Modèle in vitro pour l’étude de la différenciation et des modifications de la multi-omique sur des cellules épithéliales des voies respiratoires murines stimulées par un extrait de fumée de cigarette

Résumé

Ici, nous décrivons un modèle in vitro pour isoler et différencier les cellules épithéliales des voies respiratoires murines, en nous concentrant sur leur acclimatation à l’extrait chronique de fumée de cigarette (ECS). Le modèle pourrait être utilisé pour caractériser de manière exhaustive l’impact multi-omique de l’ECS, ce qui pourrait donner un aperçu des réponses cellulaires en cas d’exposition chronique à la fumée.

Résumé

La bronchopneumopathie chronique obstructive (MPOC) est largement attribuée à l’exposition à la fumée de tabac. L’étude de la façon dont les cellules épithéliales des voies respiratoires s’adaptent fonctionnellement à la fumée de tabac est cruciale pour comprendre la pathogenèse de la BPCO. La présente étude visait à mettre en place un modèle in vitro utilisant des cellules épithéliales primaires des voies respiratoires murines pour imiter l’impact réel de la fumée de tabac. Contrairement aux lignées cellulaires établies, les cellules primaires conservent davantage de propriétés in vivo, notamment les modèles de croissance, le vieillissement et la différenciation. Ces cellules présentent une réponse inflammatoire sensible et une différenciation efficace, représentant ainsi étroitement les conditions physiologiques. Dans ce modèle, des cellules épithéliales primaires des voies respiratoires murines ont été cultivées pendant 28 jours sous une interface air-liquide avec une concentration optimale d’extrait de fumée de cigarette (CSE), ce qui a conduit à la transformation d’une monocouche de cellules indifférenciées en un épithélium cylindrique pseudostratifié, indiquant une acclimatation au CSE. Des analyses multi-omiques complètes ont ensuite été appliquées pour élucider les mécanismes par lesquels la CSE influence la différenciation des cellules basales des voies respiratoires. Ces informations permettent de mieux comprendre les processus cellulaires qui sous-tendent la progression de la BPCO en réponse à l’exposition à la fumée de tabac.

Introduction

La bronchopneumopathie chronique obstructive (BPCO) est une affection pulmonaire hétérogène aux caractéristiques complexes, tandis que les patients atteints de BPCO ont progressivement tendance à être plus jeunes¹. Le tabagisme, principal facteur de risque de la BPCO², a un impact profond sur les cellules épithéliales des voies respiratoires, qui servent de barrière initiale contre la fumée de tabac. Malgré cette association connue, les mécanismes détaillés par lesquels la fumée de tabac induit des changements dans les cellules épithéliales des voies respiratoires restent insuffisamment explorés. Une compréhension approfondie de ces altérations moléculaires est essentielle pour identifier des marqueurs diagnostiques précoces et des cibles thérapeutiques de la BPCO.

Pour combler cette lacune, nous avons développé un nouveau modèle in vitro utilisant des cellules épithéliales murines des voies respiratoires. Ces cellules ont été soumises à une stimulation à long terme avec de l’extrait de fumée de cigarette (CSE), ce qui nous a permis de surveiller les changements cellulaires dynamiques et d’explorer les changements dans les cellules épithéliales des voies respiratoires sous stimulation à long terme du tabac et le mécanisme sous-jacent. Dans ce modèle, transwell a été utilisé pour fournir l’interface air-liquide des cellules épithéliales des voies respiratoires, et l’extrait de fumée de cigarette a été stimulé au stade précoce de la différenciation des cellules épithéliales jusqu’à la fin de la différenciation à 28 jours. Des études antérieures n’ont porté que sur la différenciation et la stimulation à court terme des cellules épithéliales des voies respiratoires (dominance de la lignée cellulaire). Ils étaient limités à une seule voie réglementaire 3,4,5,6. Cependant, le protocole présenté ici utilise des cellules épithéliales primaires des voies respiratoires de souris et optimise le processus d’extraction cellulaire pour une meilleure activité cellulaire que les méthodes précédentes de culture de cellules épithéliales des voies respiratoires. Ce modèle se concentre sur les altérations de la différenciation cellulaire ainsi que sur des analyses transcriptomiques, protéomiques, métabolomiques et épigénomiques complètes. En utilisant l’immunofluorescence et des techniques multi-omiques avancées, nous avons cherché à élucider les réponses cellulaires des cellules épithéliales des voies respiratoires à l’exposition chronique à la fumée de tabac, contribuant ainsi à une compréhension plus approfondie de la pathogenèse de la BPCO. Ce modèle peut être utilisé pour explorer les changements dans le modèle de différenciation des cellules épithéliales des voies respiratoires et son mécanisme causé par la stimulation à long terme de divers polluants.

