Etablissement d’un modèle d’implantation embryonnaire in vitro

Résumé

Ce protocole décrit des méthodologies permettant d’établir un modèle in vitro simple et efficace d’implantation embryonnaire pour évaluer les molécules pertinentes affectant le processus d’implantation embryonnaire.

Résumé

L’implantation embryonnaire est la première étape dans l’établissement d’une grossesse réussie. Un modèle in vitro d’implantation d’embryons est essentiel pour la recherche biologique fondamentale, le développement de médicaments et le dépistage. Cet article présente un modèle in vitro simple, rapide et très efficace pour l’implantation d’embryons. Dans ce protocole, nous introduisons d’abord l’acquisition de blastocystes de souris et la préparation de cellules d’adénocarcinome de l’endomètre humain (Ishikawa) pour l’implantation, puis la méthode de co-culture pour les embryons de souris et les cellules d’Ishikawa. Enfin, nous avons mené une étude pour évaluer l’impact de concentrations variables de 17-β-œstradiol (E₂) et de progestérone (P4) sur les taux d’adhésion embryonnaire sur la base de ce modèle. Nos résultats ont révélé que des concentrations élevées de E₂ réduisaient significativement l’adhésion embryonnaire, tandis que l’ajout de progestérone pouvait restaurer le taux d’adhésion. Ce modèle offre une plate-forme simple et rapide pour évaluer et cribler les molécules impliquées dans le processus d’adhésion, telles que les cytokines, les médicaments et les facteurs de transcription contrôlant l’implantation et la réceptivité de l’endomètre.

Introduction

L’implantation de l’embryon, première étape d’une grossesse réussie, est cruciale pour comprendre sa base biologique et relever les défis de l’infertilité. Cependant, les contraintes éthiques posent des limites importantes à la collecte d’échantillons cliniques d’embryons humains, ce qui entrave la recherche sur les interactions complexes entre les embryons humains et l’endomètre au début de la grossesse¹. Une compréhension approfondie de ces mécanismes complexes est essentielle pour faire progresser la recherche biologique fondamentale, la découverte de médicaments et la santé reproductive.

Des modèles in vitro antérieurs utilisaient des modèles d’adhésion où des cellules épithéliales endométriales humaines monocouches (RL95-2)² étaient co-cultivées avec des substituts embryonnaires, tels que les cellules de choriocarcinome BeWo, JAr ou Jeg-3³ . Néanmoins, le choix de la taille des sphéroïdes, allant de 70 à 100 μm, était crucial car des agrégats cellulaires plus grands ou plus petits pouvaient compromettre la précision de l’expérience. Notamment, seulement 25 % des sphéroïdes de chaque préparation répondaient à la norme pour^{la taille 4} appropriée, et il y avait des différences significatives par rapport aux conditions physiologiques des blastocystes.

De plus, les systèmes de culture tridimensionnels (3D) de l’endomètre et du blastocyste offrent un environnement physiologiquement plus pertinent⁵, mais ils nécessitent une expertise technique élevée, une croissance cellulaire lente, des coûts de ressources et de maintenance élevés, une difficulté de standardisation et une faible reproductibilité⁶.

Dans ce protocole, nous présentons un modèle in vitro rentable et rapide d’implantation d’embryons qui peut être développé et utilisé dans la plupart des laboratoires. L’objectif global de cette méthode est de fournir une plateforme fiable et reproductible pour l’étude des interactions entre l’embryon et l’endomètre dans un environnement contrôlé. En simulant les événements clés de l’implantation embryonnaire in vitro, ce modèle vise à combler le fossé entre les modèles animaux et les environnements cliniques, permettant une recherche plus précise et plus ciblée.

Par rapport aux substituts embryonnaires, l’utilisation de blastocystes de souris offre une représentation plus pertinente sur le plan physiologique du processus d’implantation embryonnaire in vivo⁷. De plus, la lignée cellulaire Ishikawa, dérivée de l’adénocarcinome de l’endomètre humain, possède des caractéristiques mixtes de l’épithélium glandulaire et de l’épithélium¹ de la lumière utérine, lui permettant d’exprimer des enzymes, des protéines structurelles et des récepteurs stéroïdiens fonctionnels similaires à ceux trouvés dans l’endomètre normal, fournissant ainsi un substrat physiologiquement pertinent pour l’implantation de l’embryon. La simplicité et la rapidité du système de co-culture permettent un dépistage à haut débit et des tests de drogues ^8,9,10. En fournissant une plate-forme robuste et reproductible, cette méthode offre la possibilité de faire progresser notre compréhension de l’implantation embryonnaire et de son impact sur la santé humaine.

