JoVE Logo
Yazarlar
Bize Ulaşın

Oturum Aç

Bu içeriği görüntülemek için JoVE aboneliği gereklidir. Oturum açın veya ücretsiz deneme sürümünü başlatın.

Bu Makalede

  • Özet
  • Özet
  • Giriş
  • Protokol
  • Sonuçlar
  • Tartışmalar
  • Açıklamalar
  • Teşekkürler
  • Malzemeler
  • Referanslar
  • Yeniden Basımlar ve İzinler

Özet

Burada, murin hava yolu epitel hücrelerini izole etmek ve farklılaştırmak için, kronik sigara dumanı ekstraktına (CSE) alışmalarına odaklanan bir in vitro model açıklıyoruz. Model, CSE'nin multi-omik etkisini kapsamlı bir şekilde karakterize etmek için kullanılabilir, bu da muhtemelen kronik duman maruziyeti altındaki hücresel tepkiler hakkında bilgi sağlar.

Özet

Kronik obstrüktif akciğer hastalığı (KOAH) büyük ölçüde tütün dumanı maruziyetine bağlıdır. Hava yolu epitel hücrelerinin tütün dumanına fonksiyonel olarak nasıl adapte olduğunu araştırmak KOAH patogenezini anlamak için çok önemlidir. Bu çalışma, tütün dumanının gerçek yaşam etkisini taklit etmek için primer murin hava yolu epitel hücrelerini kullanarak bir in vitro model oluşturmaktı. Yerleşik hücre dizilerinin aksine, birincil hücreler, büyüme modelleri, yaşlanma ve farklılaşma dahil olmak üzere daha fazla in vivo benzeri özellikleri korur. Bu hücreler hassas bir enflamatuar yanıt ve verimli farklılaşma sergiler, böylece fizyolojik koşulları yakından temsil eder. Bu modelde, primer murin hava yolu epitel hücreleri, optimal bir sigara dumanı ekstraktı (CSE) konsantrasyonuna sahip bir hava-sıvı arayüzü altında 28 gün boyunca kültürlendi, bu da farklılaşmamış hücrelerin tek tabakasının CSE iklimlendirmesinin göstergesi olan psödostratifiye bir kolumnar epitele dönüşmesine yol açtı. Daha sonra CSE'nin bazal hava yolu hücrelerinin farklılaşmasını etkilediği mekanizmaları aydınlatmak için kapsamlı multi-omik analizler uygulandı. Bu içgörüler, tütün dumanı maruziyetine yanıt olarak KOAH ilerlemesini destekleyen hücresel süreçlerin daha derin bir şekilde anlaşılmasını sağlar.

Giriş

Kronik obstrüktif akciğer hastalığı (KOAH), karmaşık özelliklere sahip heterojen bir akciğer rahatsızlığı iken, KOAH'lı hastalar yavaş yavaş daha genç olma eğilimindedir1. KOAH2 için birincil risk faktörü olan sigara, tütün dumanına karşı ilk bariyer görevi gören hava yolu epitel hücreleri üzerinde derin bir etkiye sahiptir. Bilinen bu ilişkiye rağmen, tütün dumanının hava yolu epitel hücrelerinde değişikliklere neden olduğu ayrıntılı mekanizmalar yeterince araştırılmamıştır. Bu moleküler değişikliklerin kapsamlı bir şekilde anlaşılması, KOAH için erken tanı belirteçlerinin ve terapötik hedeflerin belirlenmesi için gereklidir.

