הקמת מודל השתלת עוברים במבחנה

Summary

פרוטוקול זה מתאר מתודולוגיות לביסוס מודל פשוט ויעיל להשתלת עוברים במבחנה להערכת המולקולות הרלוונטיות המשפיעות על תהליך השתלת העוברים.

Abstract

השתלת עובר היא הצעד הראשון בביסוס הריון מוצלח. מודל במבחנה להשתלת עוברים הוא קריטי למחקר ביולוגי בסיסי, פיתוח תרופות והקרנה. מאמר זה מציג מודל פשוט, מהיר ויעיל ביותר במבחנה להשתלת עוברים. בפרוטוקול זה, אנו מציגים תחילה רכישת בלסטוציסט עכבר והכנת תאי אדנוקרצינומה של רירית הרחם האנושית (אישיקאווה) להשתלה, ולאחר מכן את שיטת התרבית המשותפת עבור עוברי עכברים ותאי אישיקאווה. לבסוף, ערכנו מחקר כדי להעריך את ההשפעה של ריכוזים משתנים של 17-β-אסטרדיול (E₂) ופרוגסטרון (P4) על שיעורי הידבקות עוברים בהתבסס על מודל זה. הממצאים שלנו גילו כי ריכוזים גבוהים של E₂ הפחיתו באופן משמעותי את הידבקות העובר, בעוד שתוספת של פרוגסטרון יכולה להחזיר את קצב ההידבקות. מודל זה מציע פלטפורמה פשוטה ומהירה להערכה וסינון של מולקולות המעורבות בתהליך ההדבקה, כגון ציטוקינים, תרופות וגורמי שעתוק השולטים בהשתלה ובקליטת רירית הרחם.

Introduction

השתלת עוברים, השלב הראשון של הריון מוצלח, חיונית להבנת הבסיס הביולוגי שלה ולהתמודדות עם אתגרי אי הפוריות. עם זאת, אילוצים אתיים מציבים מגבלות משמעותיות באיסוף דגימות עוברים קליניים אנושיים, ופוגעים במחקר על האינטראקציות המורכבות בין עוברים אנושיים לרירית הרחם במהלך תחילת ההריון¹. הבנה מעמיקה של מנגנונים מורכבים אלה חיונית לקידום מחקר ביולוגי בסיסי, גילוי תרופות ובריאות הרבייה.

מודלים קודמים במבחנה השתמשו במודלים של הידבקות שבהם תאי אפיתל רירית הרחם האנושיים (RL95-2)² היו בתרבית משותפת עם תחליפים עובריים, כגון BeWo, JAr, או Jeg-3³ choriocarcinoma cells. אף על פי כן, בחירת גודל הספרואידים, בין 70-100 מיקרומטר, הייתה קריטית מכיוון שצברי תאים גדולים או קטנים יותר עלולים לפגוע בדיוק הניסוי. יש לציין כי רק 25% מהספרואידים בכל תכשיר עמדו בתקן במידה⁴ המתאימה, והיו הבדלים משמעותיים בהשוואה לתנאים הפיזיולוגיים של בלסטוציסטים.

יתר על כן, מערכות תרבית תלת ממדיות (3D) עבור רירית הרחם והבלסטוציסט מציעות סביבה רלוונטית יותר מבחינה פיזיולוגית⁵, אך הן דורשות מומחיות טכנית גבוהה, צמיחת תאים איטית, עלויות משאבים ותחזוקה גבוהות, קושי בסטנדרטיזציה ויכולת שחזור נמוכה⁶.

בפרוטוקול זה, אנו מציגים מודל חסכוני ומהיר של השתלת עוברים שניתן לפתח ולהשתמש בו ברוב המעבדות. המטרה הכוללת של שיטה זו היא לספק פלטפורמה אמינה וניתנת לשחזור לחקר יחסי הגומלין בין עוברים לרירית הרחם בסביבה מבוקרת. על ידי סימולציה של אירועי מפתח של השתלת עוברים במבחנה, מודל זה נועד לגשר על הפער בין מודלים של בעלי חיים לבין הגדרות קליניות, ולאפשר מחקר מדויק וממוקד יותר.

בהשוואה לתחליפים עובריים, השימוש בבלסטוציסטים של עכבר מציע ייצוג רלוונטי יותר מבחינה פיזיולוגית של תהליך השתלת עובר in vivo⁷. בנוסף, קו תאי אישיקאווה, הנגזר מאדנוקרצינומה של רירית הרחם האנושית, הוא בעל מאפיינים מעורבים של אפיתל בלוטי ואפיתל לומן הרחם¹, המאפשרים לו לבטא אנזימים, חלבונים מבניים וקולטני סטרואידים פונקציונליים הדומים לאלה הנמצאים ברירית הרחם הרגילה, ובכך לספק מצע רלוונטי מבחינה פיזיולוגית להשתלת עוברים. הפשטות והמהירות של מערכת התרבות המשותפת מאפשרות סינון בתפוקה גבוהה ובדיקות סמים ^8,9,10. על ידי מתן פלטפורמה חזקה וניתנת לשחזור, שיטה זו מציעה הזדמנות לקדם את הבנתנו את השתלת העוברים והשפעתה על בריאות האדם.

