Sigara Dumanı Ekstraktı ile Uyarılan Murin Hava Yolu Epitel Hücrelerinde Multi-Omiklerin Farklılaşması ve Değişikliklerinin İncelenmesi için İn Vitro Model

Özet

Burada, murin hava yolu epitel hücrelerini izole etmek ve farklılaştırmak için, kronik sigara dumanı ekstraktına (CSE) alışmalarına odaklanan bir in vitro model açıklıyoruz. Model, CSE'nin multi-omik etkisini kapsamlı bir şekilde karakterize etmek için kullanılabilir, bu da muhtemelen kronik duman maruziyeti altındaki hücresel tepkiler hakkında bilgi sağlar.

Özet

Kronik obstrüktif akciğer hastalığı (KOAH) büyük ölçüde tütün dumanı maruziyetine bağlıdır. Hava yolu epitel hücrelerinin tütün dumanına fonksiyonel olarak nasıl adapte olduğunu araştırmak KOAH patogenezini anlamak için çok önemlidir. Bu çalışma, tütün dumanının gerçek yaşam etkisini taklit etmek için primer murin hava yolu epitel hücrelerini kullanarak bir in vitro model oluşturmaktı. Yerleşik hücre dizilerinin aksine, birincil hücreler, büyüme modelleri, yaşlanma ve farklılaşma dahil olmak üzere daha fazla in vivo benzeri özellikleri korur. Bu hücreler hassas bir enflamatuar yanıt ve verimli farklılaşma sergiler, böylece fizyolojik koşulları yakından temsil eder. Bu modelde, primer murin hava yolu epitel hücreleri, optimal bir sigara dumanı ekstraktı (CSE) konsantrasyonuna sahip bir hava-sıvı arayüzü altında 28 gün boyunca kültürlendi, bu da farklılaşmamış hücrelerin tek tabakasının CSE iklimlendirmesinin göstergesi olan psödostratifiye bir kolumnar epitele dönüşmesine yol açtı. Daha sonra CSE'nin bazal hava yolu hücrelerinin farklılaşmasını etkilediği mekanizmaları aydınlatmak için kapsamlı multi-omik analizler uygulandı. Bu içgörüler, tütün dumanı maruziyetine yanıt olarak KOAH ilerlemesini destekleyen hücresel süreçlerin daha derin bir şekilde anlaşılmasını sağlar.

Giriş

Kronik obstrüktif akciğer hastalığı (KOAH), karmaşık özelliklere sahip heterojen bir akciğer rahatsızlığı iken, KOAH'lı hastalar yavaş yavaş daha genç olma eğilimindedir¹. KOAH² için birincil risk faktörü olan sigara, tütün dumanına karşı ilk bariyer görevi gören hava yolu epitel hücreleri üzerinde derin bir etkiye sahiptir. Bilinen bu ilişkiye rağmen, tütün dumanının hava yolu epitel hücrelerinde değişikliklere neden olduğu ayrıntılı mekanizmalar yeterince araştırılmamıştır. Bu moleküler değişikliklerin kapsamlı bir şekilde anlaşılması, KOAH için erken tanı belirteçlerinin ve terapötik hedeflerin belirlenmesi için gerek....

Protokol

Genel protokol, murin trakealarından izole edilen hava yolu epitel hücrelerinin hazırlanması için 1 gün, hücre proliferasyonu için 15 gün ve hava-sıvı arayüzünde CSE stimülasyonu için 28 gün dahil olmak üzere 44 gün gerektirir. Tüm deney hayvanları, Capital Medical Üniversitesi Hayvan Deney Merkezi'nin SPF Bariyerli Hayvan Odası'nda barındırılmaktadır ve Capital Medical Üniversitesi Hayvan Deneyi ve Laboratuvar Hayvanları Etik Kurulu (AEEI-2020-100) tarafından ARRIVE yönergelerinin gerekliliklerini karşılamak için gözden geçirilmiş ve onaylanmıştır⁷.

1. Primer murin hava yolu epitel hücrelerinin murin trakealar....

Tartışmalar

KOAH, sık görülen kronik hava yolu inflamatuar bir hastalıktır. Tütün dumanına maruz kalmak, çeşitli yapısal hücrelerin ve bağışıklık hücrelerinin etkileşiminin bir sonucu olan kronik hava yolu iltihabına, hava yolunun yeniden şekillenmesine ve akciğer yapısal tahribatına yol açar¹⁰. Akciğerde doğuştan gelen bağışıklık sisteminin ön cephesi olan hava yolu epitel hücreleri, hastalığın gelişimi sırasında çok önemli bir rol oynar¹¹. B.......

Malzemeler

Name	Company	Catalog Number	Comments
100x Penicillin/Streptomycin solution	Gibco	15140122
24 mm Transwell with 0.4 µm Pore Polyester Membrane Insert, Sterile	BIOFIL	TCS016012
40 µm Cell Strainer	Falcon	352340
500x Gentamicin/Amphotericin Solution	Gibco	R01510
acetylated α-Tubulin	CST	#5335
Acetyl-α-Tubulin (Lys40) (D20G3)XP Rabbit mAb	cellsignal	#5335
Animal Component Free Cell Dissociation Kit	Stemcell	05426
Anti-pan Cytokeratin antibody	abcam	ab7753
Cigarette	Marlboro
Claudin3	immunoway	YT0949
Deoxyribonuclase I from bovine pancreas	Sigma-Aldrich	DN25
Deoxyribonuclase I from bovine pancreas	Sigma	DN25
Ham’s F-12	Sigma-Aldrich	N6658
Heparin Solution	Stemcell	07980
Hydrocortisone Stock Solution	Stemcell	07925
Mucin 5AC	abcam	ab212636
Occludin	proteintech	27260-1-AP
PBS	Cytosci	CBS004S-BR500
Penicillin-Streptomycin Solution	Gibco	15140122
PneumaCult-ALI Basal Medium	Stemcell	05002
PneumaCult-ALI 10x Supplement	Stemcell	05003
PneumaCult-ALI Maintenance Supplement	Stemcell	05006
PneumaCult-Ex Plus 50x Supplement	Stemcell	05042
PneumaCult-Ex Plus Basal Medium	Stemcell	05041
Pronase E	Sigma-Aldrich	P5147
Rat tail collagen	Corning	354236
Trypan Blue	Stemcell	07050