Bu boşluğu gidermek için, murin hava yolu epitel hücrelerini kullanarak yeni bir in vitro model geliştirdik. Bu hücreler, sigara dumanı ekstraktı (CSE) ile uzun süreli stimülasyona tabi tutuldu, bu da dinamik hücresel değişiklikleri izlememizi ve uzun süreli tütün stimülasyonu altında hava yolu epitel hücrelerindeki değişiklikleri ve altta yatan mekanizmayı keşfetmemizi sağladı. Bu modelde, hava yolu epitel hücrelerinin hava-sıvı arayüzünü sağlamak için transwell kullanıldı ve sigara dumanı ekstraktı, epitel hücresi farklılaşmasının erken evresinde, 28 günde farklılaşmanın sonuna kadar uyarıldı. Önceki çalışmalarda sadece hava yolu epitel hücrelerinin farklılaşması ve kısa süreli uyarılması (hücre hattı baskınlığı) araştırılmıştır. Tek bir düzenleyici yol 3,4,5,6 ile sınırlıydılar. Bununla birlikte, burada sunulan protokol, birincil fare hava yolu epitel hücrelerini kullanır ve önceki hava yolu epitel hücre kültürü yöntemlerinden daha iyi hücre aktivitesi için hücre ekstraksiyon sürecini optimize eder. Bu model, kapsamlı transkriptomik, proteomik, metabolomik ve epigenomik analizlerin yanı sıra hücresel farklılaşmadaki değişikliklere odaklanmaktadır. İmmünofloresan ve ileri multi-omik teknikler kullanarak, hava yolu epitel hücrelerinin kronik tütün dumanı maruziyetine hücresel yanıtlarını aydınlatmayı ve böylece KOAH patogenezinin daha derin bir şekilde anlaşılmasına katkıda bulunmayı amaçladık. Bu model, hava yolu epitel hücresi farklılaşma paternindeki değişiklikleri ve çeşitli kirleticilerin uzun süreli uyarılmasının neden olduğu mekanizmasını araştırmak için kullanılabilir.

Protokol

Genel protokol, murin trakealarından izole edilen hava yolu epitel hücrelerinin hazırlanması için 1 gün, hücre proliferasyonu için 15 gün ve hava-sıvı arayüzünde CSE stimülasyonu için 28 gün dahil olmak üzere 44 gün gerektirir. Tüm deney hayvanları, Capital Medical Üniversitesi Hayvan Deney Merkezi'nin SPF Bariyerli Hayvan Odası'nda barındırılmaktadır ve Capital Medical Üniversitesi Hayvan Deneyi ve Laboratuvar Hayvanları Etik Kurulu (AEEI-2020-100) tarafından ARRIVE yönergelerinin gerekliliklerini karşılamak için gözden geçirilmiş ve onaylanmıştır7.

