Создание модели имплантации эмбриона in vitro

Резюме

В этом протоколе описываются методологии создания простой и эффективной модели имплантации эмбриона in vitro для оценки соответствующих молекул, влияющих на процесс имплантации эмбриона.

Аннотация

Имплантация эмбриона – это первый шаг в установлении успешной беременности. Модель in vitro для имплантации эмбриона имеет решающее значение для фундаментальных биологических исследований, разработки лекарств и скрининга. В этой статье представлена простая, быстрая и высокоэффективная модель имплантации эмбриона in vitro . В этом протоколе мы сначала вводим получение бластоцисты мыши и подготовку клеток аденокарциномы эндометрия человека (Исикава) к имплантации, а затем метод совместного культивирования эмбрионов мышей и клеток Исикавы. Наконец, мы провели исследование для оценки влияния различных концентраций 17-β-эстрадиола (_Е2) и прогестерона (Р4) на скорость адгезии эмбрионов на основе этой модели. Наши результаты показали, что высокие концентрации_Е2 значительно снижают адгезию эмбрионов, в то время как добавление прогестерона может восстановить скорость адгезии. Эта модель предлагает простую и быструю платформу для оценки и скрининга молекул, участвующих в процессе адгезии, таких как цитокины, лекарства и факторы транскрипции, контролирующие имплантацию и рецептивность эндометрия.

Введение

Имплантация эмбриона, первый этап успешной беременности, имеет решающее значение для понимания его биологической основы и решения проблем бесплодия. Тем не менее, этические ограничения создают значительные ограничения при сборе образцов клинических эмбрионов человека, препятствуя исследованию сложных взаимодействий между человеческими эмбрионами и эндометрием на ранних сроках беременности¹. Глубокое понимание этих сложных механизмов жизненно важно для продвижения фундаментальных биологических исследований, разработки лекарств и репродуктивного здоровья.

В предыдущих моделях in vitro использовались модели адгезии, в которых монослойные эпителиальные клетки эндометрия человека (RL95-2)² культивировались совместно с эмбриональными заменителями, такими как клетки хориокарциномы BeWo, JAr или Jeg-3³ . Тем не менее, выбор размера сфероидов в диапазоне от 70 до 100 мкм имел решающее значение, поскольку большие или меньшие клеточные агрегаты могли поставить под угрозу точность эксперимента. Примечательно, что только 25% сфероидов в каждом препарате соответствовали стандарту для подходящего размера⁴, и были значительные различия по сравнению с физиологическими условиями бластоцист.

Кроме того, трехмерные (3D) системы культивирования эндометрия и бластоцисты предлагают более физиологически значимую среду⁵, но они требуют высокой технической квалификации, медленного роста клеток, высоких затрат на ресурсы и обслуживание, сложности стандартизации и низкой воспроизводимости^.

В этом протоколе мы представляем экономически эффективную и быструю модель имплантации эмбриона in vitro, которая может быть разработана и использована в большинстве лабораторий. Общая цель этого метода заключается в том, чтобы обеспечить надежную и воспроизводимую платформу для изучения взаимодействия между эмбрионами и эндометрием в контролируемой среде. Моделируя ключевые события имплантации эмбриона in vitro, эта модель направлена на преодоление разрыва между животными моделями и клиническими условиями, обеспечивая более точные и целенаправленные исследования.

По сравнению с эмбриональными заменителями, использование мышиных бластоцист обеспечивает более физиологически значимое представление процесса имплантации эмбриона in vivo⁷. Кроме того, клеточная линия Исикавы, полученная из аденокарциномы эндометрия человека, обладает смешанными характеристиками железистого эпителия и просветного эпителия^{матки 1}, что позволяет ей экспрессировать ферменты, структурные белки и функциональные стероидные рецепторы, аналогичные тем, которые обнаруживаются в нормальном эндометрии, тем самым обеспечивая физиологически значимый субстрат для имплантации эмбриона. Простота и быстрота системы совместного культивирования позволяют проводить высокопроизводительный скрининг и тестирование на наркотики ^8,9,10. Предоставляя надежную и воспроизводимую платформу, этот метод дает возможность углубить наше понимание имплантации эмбрионов и ее влияния на здоровье человека.