Protocol

טיפול בעכברים ומחקרים ניסיוניים בוצעו תחת פרוטוקולים שאושרו על ידי ועדת בעלי החיים של מכון שנגחאי לטכנולוגיות ביו-רפואיות ופרמצבטיות. הקפידו על נהלי בטיחות: לבשו תמיד ציוד מגן אישי (PPE) מתאים בעת טיפול בכימיקלים או בחומרים ביולוגיים.

1. רכישת עוברי עכבר

הערה: סעיף זה מתאר את תהליך קבלת עוברי עכבר. נקבות עכברים בוגרות (בנות 6-8 שבועות, היברידיות C57BL/6 ו-DBA/2) נשמרו בתנאים סביבתיים סטנדרטיים של 12 שעות אור ו-12 שעות חושך ב-20-25 מעלות צלזיוס ו-40-60% לחות עם מזון ומים שסופקו עד לליביטום.

1. יש להזריק לנקבות עכברים תוך צפקיות 10 IU של גונדוטרופין בסרום סוסה בהריון (PMSG) ולאחר מכן, להזריק 10 IU של גונדוטרופין כוריוני אנושי (HCG) במרווח של 42-48 שעות.
2. קשרו כל נקבת עכבר עם זכר בגיל דומה ובדקו אם יש פקק בנרתיק למחרת בבוקר.
   הערה: פקק נרתיקי הוא גוש צהוב בהיר של נרות שנוצר לאחר שהזרע מתמצק בפתח הנרתיק.
3. הרדימו את נקבות העכברים עם פקקי נרתיק על ידי שאיפת_CO2 .
4. לפתוח את הבטן ולאתר את איבר המין הנשי; למתוח את oviduct, השחלה, כריות שומן עם מלקחיים; לחתוך את oviduct ואת השחלה עם מספריים; ואז, חתכו את האובידוקט ואת הרחם (איור 1).
5. מעבירים את האובידוקט המתקבל לצלחת פטרי 35 מ"מ ממולאת מראש בתווך M2.
   הערה: M2 בינוני צריך להיות מחומם מראש באינקובטור (37 ° C, 5% CO₂) במשך 30 דקות.
6. נקבו את האמפולה המוגדלת של האובידוקט עם מחט של 25 גרם כדי לשחרר או לצבוט את קומפלקס קומולוס-זיגוטה (איור 2).
7. השתמשו במלקחיים כדי להעביר את קומפלקס הקומולוס-זיגוטה לתמיסת M2 המכילה היאלורונידאז במינון 0.5 מ"ג/מ"ל ולדגור במשך מספר דקות עד שתאי הקומולוס יתנתקו (איור 3).
8. אספו את הזיגוטה באמצעות פיפטה להעברת ביצים ושטפו אותן בתווך M2 המכיל 4 מ"ג/מ"ל BSA כדי להסיר שאריות היאלורונידאז, תאי קומולוס וזיהומים.

2. תרבית חוץ גופית של עובר עכבר

הערה: סעיף זה מפרט את התהליך של גידול עוברי עכבר במבחנה מזיגוטה לבלסטוציסט. יש להכין מיקרו-טיפות תרבית KSOM 24 שעות קדימה כדי להבטיח טמפרטורה ושיווי משקל גזים.

1. הכינו 12 מיקרו-טיפות של מדיום KSOM, כל אחת בנפח של 20 μL, בתחתית צלחת פטרי בקוטר 35 מ"מ. כסו את המיקרו-טיפות ב-3-5 מ"ל שמן מינרלי (איור 4), והניחו את צלחות הפטרי באינקובטור בטמפרטורה של 37°C עם 5%_CO2 לצורך איזון.
2. מעבירים את עוברי העכבר ממדיום M2 למדיום KSOM באמצעות פיפטת העברה לשטיפה יסודית.
   הערה: שלב זה דורש סטריאומיקרוסקופ עם שלב חימום של 37 מעלות צלזיוס. צמצמו את משך הטיפול בעוברים מחוץ לאינקובטור.
3. הניחו את העוברים שטופים במיקרו-טיפות KSOM שהוכנו ודגרו עליהם בטמפרטורה של 37°C עם 5% CO₂ למשך 4 ימים.
   הערה: כדי להבטיח תזונה נאותה, תרבית 5-10 עוברים לכל 20 מיקרו-טיפה.
4. בחר בלסטוציסטים מועילים על פי גודלם (100-130 מיקרומטר), מסת התא הפנימית (מסת התא הפנימית מורכבת מתאים רבים שכולם דחוסים), מספר תאי טרופובלסט (הטרופקטודרמיס מורכב מתאים רבים מלוכדים ודחוסים יחד), ומידת ההתפשטות (בלסטוקול תופס 80-100% מהעובר).