1. Primer murin hava yolu epitel hücrelerinin murin trakealarından izolasyonu

  1. Hazırlık
    1. 1 mL 50x takviyesi ve 0.05 mL hidrokortizon stoğunu 48.95 mL genleşme bazal ortamı ile birleştirerek tam genleşme ortamı hazırlayın. 4 °C'de saklayın ve 4 hafta içinde kullanın.
    2. Bir proteinaz çözeltisi hazırlamak için 7.5 mg proteinaz ve 5 mg deoksiribonükleaz I'i 5 mL Ham'ın F-12'sinde çözün. Sterilize etmek ve 4 ° C'de saklamak için filtreleyin ve 4 hafta içinde kullanın.
    3. 5 mL tam genleşme ortamına, PBS'ye ve proteinaz çözeltisine (100 U / mL Penisilin, 100 U / mL Streptomisin, 10 μg / mL gentamisin ve 0.25 μg / mL amfoterisin B) 0.05 mL 100x penisilin / streptomisin ve 0.01 mL 500x gentamisin / amfoterisin ekleyerek antibiyotik çözeltileri hazırlayın. 4 °C'de saklayın ve 4 hafta içinde kullanın.
    4. Cerrahi aletleri sterilize edin ve biyolojik güvenlik kabinini hücre izolasyonu için hazırlayın. Aynı zamanda, standart hücre kültürü ekipmanının kullanıma hazır olduğundan emin olun.
    5. 100 mm kültür kaplarına ve 24 mm transwelllere (0,05 mL/cm2) sıçan kuyruğu kollajeni (0,02 N asetik asit içinde 100 μg/mL) ekleyerek sıçan kuyruğu kollajen kaplı tabaklar hazırlayın. Sterilizasyon için UV ışığı altında gece boyunca açık bırakın.
  2. Primer murin hava yolu epitel hücrelerinin izolasyonu
    1. Trakeal epitel hücre izolasyonu için C57BL / 6 fareleri (6-8 haftalık, erkek, SPF'li) kullanın. % 1 pentobarbital sodyum çözeltisi doz aşımı (yaklaşık 200 mg / kg) ile ötenazi yapın. Yeterli hücre verimi için beş fare kullanın.
    2. Alkolün trakeaya akmasını önlemek için fareyi% 75 etanol çözeltisine batırarak% 75 etanol çözeltisine batırarak sterilize edin.
    3. Fareyi inceleyin.
      1. Epidermisi alt çeneden farenin karın boşluğuna kesmek ve açmak için bir cihaz seti olan cerrahi bıçaklar ve forseps kullanın.
      2. Her iki taraftaki tiroid bezlerini koparmak ve trakea, çevredeki kas dokusu ve yemek borusu arasındaki bağlantıları çıkarmak için başka bir cerrahi alet seti kullanın.
      3. Bundan sonra, göğsü dikkatlice kesin, göğüs boşluğuna daha derine inmek için forseps kullanın, tüm akciğeri çıkarın ve trakeanın ucunu bulun.
    4. Trakeayı işleyin.
      1. Trakeayı tiroid kıkırdağından trakeo-bronşiyal dala kadar kesin ve dört antibiyotik içeren soğuk genleşme öncesi bir ortama koyun.
      2. Trakea yüzeyinden mümkün olduğunca fazla kanı durulamak için tüpü sallayın, buz üzerinde tutun ve ardından bir sonraki fare için ameliyata başlayın.
    5. Toplanan tüm trakeaları, sindirim öncesi ön tedavi için dört antibiyotik (200 U/mL Penisilin, 200 U/mL Streptomisin, 20 μg/mL gentamisin ve 0.5 μg/mL amfoterisin B) içeren soğuk öncesi PBS tamponuna aktarın.
    6. Trakea yüzeylerinden pıhtıları ve diğer dokuları çıkarmak için bir dizi cerrahi alet kullanın ve ardından bunları 1 cm2 boyutunda kesin.
    7. Trakeal dokuyu proteinaz çözeltisi içinde 37 ° C'de 40 dakika inkübe edin.
    8. 40 dakika sonra, tüpü birkaç kez sallayın ve kalan dokuları çıkarmak için 40 μm'lik bir hücre süzgeci kullanın. Doğranmış trakeaları 5 mL genleşme ortamı olan bir süzgeç üzerinde durulayın, hücre süspansiyonunu 400 x g'da 4 ° C'de 5 dakika santrifüjleyin ve süpernatanı atın.
    9. Elde edilen hücreleri 8 mL genleşme ortamında yeniden süspanse edin.
    10. Tripan mavisi ve bir hemositometre kullanarak canlı hücreleri sayın.
    11. Sıçan kuyruğu kollajeni ile önceden kaplanmış 100 mm'lik tabaklar (1 x 104 canlı hücre /cm2) üzerinde P0 hücre süspansiyonunu plakalayın ve hücreleri 37 ° C,% 5 CO2'de bir inkübatörde kültürleyin.

2. Primer murin hava yolu epitel hücrelerinin genişleme kültürü ve geçişi

  1. P0 hücre kültürü için ortamı, hücreler genellikle 6 gün içinde% 70 -% 80 birleşmeye ulaşana kadar her 3 günde bir değiştirin. Bu noktada, murin trakeal epitel hücreleri, parke taşı görünümünde sağlam bir tek tabaka oluşturabilir (Şekil 1A-D).
  2. Yeterli hacimlerde PBS, tam genleşme ortamı ve hayvan bileşeni içermeyen (ACF) hücre ayrışma kitini 37 °C'ye önceden ısıtın.
  3. Hücreleri 3 mL PBS ile nazikçe durulayın.
  4. Enzimatik ayrışma gerçekleştirin.
    1. Tabağa 3 mL ACF enzimatik ayrışma çözeltisi ekleyin ve 37 ° C'de 5 dakika inkübe edin. Pipetlemeden sonra, hücreleri nazikçe yerinden çıkarın ve hücre süspansiyonunu 3 mL ACF enzim inhibisyon çözeltisine aktarın.
    2. 3 mL ACF enzimatik ayrışma çözeltisi ilavesini tekrarlayın ve maksimum hücre ayrılmasını sağlamak için tekrar 5 dakika inkübe edin.
  5. Hücre süspansiyonunu 400 ° C'de 5 dakika boyunca 4 x g'da döndürün. Süpernatanı atın.
  6. Hücreleri 1 mL genleşme ortamında yeniden süspanse edin.
  7. Tripan mavisi ve bir hemositometre kullanarak canlı hücreleri sayın.
  8. Sıçan kuyruğu kollajeni ile önceden kaplanmış birkaç 100 mm'lik tabak (5 x 104 canlı hücre /cm2) üzerinde P1 hücre süspansiyonunu plakalayın ve hücreleri 37 ° C,% 5 CO2'de bir inkübatörde kültürleyin.