протокол

Работа с мышами и экспериментальные исследования проводились в соответствии с протоколами, утвержденными Комитетом по животным Шанхайского института биомедицинских и фармацевтических технологий. Обеспечьте процедуры безопасности: Всегда надевайте соответствующие средства индивидуальной защиты (СИЗ) при работе с химическими или биологическими материалами.

1. Приобретение эмбрионов мышей

ПРИМЕЧАНИЕ: В этом разделе описан процесс получения эмбрионов мыши. Взрослых самок мышей (в возрасте 6-8 недель, гибрид C57BL/6 и DBA/2) содержали в стандартных условиях окружающей среды 12 часов в светлом свете и 12 часов в темноте при 20-25 °C и влажности 40-60% с предоставлением пищи и воды в неограниченном количестве.

1. Самкам мышей внутрибрюшинно вводят 10 МЕ гонадотропина сыворотки крови беременной кобылы (PMSG), а затем вводят 10 МЕ хорионического гонадотропина человека (ХГЧ) с интервалом 42-48 часов.
2. Спарьте каждую самку мыши с самцом сопоставимого возраста и проверьте наличие вагинальной пробки на следующее утро.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Вагинальная пробка представляет собой светло-желтый комок суппозитория, образующийся после затвердевания спермы у входа во влагалище.
3. Усыпьте самок мышей с вагинальными пробками путем ингаляции CO₂ .
4. Вскрыть брюшную полость и найти женские гениталии; растянуть яйцевод, яичник и жировые подушечки с помощью щипцов; разрезать ножницами яйцевод и завязь; а затем разрезать яйцевод и матку (Рисунок 1).
5. Полученный яйцевод переложите в чашку Петри диаметром 35 мм, предварительно заполненную средой М2.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Среду М2 следует предварительно разогреть в инкубаторе (37 °C, 5%_CO2) в течение 30 минут.
6. Проколите увеличенную ампулу яйцевода иглой 25 G, чтобы освободить или защемить кумулюсно-зиготный комплекс (рисунок 2).
7. С помощью щипцов перенесите кумулюсно-зиготный комплекс в раствор М2, содержащий 0,5 мг/мл гиалуронидазы и инкубируйте в течение нескольких минут до тех пор, пока кумулюсные клетки не диссоциируют (рисунок 3).
8. Соберите зиготы с помощью пипетки для переноса яиц и промойте их в среде M2, содержащей 4 мг/мл BSA, чтобы удалить остаточную гиалуронидазу, кумулюсные клетки и примеси.

2. Культивирование эмбриона мыши in vitro

ПРИМЕЧАНИЕ: В этом разделе подробно описан процесс культивирования in vitro эмбрионов мыши от зигот до бластоцист. Микрокапли культуры КСОМ следует готовить за 24 ч для обеспечения температурного и газового равновесия.

1. Приготовьте 12 микрокапель среды КСОМ, каждая объемом 20 μл, на дно чашки Петри диаметром 35 мм. Залейте микрокапли 3-5 мл минерального масла (рис. 4) и поместите чашки Петри в инкубатор при температуре 37 °C с 5%_CO2 для уравновешивания.
2. Перенесите эмбрионы мышей из среды М2 в среду КСОМ с помощью трансферной пипетки для тщательной промывки.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Для этого шага требуется стереомикроскоп с нагревательным столиком 37 °C. Свести к минимуму продолжительность работы с эмбрионами вне инкубатора.
3. Поместите промытые эмбрионы в подготовленные микрокапли КСОМ и инкубируйте их при температуре 37 °С с 5%_СО2 в течение 4 дней.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Для обеспечения адекватного питания культивируйте 5-10 эмбрионов на 20 мкл микрокапель.
4. Выбирайте бластоцисты в зависимости от их размера (100-130 мкм), внутренней клеточной массы (внутренняя клеточная масса состоит из множества уплотненных клеток), количества клеток трофобласта (трофэктодерма состоит из множества клеток, которые скреплены и упакованы вместе) и степени расширения (бластоцель занимает 80-100% эмбриона).