Protocole

Le protocole global nécessite 44 jours, dont 1 jour pour la préparation des cellules épithéliales des voies respiratoires isolées des trachées murines, 15 jours pour la prolifération cellulaire et 28 jours pour la stimulation CSE à l’interface air-liquide. Tous les animaux de laboratoire sont hébergés dans la salle des animaux de barrière SPF du Centre d’expérimentation animale de l’Université médicale de la capitale et ont été examinés et approuvés par le Comité d’éthique de l’expérimentation animale et des animaux de laboratoire de l’Université médicale de la capitale (AEEI-2020-100) pour répondre aux exigences des directives ARRIVE⁷.

1. Isolement des cellules épithéliales primaires des voies respiratoires murines à partir des trachées murines

1. Préparation
   1. Préparez un milieu d’expansion complet en combinant 1 mL de supplément 50x et 0,05 mL de stock d’hydrocortisone avec 48,95 mL de milieu basal d’expansion. Conserver à 4 °C et utiliser dans les 4 semaines.
   2. Dissoudre 7,5 mg de protéinase et 5 mg de désoxyribonucléase I dans 5 mL de F-12 de Ham pour préparer une solution de protéinase. Filtrez-le pour le stériliser et conservez-le à 4 °C et utilisez-le dans les 4 semaines.
   3. Préparez des solutions antibiotiques en ajoutant 0,05 mL de pénicilline/streptomycine 100x et 0,01 mL de gentamicine/amphotéricine 500x à 5 mL de milieu d’expansion complète, de PBS et de solution de protéinase (100 U/mL de pénicilline, 100 U/mL de streptomycine, 10 μg/mL de gentamicine et 0,25 μg/mL d’amphotéricine B). Conserver à 4 °C et utiliser dans les 4 semaines.
   4. Stérilisez les instruments chirurgicaux et préparez l’enceinte de sécurité biologique pour l’isolement des cellules. En même temps, assurez-vous que l’équipement de culture cellulaire standard est prêt à l’emploi.
   5. Préparez des plats enrobés de collagène pour la queue de rat en ajoutant du collagène de queue de rat (100 μg/mL dans de l’acide acétique 0,02 N) dans des boîtes de culture de 100 mm et des transwells de 24 mm (0,05 mL/cm²). Laisser ouvert toute la nuit sous la lumière UV pour la stérilisation.
2. Isolement des cellules épithéliales primaires des voies respiratoires murines
   1. Utilisez des souris C57BL/6 (âgées de 6 à 8 semaines, mâles, avec un FPS élevé) pour l’isolement des cellules épithéliales trachéales. Euthanasier avec une solution de pentobarbital sodique à 1 % (environ 200 mg/kg). Utilisez cinq souris pour un rendement cellulaire suffisant.
   2. Stérilisez la souris par immersion dans une solution d’éthanol à 75 %, sans immerger le nez et la bouche dans l’alcool pour éviter que l’alcool ne coule dans la trachée.
   3. Disséquez la souris.
      1. Utilisez des lames chirurgicales et des pinces, un ensemble de dispositifs pour couper et ouvrir l’épiderme de la mâchoire inférieure à la cavité abdominale de la souris.
      2. Utilisez un autre ensemble d’instruments chirurgicaux pour déchirer les glandes thyroïdes des deux côtés et enlever les connexions entre la trachée, le tissu musculaire environnant et l’œsophage.
      3. Après cela, coupez soigneusement dans la poitrine, utilisez des pinces pour plonger plus profondément dans la cavité thoracique, retirez tout le poumon et trouvez l’extrémité de la trachée.
   4. Traitez la trachée.
      1. Coupez la trachée du cartilage thyroïdien à la branche trachéo-bronchique et mettez-la dans un milieu d’expansion pré-froid contenant quatre antibiotiques.
      2. Secouez le tube pour rincer autant de sang que possible de la surface de la trachée, maintenez-le sur de la glace, puis commencez l’opération pour la souris suivante.
   5. Transférez toutes les trachées prélevées dans un tampon PBS pré-froid contenant quatre antibiotiques (200 μ/ml de pénicilline, 200 μg/ml de streptomycine, 20 μg/ml de gentamicine et 0,5 μg/ml d’amphotéricine B) pour le prétraitement avant la digestion.
   6. Utilisez un ensemble d’instruments chirurgicaux pour retirer les caillots et autres tissus des surfaces de la trachée, puis coupez-les en 1 cm² .
   7. Incuber le tissu trachéal dans une solution de protéinase à 37 °C pendant 40 min.
   8. Après 40 min, secouez le tube plusieurs fois et utilisez une passoire à cellules de 40 μm pour retirer les tissus restants. Rincer les trachées hachées sur une passoire avec 5 mL de milieu d’expansion, centrifuger la suspension cellulaire à 400 x g pendant 5 min à 4 °C et jeter le surnageant.
   9. Remettre en suspension les cellules obtenues dans 8 mL de milieu d’expansion.
   10. Comptez les cellules viables à l’aide de bleu trypan et d’un hémocytomètre.
   11. Suspension cellulaire P0 sur des boîtes de 100 mm (1 x 10⁴ cellules vivantes/cm²) pré-enrobées de collagène de queue de rat, et culture des cellules dans un incubateur à 37 °C, 5% CO₂.