3. Hava-sıvı arayüzünde primer murin hava yolu epitel hücrelerinin farklılaşması ve CSE stimülasyonu

  1. Hücre türünü onaylayın.
    1. Sitokeratinlere karşı antikorlar içeren bir immünofloresan testi (IFA) kullanarak izole edilmiş hücrelerin epitel kökenini doğrulayın. Sıçan kuyruğu kollajeni ile kaplanmış cam slaytlar üzerindeki tohum hücreleri ve hücreler% 80 birleşmeye ulaştıktan sonra en az 12 saat boyunca sabitlemek için paraformaldehit kullanın.
    2. Slaytları PBS solüsyonu ile 3 kez 5 dakika yıkayın ve PBS solüsyonunda %3 BSA ve %0.1 triton X-100 ile oda sıcaklığında (RT) 1 saat inkübe edin.
    3. Slaytları gece boyunca 4 ° C'de 1:500 seyreltmede ticari anti-pan sitokeratin antikoru ile inkübe edin.
    4. Ertesi gün, slaytları 5 dakika boyunca PBS çözeltisi ile 3 kez yıkayın ve karanlıkta 2 saat boyunca RT'de 1:1000 seyreltmede ikincil antikor tamponu ile inkübe edin.
    5. İnkübasyondan sonra, slaytları PBS ile 3 kez yıkayın (yıkama başına 5 dakika) ve bunlara 1:1000 oranında seyrelterek DAPI ekleyin. RT'de 15 dakika inkübe ettikten sonra, slaytları PBS ile bir kez 5 dakika yıkayın.
    6. Slaytları bir floresan mikroskobu altında gözlemleyin ve ifade modellerini pozitif bir kontrol (A549 hücre hattı) ve bir negatif kontrol (Raw264.7 hücre hattı) ile karşılaştırın (Şekil 2).
  2. Farklılaşma için hücreleri tohumlayın.
    1. P2 hücrelerini daha önce tarif edildiği gibi ayırın ve santrifüjleyin ve 1 x 104 canlı hücre /cm2'nin kaplanmasını kolaylaştırmak için hücre peletini uygun bir hacimde genleşme ortamında yeniden süspanse edin.
    2. Transwell polikarbonat membran ekinin apikal haznesine 1 mL hücre süspansiyonu pipetleyin. Transwell'in bazal bölmesine 1.5 mL proliferasyon ortamı ekleyin.
  3. Hücreleri 37 ° C'de inkübe edin ve birleşme noktasına ulaşılana kadar genleşme ortamı kullanarak her 3 günde bir bazal ve apikal odalardaki tüm ortamı tamamen değiştirin. Bu genellikle 3-6 gün sürer.
  4. 44.15 mL ALI Bazal Besiyerine 5 mL ALI 10x Eki, 500 μL ALI Bakım Eki, 100 μL heparin çözeltisi ve 250 μL hidrokortizon stok çözeltisi ekleyerek 50 mL tam farklılaşma ortamı hazırlayın.
  5. ÖAM'yi hazırlayın.
    1. Bir sigarayı 12,5 mL farklılaştırma ortamından geçirin ve ardından CSE'yi hazırlamak için 0,22 μm'lik bir gözenek filtresinden süzün. Deneyler ve CSE grupları arasında standardizasyonu sağlamak için, bir spektrofotometrede 320 nm'de absorbansı ölçün ve 1'in optik yoğunluğunu (OD) %100 olarak tanımlayın8.
  6. Hücrelerin farklılaşması üzerindeki etkileri tespit etmek için primer murin hava yolu epitel hücrelerini uyarmak için uygun bir CSE konsantrasyonu içeren farklılaşma ortamını kullanın.
  7. Hücrelerin 28 gün boyunca farklılaşmasına izin verin, bu süre zarfında bazal oda ortamı değiştirilir ve apikal taraf, apikal oda ortamını çıkararak ve bazal oda ortamını uygun CSE konsantrasyonunu içeren farklılaşma ortamı ile değiştirerek haftada iki kez yıkanır.
  8. Maruz kalma sonrası hücreleri analiz edin.
    1. CSE içeren farklılaşma ortamına maruz kaldıktan sonra, hücreleri ve kültür süpernatantlarını herhangi bir zaman noktasında hasat edin (ör., 0-28 gün) morfolojik değişiklikleri tespit etmek için (ör., immünofloresan testi (IFA) veya hematoksilen-eozin boyama (HE) veya biyoinformatik analitik prosedürler (ör., transkriptomik, proteomik, metabolomik, vb.).