3. Подготовка клеток эндометрия

1. В шкафу биобезопасности отасуньте 1 мл 2% желатина с помощью пипетки и распределите его в 12-луночный планшет для культивирования. Аккуратно поворачивайте пластину, чтобы обеспечить полное покрытие дна желатином. Поместите планшет в инкубатор с температурой 37 °C на 30 минут. После этого отсадите излишки желатина и дайте дну тарелки полностью высохнуть.
2. После завершения процесса нанесения покрытия клетки аденокарциномы эндометрия человека (Исикава) с DMEM/F12 (подробнее см. Таблицу материалов ), 1 мМ пирувата натрия, 2 мМ L-глутамина, 100 мкг/мл стрептомицина и 100 МЕ/мл пенициллина, засеивают их в покрытые желатином 12-луночные планшеты (2 × 10⁵клеток/лунку) и инкубируют в течение 24 ч.

4. Прикрепление эмбриона

1. Аккуратно поместите 5-15 свежих бластоцист в каждую лунку 12-луночного планшета, содержащего клетки Исикавы, приготовленные на предыдущем этапе для совместного культивирования (Рисунок 5).
2. После 48-часовой инкубации понаблюдайте за эмбрионами под микроскопом, чтобы оценить статус их прикрепления. Чтобы наблюдать за прикреплением эмбриона, быстро переместите пластину три раза. Неприкрепленные эмбрионы будут демонстрировать плавающие или перекатывающиеся движения по поверхности клеток Исикавы.
3. Рассчитать скорость имплантации эмбрионов с помощью уравнения (1); Используйте скорость адгезии эмбриона для представления эффекта имплантации.
   Коэффициент имплантации эмбрионов = (Прикрепленные эмбрионы/Общее количество имплантированных эмбрионов) × 100% (1)

Результаты

В процессе вспомогательных репродуктивных техник контролируемая гиперстимуляция яичников (ГН) является важнейшим этапом, приводящим к значительному повышению уровня эстрогенов у пациенток более чем в 10-20 раз по сравнению с естественными циклами¹¹. Учитывая этот контекст,...

Обсуждение

Простота и быстрота предлагаемой модели in vitro для имплантации эмбрионов дают замечательные преимущества для скрининга лекарств на ранних стадиях и других исследовательских приложений. Простой протокол в сочетании с высокой пропускной способностью клеточных линий Исикавы делае?...

Материалы

Name	Company	Catalog Number	Comments
17-β-estradiol	SIGMA	3301	Most potent mammalian estrogenic hormone
BD Falcon	BD	353001	Bacteriological Petri Dishes 35 x 10 mm style w/tight lid, crystal-grade virgin polystyrene, sterile
Biosafety Cabinet	ESCO	class BSC	Aseptic operations, making culture dishes, aliquoting reagents, etc
CO2 Incubator	Thermo	8000DH	Embryo culture
Culture plate	Corning	3506	Cell culture
DMEM/F12	Gibco	1133032	DMEM/F12 (1x), liquid 1:1,Contains L-glutamine and 15 mM HEPES buffer
Fetal Bovine Serum	Gibco	10099141	Fetal Bovine Serum, Qualified, Australia Origin
Gelatin	SIGMA	G9391	Type B, powder, BioReagent, suitable for cell culture
HCG	Nanjing Aibei	M2520	Sterilization reagent, intraperitoneal injection, 50 IU/mL
Hyaluronidase	SIGMA	V900833	Reagent grade, powder
KSOM	Merck	MR-020P-D	(1x), Powder, w/o Phenol Red, 5 x 10 mL
L-glutamine	Gibco	25030081	L-glutamine-200 mM (100x), liquid
M2	Merck	MR-015-D	EmbryoMax M2 Medium (1x), Liquid, with Phenol Red
Mineral oil	SIGMA	M8410	Mineral oil is suitable for use as a cover layer to control evaporation and cross-contamination in various molecular biology applications
Penicillin-Streptomycin, liquid	Gibco	15140122	10,000 Units penicillin (base) and 10,000 units streptomycin (base), utilizing penicillin G (sodium salt) and streptomycin sulfate in 0.85% saline
PMSG	Nanjing Aibei	M2620	Sterilization reagent ,intraperitoneal injection, 50 IU/mL
Progesterone	SIGMA	5341	Steroid hormone secreted by the corpus luteum during the latter half of the menstrual cycle
Sodium pyruvate	Gibco	11360070	Sodium pyruvate is commonly added to cell culture media as a carbon source in addition to glucose
Stereomicroscope	Olympus	SZX7	Embryo retrieval and observation of embryo development