Protocole

La manipulation des souris et les études expérimentales ont été réalisées selon des protocoles approuvés par le Comité des animaux de l’Institut de Shanghai pour les technologies biomédicales et pharmaceutiques. Assurez les procédures de sécurité : Portez toujours un équipement de protection individuelle (EPI) approprié lorsque vous manipulez des produits chimiques ou des matières biologiques.

1. Acquisition d’embryons de souris

REMARQUE : Cette section décrit le processus d’obtention d’embryons de souris. Des souris femelles adultes (âgées de 6 à 8 semaines, hybrides C57BL/6 et DBA/2) ont été maintenues dans des conditions environnementales standard de 12 h de lumière et 12 h d’obscurité à 20-25 °C et de 40 à 60 % d’humidité, avec de la nourriture et de l’eau fournies à volonté.

1. Injecter par voie intrapéritonéale chez des souris femelles 10 UI de gonadotrophine sérique de jument gravide (PMSG), puis injecter 10 UI de gonadotrophine chorionique humaine (HCG) à un intervalle de 42 à 48 heures.
2. Accouplez chaque souris femelle avec un mâle du même âge et vérifiez la présence d’un plug vaginal le lendemain matin.
   REMARQUE : Le plug vaginal est un morceau jaune clair de suppositoire formé après la solidification du sperme à l’ouverture vaginale.
3. Euthanasier les souris femelles avec des bouchons vaginaux par inhalation de CO₂ .
4. Ouvrez l’abdomen et localisez les organes génitaux féminins ; étirer l’oviducte, l’ovaire et les coussinets adipeux avec des pinces ; couper l’oviducte et l’ovaire avec des ciseaux ; puis coupez l’oviducte et l’utérus (Figure 1).
5. Transférez l’oviducte obtenu dans une boîte de Pétri de 35 mm préremplie de milieu M2.
   REMARQUE : Le milieu M2 doit être préchauffé dans un incubateur (37 °C, 5 % CO₂) pendant 30 min.
6. Perforer l’ampoule élargie de l’oviducte à l’aide d’une aiguille de 25 G pour libérer ou pincer le complexe cumulus-zygote (figure 2).
7. À l’aide d’une pince, transférez le complexe cumulus-zygote dans une solution M2 contenant 0,5 mg/mL d’hyaluronidase et incubez pendant plusieurs minutes jusqu’à ce que les cellules du cumulus se dissocient (figure 3).
8. Prélevez les zygotes à l’aide d’une pipette de transfert d’œufs et lavez-les dans un milieu M2 contenant 4 mg/mL de BSA pour éliminer les résidus de hyaluronidase, les cellules cumulus et les impuretés.

2. Culture in vitro d’embryons de souris

REMARQUE : Cette section détaille le processus de culture in vitro d’embryons de souris, des zygotes aux blastocystes. Les microgouttes de culture KSOM doivent être préparées 24 h à l’avance pour assurer l’équilibre entre la température et le gaz.

1. Préparez 12 microgouttelettes de milieu KSOM, d’un volume de 20 μL chacune, au fond d’une boîte de Pétri de 35 mm. Recouvrez les microgouttelettes de 3 à 5 ml d’huile minérale (figure 4) et placez les boîtes de Pétri dans un incubateur à 37 °C avec 5 % de CO₂ pour l’équilibre.
2. Transférez les embryons de souris du milieu M2 vers le milieu KSOM à l’aide d’une pipette de transfert pour un lavage en profondeur.
   REMARQUE : Cette étape nécessite un stéréomicroscope avec une platine de chauffage à 37 °C. Réduire au minimum la durée de la manipulation des embryons à l’extérieur de l’incubateur.
3. Placez les embryons lavés dans les microgouttelettes KSOM préparées et incubez-les à 37 °C avec 5% de CO₂ pendant 4 jours.
   REMARQUE : Pour assurer une nutrition adéquate, cultivez 5 à 10 embryons par microgoutte de 20 μL.
4. Sélectionnez les blastocystes avantageux en fonction de leur taille (100-130 μm), de leur masse cellulaire interne (la masse cellulaire interne est composée de nombreuses cellules toutes compactées), du nombre de cellules trophoblastiques (le trophectoderme est composé de nombreuses cellules cohésives et regroupées) et du degré d’expansion (le blastocoel occupe 80-100% de l’embryon).