Sonuçlar

Farklılaştırma
Murin hava yolu epitel hücreleri, 28 gün boyunca bir farklılaşma ortamı ile bir hava-sıvı arayüzünde kültürlendikten sonra başarılı bir şekilde farklılaştı. Kirpikli ve goblet hücrelerinin varlığı, silia marker asetillenmiş α-Tubulin'in (yeşil; Şekil 3A) ve kadeh hücre markörü Mucin5AC, sırasıyla6 (kırmızı; Şekil 3B).

Hücre farklılaşması için CSE kon...

Tartışmalar

KOAH, sık görülen kronik hava yolu inflamatuar bir hastalıktır. Tütün dumanına maruz kalmak, çeşitli yapısal hücrelerin ve bağışıklık hücrelerinin etkileşiminin bir sonucu olan kronik hava yolu iltihabına, hava yolunun yeniden şekillenmesine ve akciğer yapısal tahribatına yol açar10. Akciğerde doğuştan gelen bağışıklık sisteminin ön cephesi olan hava yolu epitel hücreleri, hastalığın gelişimi sırasında çok önemli bir rol oynar11. B...

Açıklamalar

Yazarların ifşa edecek hiçbir şeyi yok.

Teşekkürler

Bu çalışma Çin Ulusal Doğa Bilimleri Vakfı (82090013) tarafından desteklenmiştir.

Malzemeler

NameCompanyCatalog NumberComments
100x Penicillin/Streptomycin solutionGibco15140122
24 mm Transwell with 0.4 µm Pore Polyester Membrane Insert, SterileBIOFILTCS016012
40 µm Cell StrainerFalcon352340
500x Gentamicin/Amphotericin SolutionGibcoR01510
acetylated α-TubulinCST#5335
Acetyl-α-Tubulin (Lys40) (D20G3)XP Rabbit mAb cellsignal#5335
Animal Component Free Cell Dissociation KitStemcell05426
Anti-pan Cytokeratin antibodyabcamab7753
CigaretteMarlboro
Claudin3immunowayYT0949
Deoxyribonuclase I from bovine pancreasSigma-AldrichDN25
Deoxyribonuclase I from bovine pancreasSigmaDN25
Ham’s F-12Sigma-AldrichN6658
Heparin Solution Stemcell07980
Hydrocortisone Stock SolutionStemcell07925
Mucin 5ACabcamab212636
Occludinproteintech27260-1-AP
PBSCytosciCBS004S-BR500
Penicillin-Streptomycin SolutionGibco15140122
PneumaCult-ALI
Basal Medium		Stemcell05002 
PneumaCult-ALI 10x SupplementStemcell05003 
PneumaCult-ALI Maintenance SupplementStemcell05006
PneumaCult-Ex Plus 50x SupplementStemcell05042
PneumaCult-Ex Plus Basal MediumStemcell05041
Pronase ESigma-AldrichP5147
Rat tail collagenCorning354236
Trypan BlueStemcell07050 

