香烟烟雾提取物刺激小鼠气道上皮细胞多组学分化和变化的体外模型

摘要

在这里，我们描述了一种用于分离和分化小鼠气道上皮细胞的 体外 模型，重点关注它们对慢性香烟烟雾提取物 （CSE） 的适应。该模型可用于全面表征 CSE 的多组学影响，这可能为了解慢性烟雾暴露下的细胞反应提供见解。

摘要

慢性阻塞性肺病 （COPD） 主要归因于烟草烟雾暴露。研究气道上皮细胞如何在功能上适应烟草烟雾对于了解 COPD 的发病机制至关重要。本研究是使用原代小鼠气道上皮细胞建立一个 体外 模型，以模拟烟草烟雾的现实影响。与已建立的细胞系不同，原代细胞保留了更多的 体内样特性，包括生长模式、衰老和分化。这些细胞表现出敏感的炎症反应和有效的分化，因此与生理状况密切相关。在该模型中，原代小鼠气道上皮细胞在气液界面下以最佳浓度的香烟烟雾提取物 （CSE） 培养 28 天，这导致单层未分化细胞转化为假复层柱状上皮，表明 CSE 驯化。然后应用全面的多组学分析来阐明 CSE 影响基底气道细胞分化的机制。这些见解有助于更深入地了解支撑 COPD 进展以应对烟草烟雾暴露的细胞过程。

引言

慢性阻塞性肺疾病 （COPD） 是一种具有复杂特征的异质性肺部疾病，而 COPD 患者逐渐趋于年轻化¹。吸烟是^{COPD 2} 的主要危险因素，对气道上皮细胞有深远影响，气道上皮细胞是抵御烟草烟雾的初始屏障。尽管存在这种已知的关联，但烟草烟雾诱导气道上皮细胞变化的详细机制仍未得到充分探索。彻底了解这些分子改变对于确定 COPD 的早期诊断标志物和治疗靶点至关重要。

为了解决这一差距，我们开发了一种使用小鼠气道上皮细胞的新型体外模型。这些细胞受到香烟烟雾提取物 （CSE） 的长期刺激，使我们能够监测动态细胞变化并探索气道上皮细胞在长期烟草刺激下的变化及其潜在机制。在该模型中，transwell 用于提供气道上皮细胞的气液界面，在上皮细胞分化的早期刺激香烟烟雾提取物，直到 28 天分化结束。以前的研究仅调查了气道上皮细胞的分化和短期刺激 （细胞系优势）。它们仅限于单一的调节途径 3,4,5,6。然而，这里介绍的方案使用原代小鼠气道上皮细胞，并优化了细胞提取过程，以获得比以前的气道上皮细胞培养方法更好的细胞活性。该模型侧....

研究方案

整个方案需要 44 天，包括从小鼠气管中分离的气道上皮细胞的制备 1 天、细胞增殖的 15 天和气液界面 CSE 刺激的 28 天。所有实验动物均饲养在首都医科大学动物实验中心的 SPF 屏障动物室，并经首都医科大学动物实验与实验动物伦理委员会 （AEEI-2020-100） 审查批准，符合 ARRIVE 指南⁷ 的要求。

1. 从小鼠气管中分离原代小鼠气道上皮细胞

1. 制备
   1. 通过将 1 mL 50x 添加剂和 0.05 mL 氢化可的松原液与 48.95 mL 扩增基础培养基混合来制备完全扩增培养基。储存在 4 °C 并在 4 周内使用。
   2. 将 7.5 mg 蛋白酶和 5 mg 脱氧核糖核酸酶 I 溶解在 5 mL Ham's F-12 中，制备蛋白酶溶液。过滤消毒并在 4 °C 下储存，并在 4 周内使用。
   3. 通过将 0.05 mL 100x 青霉素/链霉素和 0.01 mL 500x 庆大霉素/两性霉素添加到 5 mL 完全扩增培养基、PBS 和蛋白酶溶液（100 U/mL 青霉素、100 U/mL 链霉素、10 μg/mL 庆大霉素和 0.25 μg/mL 两性霉素 B）中来制备抗生素溶液。储存在 4 °C 并在 4 周内使用。
   4. 对手术器械进行消毒，并准备用于细胞分离的生物安全柜。同时，确保标准细....

讨论

COPD 是一种常见的慢性气道炎症性疾病。暴露于烟草烟雾会导致慢性气道炎症、气道重塑和肺结构破坏，这是各种结构细胞和免疫细胞相互作用的结果¹⁰。气道上皮细胞作为肺部先天免疫系统的前线，在疾病的发展过程中起着非常重要的作用¹¹。从这个角度来看，阐明上皮细胞在有害物质的刺激下如何改变和调节下游细胞，是一个亟待解决的科学问题。

材料

Name	Company	Catalog Number	Comments
100x Penicillin/Streptomycin solution	Gibco	15140122
24 mm Transwell with 0.4 µm Pore Polyester Membrane Insert, Sterile	BIOFIL	TCS016012
40 µm Cell Strainer	Falcon	352340
500x Gentamicin/Amphotericin Solution	Gibco	R01510
acetylated α-Tubulin	CST	#5335
Acetyl-α-Tubulin (Lys40) (D20G3)XP Rabbit mAb	cellsignal	#5335
Animal Component Free Cell Dissociation Kit	Stemcell	05426
Anti-pan Cytokeratin antibody	abcam	ab7753
Cigarette	Marlboro
Claudin3	immunoway	YT0949
Deoxyribonuclase I from bovine pancreas	Sigma-Aldrich	DN25
Deoxyribonuclase I from bovine pancreas	Sigma	DN25
Ham’s F-12	Sigma-Aldrich	N6658
Heparin Solution	Stemcell	07980
Hydrocortisone Stock Solution	Stemcell	07925
Mucin 5AC	abcam	ab212636
Occludin	proteintech	27260-1-AP
PBS	Cytosci	CBS004S-BR500
Penicillin-Streptomycin Solution	Gibco	15140122
PneumaCult-ALI Basal Medium	Stemcell	05002
PneumaCult-ALI 10x Supplement	Stemcell	05003
PneumaCult-ALI Maintenance Supplement	Stemcell	05006
PneumaCult-Ex Plus 50x Supplement	Stemcell	05042
PneumaCult-Ex Plus Basal Medium	Stemcell	05041
Pronase E	Sigma-Aldrich	P5147
Rat tail collagen	Corning	354236
Trypan Blue	Stemcell	07050