2. Culture d’expansion et passage des cellules épithéliales primaires des voies respiratoires murines

1. Remplacez le milieu pour la culture cellulaire P0 tous les 3 jours jusqu’à ce que les cellules atteignent 70 % à 80 % de confluence, généralement dans les 6 jours. À ce stade, les cellules épithéliales trachéales murines peuvent former une monocouche intacte avec un aspect de pavé (Figure 1A-D).
2. Préchauffez des volumes suffisants de PBS, de milieu d’expansion complet et de kit de dissociation cellulaire sans composants animaux (ACF) à 37 °C.
3. Rincez doucement les cellules avec 3 ml de PBS.
4. Effectuer une dissociation enzymatique.
   1. Ajouter 3 mL de solution de dissociation enzymatique d’ACF dans la boîte et incuber à 37 °C pendant 5 min. Après le pipetage, délogez doucement les cellules et transférez la suspension cellulaire dans 3 mL de solution d’inhibition de l’enzyme ACF.
   2. Répétez l’ajout de 3 mL de solution de dissociation enzymatique ACF et incubez à nouveau pendant 5 min pour assurer un détachement cellulaire maximal.
5. Faites tourner la suspension cellulaire à 400 x g pendant 5 min à 4 °C. Jetez le surnageant.
6. Remettre les cellules en suspension dans 1 mL de milieu d’expansion.
7. Comptez les cellules viables à l’aide de bleu trypan et d’un hémocytomètre.
8. Suspension cellulaire P1 sur plusieurs boîtes de 100 mm (5 x 10 4^{cellules vivantes} /^cm2) pré-enrobées de collagène de queue de rat, et culture des cellules dans un incubateur à 37 °C, 5% CO₂.

