スクリーニングに不可欠です。この論文では、胚移植のためのシンプルで迅速、かつ高効率な in vitro モデルを紹介します。本プロトコールでは、まずマウス胚盤胞の獲得とヒト子宮内膜腺癌細胞(石川)の移植用調製物を導入し、続いてマウス胚と石川細胞の共培養法を導入します。最後に、このモデルに基づいて、17-β-エストラジオール(E₂)とプロゲステロン(P4)のさまざまな濃度が胚の接着率に与える影響を評価する研究を実施しました。私たちの調査結果は、高濃度のE₂ が胚の接着を有意に減少させるのに対し、プロゲステロンの添加は接着率を回復させることを明らかにしました。このモデルは、サイトカイン、薬物、着床と子宮内膜の受容性を制御する転写因子など、接着プロセスに関与する分子を評価およびスクリーニングするためのシンプルで迅速なプラットフォームを提供します。

概要

妊娠を成功させるための最初のステップである胚移植は、その生物学的基盤を理解し、不妊症の課題に対処するために重要です。しかし、倫理的な制約により、ヒト臨床胚サンプルの収集には大きな制限があり、妊娠初期におけるヒト胚と子宮内膜との間の複雑な相互作用に関する研究が妨げられています¹。これらの複雑なメカニズムを深く理解することは、基礎生物学研究、創薬、およびリプロダクティブヘルスを前進させるために不可欠です。

以前のin vitroモデルでは、単層ヒト子宮内膜上皮細胞(RL95-2)² をBeWo、JAr、Jeg-3³ 絨毛がん細胞などの胚性代替細胞と共培養した接着モデルが採用されていました。それにもかかわらず、細胞凝集体が大きいか小さいかによって実験の精度が損なわれる可能性があるため、70〜100μmの範囲のスフェロイドのサイズを選択することは重要でした。特に、各調製物中のスフェロイドのうち、適切なサイズ⁴の基準を満たしたのはわずか25%であり、胚盤胞の生理学的条件と比較して有意な差が見られました。

さらに、子宮内膜および胚盤胞の3次元(3D)培養システムは、より生理学的に関連性のある環境を提供します^5....

プロトコル

マウスの取り扱いと実験的研究は、Shanghai Institute for Biomedical and Pharmaceutical Technologiesの動物委員会によって承認されたプロトコルに基づいて行われました。安全手順を確保する:化学物質や生物学的材料を取り扱うときは、常に適切な個人用保護具(PPE)を着用してください。

1. マウス胚の取得

注:このセクションでは、マウス胚を取得するプロセスについて説明します。成体雌マウス(6-8週齢、ハイブリッドC57BL/6およびDBA/2)は、20-25°C、湿度40-60%の12時間の明るい場所と12時間の暗い標準環境条件下で、餌と水 を自由に提供して維持しました。

1. 雌マウスに10IUの妊娠中の牝馬の血清ゴナドトロピン(PMSG)を腹腔内に注射し、次に10IUのヒト絨毛性ゴナドトロピン(HCG)を42〜48時間間隔で注射します。.
2. 各雌マウスを同等の年齢の雄と交配させ、翌朝膣栓を確認します。
   注:膣栓は、精液が膣口で固まった後に形成される淡黄色の坐剤の塊です。
3. CO₂ 吸入により、膣栓で雌マウスを安楽死させます。
4. 腹部を開き、女性器を見つけます。鉗子で卵管、卵巣、脂肪パッドを伸ばします。卵管と卵巣をハサミ....

ディスカッション

提案された胚移植のためのin vitroモデルのシンプルさと迅速さは、初期段階の薬物スクリーニングやその他の研究アプリケーションに顕著な利点を提供します。簡便なプロトコールと石川細胞株のハイスループットな性質により、特に創薬の初期段階における大規模なスクリーニングの理想的な候補となります。Liang¹³は、TAGLN2のノックダウンが栄養膜細胞の浸潤能力?.......

資料

Name	Company	Catalog Number	Comments
17-β-estradiol	SIGMA	3301	Most potent mammalian estrogenic hormone
BD Falcon	BD	353001	Bacteriological Petri Dishes 35 x 10 mm style w/tight lid, crystal-grade virgin polystyrene, sterile
Biosafety Cabinet	ESCO	class BSC	Aseptic operations, making culture dishes, aliquoting reagents, etc
CO2 Incubator	Thermo	8000DH	Embryo culture
Culture plate	Corning	3506	Cell culture
DMEM/F12	Gibco	1133032	DMEM/F12 (1x), liquid 1:1,Contains L-glutamine and 15 mM HEPES buffer
Fetal Bovine Serum	Gibco	10099141	Fetal Bovine Serum, Qualified, Australia Origin
Gelatin	SIGMA	G9391	Type B, powder, BioReagent, suitable for cell culture
HCG	Nanjing Aibei	M2520	Sterilization reagent, intraperitoneal injection, 50 IU/mL
Hyaluronidase	SIGMA	V900833	Reagent grade, powder
KSOM	Merck	MR-020P-D	(1x), Powder, w/o Phenol Red, 5 x 10 mL
L-glutamine	Gibco	25030081	L-glutamine-200 mM (100x), liquid
M2	Merck	MR-015-D	EmbryoMax M2 Medium (1x), Liquid, with Phenol Red
Mineral oil	SIGMA	M8410	Mineral oil is suitable for use as a cover layer to control evaporation and cross-contamination in various molecular biology applications
Penicillin-Streptomycin, liquid	Gibco	15140122	10,000 Units penicillin (base) and 10,000 units streptomycin (base), utilizing penicillin G (sodium salt) and streptomycin sulfate in 0.85% saline
PMSG	Nanjing Aibei	M2620	Sterilization reagent ,intraperitoneal injection, 50 IU/mL
Progesterone	SIGMA	5341	Steroid hormone secreted by the corpus luteum during the latter half of the menstrual cycle
Sodium pyruvate	Gibco	11360070	Sodium pyruvate is commonly added to cell culture media as a carbon source in addition to glucose
Stereomicroscope	Olympus	SZX7	Embryo retrieval and observation of embryo development