3. Préparation des cellules endométriales

1. À l’intérieur d’une armoire de sécurité biologique, aspirer 1 mL de gélatine à 2 % à l’aide d’une pipette et le distribuer dans une plaque de culture à 12 puits. Tournez doucement la plaque pour assurer une couverture complète du fond avec la gélatine. Placez la plaque dans un incubateur à 37 °C pendant 30 min. Ensuite, aspirez l’excès de gélatine et laissez le fond de l’assiette sécher complètement.
2. Une fois le processus d’enrobage terminé, cultivez des cellules d’adénocarcinome de l’endomètre humain (Ishikawa) avec du DMEM/F12 (voir le tableau des matériaux pour plus de détails), 1 mM de pyruvate de sodium, 2 mM de L-glutamine, 100 μg/mL de streptomycine et 100 UI/mL de pénicilline, ensemencez-les dans les plaques à 12 puits recouvertes de gélatine (2 × 10⁵cellules/puits) et incubez pendant 24 h.

4. Attachement de l’embryon

1. Placez délicatement 5 à 15 blastocystes frais dans chaque puits de la plaque de 12 puits contenant des cellules d’Ishikawa préparée à l’étape précédente pour la co-culture (Figure 5).
2. Après 48 h d’incubation, observez les embryons au microscope pour évaluer leur état d’attachement. Pour observer l’attachement de l’embryon, déplacez rapidement la plaque trois fois. Les embryons non attachés présenteront un mouvement flottant ou roulant à la surface des cellules d’Ishikawa.
3. Calculer le taux d’implantation de l’embryon à l’aide de l’équation (1) ; Utilisez le taux d’adhésion de l’embryon pour représenter l’effet d’implantation.
   Taux d’implantation embryonnaire = (embryons attachés/nombre total d’embryons implantés) × 100% (1)

Résultats

Dans le processus des techniques de procréation assistée, l’hyperstimulation ovarienne contrôlée (COH) est une étape cruciale, conduisant à des niveaux d’œstrogènes significativement élevés chez les patientes de plus de 10 à 20 fois par rapport aux cycles naturels¹¹. Dans ce contexte, nous nous sommes demandé si des concentrations élevées d’œstrogènes sériques avaient un impact sur l’implantation d’embryons lors du transfert d’embryons frais. Sur la base de ce modèle ...

Discussion

La simplicité et la rapidité du modèle in vitro proposé pour l’implantation d’embryons offrent des avantages remarquables pour le dépistage précoce de médicaments et d’autres applications de recherche. La simplicité du protocole, associée à la nature à haut débit des lignées cellulaires d’Ishikawa, en fait un candidat idéal pour les criblages à grande échelle, en particulier dans les premières étapes de la découverte de médicaments. Liang¹³ a découvert que l?...

matériels

Name	Company	Catalog Number	Comments
17-β-estradiol	SIGMA	3301	Most potent mammalian estrogenic hormone
BD Falcon	BD	353001	Bacteriological Petri Dishes 35 x 10 mm style w/tight lid, crystal-grade virgin polystyrene, sterile
Biosafety Cabinet	ESCO	class BSC	Aseptic operations, making culture dishes, aliquoting reagents, etc
CO2 Incubator	Thermo	8000DH	Embryo culture
Culture plate	Corning	3506	Cell culture
DMEM/F12	Gibco	1133032	DMEM/F12 (1x), liquid 1:1,Contains L-glutamine and 15 mM HEPES buffer
Fetal Bovine Serum	Gibco	10099141	Fetal Bovine Serum, Qualified, Australia Origin
Gelatin	SIGMA	G9391	Type B, powder, BioReagent, suitable for cell culture
HCG	Nanjing Aibei	M2520	Sterilization reagent, intraperitoneal injection, 50 IU/mL
Hyaluronidase	SIGMA	V900833	Reagent grade, powder
KSOM	Merck	MR-020P-D	(1x), Powder, w/o Phenol Red, 5 x 10 mL
L-glutamine	Gibco	25030081	L-glutamine-200 mM (100x), liquid
M2	Merck	MR-015-D	EmbryoMax M2 Medium (1x), Liquid, with Phenol Red
Mineral oil	SIGMA	M8410	Mineral oil is suitable for use as a cover layer to control evaporation and cross-contamination in various molecular biology applications
Penicillin-Streptomycin, liquid	Gibco	15140122	10,000 Units penicillin (base) and 10,000 units streptomycin (base), utilizing penicillin G (sodium salt) and streptomycin sulfate in 0.85% saline
PMSG	Nanjing Aibei	M2620	Sterilization reagent ,intraperitoneal injection, 50 IU/mL
Progesterone	SIGMA	5341	Steroid hormone secreted by the corpus luteum during the latter half of the menstrual cycle
Sodium pyruvate	Gibco	11360070	Sodium pyruvate is commonly added to cell culture media as a carbon source in addition to glucose
Stereomicroscope	Olympus	SZX7	Embryo retrieval and observation of embryo development