3. הכנת תאי רירית הרחם

1. בתוך ארון בטיחות ביולוגית, שאפו 1 מ"ל של 2% ג'לטין באמצעות פיפטה והניחו אותו לצלחת תרבית בת 12 בארות. סובבו בעדינות את הצלחת כדי להבטיח כיסוי מלא של התחתית עם הג'לטין. מניחים את הצלחת באינקובטור של 37 מעלות צלזיוס למשך 30 דקות. לאחר מכן, שאפו את עודפי הג'לטין והניחו לתחתית הצלחת להתייבש לחלוטין.
2. לאחר השלמת תהליך הציפוי, תרבית תאי אדנוקרצינומה של רירית הרחם האנושית (אישיקאווה) עם DMEM/F12 (ראה טבלת חומרים לפרטים), 1 מ"מ נתרן פירובט, 2 מ"מ L-גלוטמין, 100 מיקרוגרם / מ"ל סטרפטומיצין, ו -100 IU / מ"ל פניצילין, זרע אותם לתוך צלחות 12 בארות מצופות ג'לטין (2 × 10⁵תאים / באר), ודגר במשך 24 שעות.

4. התקשרות עובר

1. הניחו בעדינות 5-15 בלסטוציסטים טריים בכל באר של צלחת בת 12 בארות המכילה תאי אישיקאווה שהוכנו בשלב הקודם לתרבית משותפת (איור 5).
2. לאחר דגירה של 48 שעות, התבוננו בעוברים תחת מיקרוסקופ כדי להעריך את מצב ההתקשרות שלהם. כדי לצפות בחיבור עובר, הזז במהירות את הצלחת שלוש פעמים. עוברים שאינם מחוברים יציגו תנועה צפה או מתגלגלת על פני השטח של תאי אישיקאווה.
3. חישוב קצב השתלת העובר באמצעות משוואה (1); השתמש בקצב ההידבקות של העובר כדי לייצג את אפקט ההשתלה.
   שיעור השתלת עוברים = (עוברים מחוברים/המספר הכולל של עוברים מושתלים) × 100% (1)

תוצאות

בתהליך של טכניקות רבייה מסייעות, גירוי יתר מבוקר של השחלות (COH) הוא צעד מכריע, המוביל לרמות אסטרוגן גבוהות באופן משמעותי בחולות ביותר מפי 10-20 בהשוואה למחזורים טבעיים¹¹. בהקשר זה, שאלנו האם ריכוזי אסטרוגן גבוהים בסרום משפיעים על השתלת עוברים במהלך החזרת עוברים טריים. בהתבסס על מו...

Discussion

הפשטות והמהירות של מודל המבחנה המוצע להשתלת עוברים מציעים יתרונות יוצאי דופן לבדיקות סקר תרופתיות בשלב מוקדם וליישומי מחקר אחרים. הפרוטוקול הפשוט, יחד עם אופי התפוקה הגבוהה של קווי תאי אישיקאווה, הופכים אותו למועמד אידיאלי למסכים בקנה מידה גדול, במיוחד בשלבים המוקדמים של גילוי תרופ?...

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
17-β-estradiol	SIGMA	3301	Most potent mammalian estrogenic hormone
BD Falcon	BD	353001	Bacteriological Petri Dishes 35 x 10 mm style w/tight lid, crystal-grade virgin polystyrene, sterile
Biosafety Cabinet	ESCO	class BSC	Aseptic operations, making culture dishes, aliquoting reagents, etc
CO2 Incubator	Thermo	8000DH	Embryo culture
Culture plate	Corning	3506	Cell culture
DMEM/F12	Gibco	1133032	DMEM/F12 (1x), liquid 1:1,Contains L-glutamine and 15 mM HEPES buffer
Fetal Bovine Serum	Gibco	10099141	Fetal Bovine Serum, Qualified, Australia Origin
Gelatin	SIGMA	G9391	Type B, powder, BioReagent, suitable for cell culture
HCG	Nanjing Aibei	M2520	Sterilization reagent, intraperitoneal injection, 50 IU/mL
Hyaluronidase	SIGMA	V900833	Reagent grade, powder
KSOM	Merck	MR-020P-D	(1x), Powder, w/o Phenol Red, 5 x 10 mL
L-glutamine	Gibco	25030081	L-glutamine-200 mM (100x), liquid
M2	Merck	MR-015-D	EmbryoMax M2 Medium (1x), Liquid, with Phenol Red
Mineral oil	SIGMA	M8410	Mineral oil is suitable for use as a cover layer to control evaporation and cross-contamination in various molecular biology applications
Penicillin-Streptomycin, liquid	Gibco	15140122	10,000 Units penicillin (base) and 10,000 units streptomycin (base), utilizing penicillin G (sodium salt) and streptomycin sulfate in 0.85% saline
PMSG	Nanjing Aibei	M2620	Sterilization reagent ,intraperitoneal injection, 50 IU/mL
Progesterone	SIGMA	5341	Steroid hormone secreted by the corpus luteum during the latter half of the menstrual cycle
Sodium pyruvate	Gibco	11360070	Sodium pyruvate is commonly added to cell culture media as a carbon source in addition to glucose
Stereomicroscope	Olympus	SZX7	Embryo retrieval and observation of embryo development