Referanslar

  1. Ritchie, A. I., Martinez, F. J. The challenges of defining early chronic obstructive pulmonary disease in the general population. Am J Respir Crit Care Med. 203 (10), 1209-1210 (2021).
  2. Caramori, G., Kirkham, P., Barczyk, A., Di Stefano, A., Adcock, I. Molecular pathogenesis of cigarette smoking-induced stable COPD. Ann N Y Acad Sci. 1340, 55-64 (2015).
  3. Leino, M. S., et al. Barrier disrupting effects of alternaria alternata extract on bronchial epithelium from asthmatic donors. PLoS One. 8 (8), e71278 (2013).
  4. Benediktsdóttir, B. E., Arason, A. J., Halldórsson, S., Gudjónsson, T., Másson, M., Baldursson, &. #. 2. 1. 1. ;. Drug delivery characteristics of the progenitor bronchial epithelial cell line VA10. Pharm Res. 30 (3), 781-791 (2013).
  5. Walters, M. S., et al. Generation of a human airway epithelium derived basal cell line with multipotent differentiation capacity. Respir Res. 14 (1), 135 (2013).
  6. Prytherch, Z., Job, C., Marshall, H., Oreffo, V., Foster, M., BéruBé, K. Tissue-specific stem cell differentiation in an in vitro airway model. Macromol Biosc. 11 (11), 1467-1477 (2011).
  7. Kilkenny, C., Browne, W., Cuthill, I. C., Emerson, M., Altman, D. G. Animal research: Reporting in vivo experiments: The ARRIVE guidelines. Br J Pharmacol. 160 (7), 1577-1579 (2010).
  8. Brekman, A., Walters, M. S., Tilley, A. E., Crystal, R. G. FOXJ1 prevents cilia growth inhibition by cigarette smoke in human airway epithelium in vitro. Am J Respir Cell Mol Biol. 51 (5), 688-700 (2014).
  9. Bajic, M., Maher, K. A., Deal, R. B. Identification of open chromatin regions in plant genomes using ATAC-seq. Methods Mol Biol. 1675, 183-201 (2018).
  10. Shaykhiev, R., Crystal, R. G. Early events in the pathogenesis of chronic obstructive pulmonary disease. Smoking-induced reprogramming of airway epithelial basal progenitor cells. Ann Am Thorac Soc. 11, S252-S258 (2014).
  11. Raby, K. L., Michaeloudes, C., Tonkin, J., Chung, K. F., Bhavsar, P. K. Mechanisms of airway epithelial injury and abnormal repair in asthma and COPD. Front Immunol. 14, 1201658 (2023).
  12. Zhou, J. -. S., et al. Cigarette smoke-initiated autoimmunity facilitates sensitisation to elastin-induced COPD-like pathologies in mice. Eur Respir J. 56 (3), 2000404 (2020).
  13. Lam, H. C., Choi, A. M. K., Ryter, S. W. Isolation of mouse respiratory epithelial cells and exposure to experimental cigarette smoke at air-liquid interface. J Vis Exp. (48), e2513 (2011).
  14. You, Y., Brody, S. L. Culture and differentiation of mouse tracheal epithelial cells. Methods Mol Biol. 945, 123-143 (2012).
  15. Wandalsen, G. F., Lanza, F. d. e. C., Nogueira, M. C. P., Solé, D. Efficacy and safety of chloral hydrate sedation in infants for pulmonary function tests. Rev Paul Pediatr. 34 (4), 408-411 (2016).
  16. Jiang, D., Schaefer, N., Chu, H. W. Air-liquid interface culture of human and mouse airway epithelial cells. Methods Mol Biol. 1809, 91-109 (2018).
  17. Takagi, R., et al. How to prevent contamination with Candida albicans during the fabrication of transplantable oral mucosal epithelial cell sheets. Regen Ther. 1, 1-4 (2015).
  18. Culp, D. J., Latchney, L. R. Mucinlike glycoproteins from cat tracheal gland cells in primary culture. Am J Physiol. 265 (3), L260-L269 (1993).
  19. Cao, X., et al. Invited review: human air-liquid-interface organotypic airway tissue models derived from primary tracheobronchial epithelial cells-overview and perspectives. In Vitro Cell Dev Biol Anim. 57 (2), 104-132 (2021).
  20. Bebök, Z., Tousson, A., Schwiebert, L. M., Venglarik, C. J. Improved oxygenation promotes CFTR maturation and trafficking in MDCK monolayers. Am J Physiol Cell Physiol. 280 (1), C135-C145 (2001).

Yeniden Basımlar ve İzinler

Bu JoVE makalesinin metnini veya resimlerini yeniden kullanma izni talebi

Izin talebi

Daha Fazla Makale Keşfet

Bo De erSay 209Sigara Duman EkstresiFarkl la maMulti omikKOAHT t n Duman Maruziyeti

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Gizlilik

Kullanım Şartları

İlkeler

Bize Ulaşın

KÜTÜPHANEYE TAVSİYE ET

JoVE HABER BÜLTENLERİ

Araştırma

Eğitim

Yazarlar

Kütüphaneciler

JoVE Hakkında

Telif Hakkı © 2020 MyJove Corporation. Tüm hakları saklıdır