In vitro 배아 이식 모델 확립

요약

이 프로토콜은 배아 착상 과정에 영향을 미치는 관련 분자를 평가하기 위한 간단하고 효율적인 체 외 배아 이식 모델을 수립하기 위한 방법론을 설명합니다.

초록

배아 착상은 성공적인 임신을 위한 첫 번째 단계입니다. 배아 이식을 위한 체외 모델은 기초 생물학 연구, 약물 개발 및 스크리닝에 매우 중요합니다. 이 논문은 배아 착상을 위한 간단하고 빠르며 매우 효율적인 체외 모델을 제시합니다. 이 프로토콜에서는 먼저 마우스 배반포 획득 및 인간 자궁내막 선암 세포(Ishikawa) 착상을 위한 준비를 소개한 다음 마우스 배아와 이시카와 세포에 대한 공동 배양 방법을 소개합니다. 마지막으로, 이 모델을 기반으로 17-β-에스트라디올(_E2) 및 프로게스테론(P4)의 다양한 농도가 배아 접착률에 미치는 영향을 평가하기 위한 연구를 수행했습니다. 우리의 발견은 고농도의 E₂ 가 배아 부착을 현저히 감소시키는 반면, 프로게스테론을 첨가하면 접착 속도를 회복 할 수 있음을 밝혔다. 이 모델은 사이토카인, 약물, 착상 및 자궁내막 수용성을 조절하는 전사 인자와 같은 접착 과정에 관여하는 분자를 평가하고 스크리닝하기 위한 간단하고 빠른 플랫폼을 제공합니다.

서문

성공적인 임신의 초기 단계인 배아 착상은 배아의 생물학적 기초를 이해하고 불임 문제를 해결하는 데 매우 중요합니다. 그러나 윤리적 제약은 인간 임상 배아 샘플을 수집하는 데 상당한 제한을 초래하며, 이는 인간 배아와 임신 초기 자궁 내막 사이의 복잡한 상호 작용에 대한 연구를 방해합니다¹. 이러한 복잡한 메커니즘에 대한 심층적인 이해는 기초 생물학 연구, 약물 발견 및 생식 건강을 발전시키는 데 매우 중요합니다.

이전의 in vitro 모델은 단층 인간 자궁내막 상피 세포(RL95-2)² 를 BeWo, JAr 또는 Jeg-3³ 융모암 세포와 같은 배아 대체물과 공동 배양하는 접착 모델을 사용했습니다. 그럼에도 불구하고 70-100 μm 범위의 스페로이드 크기를 선택하는 것은 더 크거나 작은 세포 응집체가 실험의 정확도를 손상시킬 수 있기 때문에 매우 중요했습니다. 주목할 만한 점은, 각 제제에서 스페로이드의 25%만이 적합한 크기⁴에 대한 기준을 충족했으며, 배반포의 생리학적 조건과 비교했을 때 유의한 차이가 있었습니다.

또....

프로토콜

마우스 취급 및 실험 연구는 Shanghai Institute for Biomedical and Pharmaceutical Technologies의 Animal Committee에서 승인한 프로토콜에 따라 수행되었습니다. 안전 절차 보장: 화학 물질이나 생물학적 물질을 취급할 때는 항상 적절한 개인 보호 장비(PPE)를 착용하십시오.

1. 쥐 배아의 획득

참고: 이 섹션에서는 마우스 배아를 얻는 과정에 대해 설명합니다. 성체 암컷 마우스(생후 6-8주, 하이브리드 C57BL/6 및 DBA/2)는 20-25°C, 40-60% 습도에서 12시간 밝은 상태, 12시간 어두운 표준 환경 조건에서 음식과 물을 추가로 제공하면서 유지했습니다.

1. 암컷 마우스에게 10IU의 임신한 암말의 혈청 성선 자극 호르몬(PMSG)을 복강내로 주입한 다음 42-48시간 간격으로 10IU의 인간 융모성 성선 자극 호르몬(HCG)을 주입합니다.
2. 각 암컷 쥐를 비슷한 나이의 수컷과 짝짓기하고 다음 날 아침에 질 마개를 확인합니다.
   참고: 질 플러그는 질 입구에서 정액이 응고된 후 형성되는 연한 노란색 좌약 덩어리입니다.
3. ....

토론

배아 이식을 위해 제안된 체외 모델의 단순성과 신속성은 초기 단계의 약물 스크리닝 및 기타 연구 응용 분야에 놀라운 이점을 제공합니다. Ishikawa 세포주의 고처리량 특성과 결합된 간단한 프로토콜은 특히 약물 발견의 초기 단계에서 대규모 스크리닝에 이상적인 후보입니다. Liang¹³은 TAGLN2 knockdown이 영양 세포의 침입 능력을 감소시킨다는 것을 발견했습니다. Green

자료

Name	Company	Catalog Number	Comments
17-β-estradiol	SIGMA	3301	Most potent mammalian estrogenic hormone
BD Falcon	BD	353001	Bacteriological Petri Dishes 35 x 10 mm style w/tight lid, crystal-grade virgin polystyrene, sterile
Biosafety Cabinet	ESCO	class BSC	Aseptic operations, making culture dishes, aliquoting reagents, etc
CO2 Incubator	Thermo	8000DH	Embryo culture
Culture plate	Corning	3506	Cell culture
DMEM/F12	Gibco	1133032	DMEM/F12 (1x), liquid 1:1,Contains L-glutamine and 15 mM HEPES buffer
Fetal Bovine Serum	Gibco	10099141	Fetal Bovine Serum, Qualified, Australia Origin
Gelatin	SIGMA	G9391	Type B, powder, BioReagent, suitable for cell culture
HCG	Nanjing Aibei	M2520	Sterilization reagent, intraperitoneal injection, 50 IU/mL
Hyaluronidase	SIGMA	V900833	Reagent grade, powder
KSOM	Merck	MR-020P-D	(1x), Powder, w/o Phenol Red, 5 x 10 mL
L-glutamine	Gibco	25030081	L-glutamine-200 mM (100x), liquid
M2	Merck	MR-015-D	EmbryoMax M2 Medium (1x), Liquid, with Phenol Red
Mineral oil	SIGMA	M8410	Mineral oil is suitable for use as a cover layer to control evaporation and cross-contamination in various molecular biology applications
Penicillin-Streptomycin, liquid	Gibco	15140122	10,000 Units penicillin (base) and 10,000 units streptomycin (base), utilizing penicillin G (sodium salt) and streptomycin sulfate in 0.85% saline
PMSG	Nanjing Aibei	M2620	Sterilization reagent ,intraperitoneal injection, 50 IU/mL
Progesterone	SIGMA	5341	Steroid hormone secreted by the corpus luteum during the latter half of the menstrual cycle
Sodium pyruvate	Gibco	11360070	Sodium pyruvate is commonly added to cell culture media as a carbon source in addition to glucose
Stereomicroscope	Olympus	SZX7	Embryo retrieval and observation of embryo development