3. Différenciation et stimulation CSE des cellules épithéliales primaires des voies respiratoires murines à l’interface air-liquide

1. Confirmez le type de cellule.
   1. Vérifiez l’origine épithéliale de cellules isolées à l’aide d’un test d’immunofluorescence (IFA) avec des anticorps contre les cytokératines. Ensemencez les cellules sur des lames de verre recouvertes de collagène de queue de rat et utilisez du paraformaldéhyde pour les fixer pendant au moins 12 heures après que les cellules ont atteint 80% de confluence.
   2. Lavez les lames 3 fois avec une solution PBS pendant 5 min et incubez-les avec 3% de BSA et 0,1% de triton X-100 dans une solution PBS à température ambiante (RT) pendant 1 h.
   3. Incuber les lames pendant la nuit à 4 °C avec un anticorps anti-cytokératine pan-dentaire commercial à une dilution de 1:500.
   4. Le lendemain, laver les lames 3 fois avec une solution de PBS pendant 5 minutes et les incuber avec un tampon d’anticorps secondaire à une dilution de 1:1000 à RT pendant 2 h dans l’obscurité.
   5. Après l’incubation, laver les lames 3 fois avec du PBS (5 min par lavage) et y ajouter du DAPI à une dilution de 1:1000. Après l’incubation à RT pendant 15 min, laver les lames une fois avec du PBS pendant 5 min.
   6. Observez les lames au microscope à fluorescence et comparez les profils d’expression à ceux d’un témoin positif (lignée cellulaire A549) et d’un témoin négatif (lignée cellulaire Raw264.7) (Figure 2).
2. Ensemencez les cellules pour la différenciation.
   1. Détachez et centrifugez les cellules P2 comme décrit précédemment, et mettez à nouveau en suspension la pastille cellulaire dans un volume approprié de milieu d’expansion pour faciliter le placage de 1 x 10⁴ cellules vivantes/cm².
   2. Pipeter 1 mL de suspension cellulaire sur la chambre apicale de l’insert de membrane en polycarbonate transwell. Dans le compartiment basal du transpuits, ajouter 1,5 mL de milieu de prolifération.
3. Incuber les cellules à 37 °C et changer complètement tout le milieu dans les chambres basale et apicale tous les 3 jours à l’aide d’un milieu d’expansion jusqu’à ce que la confluence soit atteinte. Cela prend généralement de 3 à 6 jours.
4. Préparez 50 ml de milieu de différenciation complet en ajoutant 5 ml de supplément ALI 10x, 500 μL de supplément d’entretien ALI, 100 μL de solution d’héparine et 250 μL de solution mère d’hydrocortisone à 44,15 ml de milieu basal ALI.
5. Préparer l’ECS.
   1. Faites buliser une cigarette dans 12,5 mL de milieu de différenciation, puis filtrez-la à travers un filtre à pores de 0,22 μm pour préparer le CSE. Pour assurer la standardisation entre les expériences et les lots de CSE, mesurez l’absorbance à 320 nm sur un spectrophotomètre et définissez la densité optique (DO) de 1 comme 100 %⁸.
6. Utilisez le milieu de différenciation contenant une concentration appropriée de CSE pour stimuler les cellules épithéliales primaires des voies respiratoires murines afin de détecter les effets sur la différenciation des cellules.
7. Laissez les cellules se différencier pendant 28 jours, au cours desquels le milieu de la chambre basale est changé et la face apicale est lavée deux fois par semaine en retirant le milieu de la chambre apicale et en remplaçant le milieu de la chambre basale par le milieu de différenciation contenant la concentration appropriée de CSE.
8. Analysez les cellules après l’exposition.
   1. Après l’exposition à un milieu de différenciation contenant de l’ECS, prélever les cellules et les surnageants de culture à n’importe quel moment (c.-à-d. de 0 à 28 jours) pour détecter les changements morphologiques (c.-à-d. test d’immunofluorescence (IFA) ou coloration à l’hématoxyline-éosine (HE) ou pour les procédures analytiques bio-informatiques (c’est-à-dire transcriptomique, protéomique, métabolomique, etc.).

Résultats

Différenciation
Les cellules épithéliales des voies respiratoires murines se sont différenciées avec succès après culture à une interface air-liquide avec un milieu de différenciation pendant 28 jours. La présence de cellules ciliées et caliciformes a été démontrée par un dosage par immunofluorescence d’un marqueur de cils acétylé α-tubuline (vert ; Graphique 3A) et le marqueur de cellules caliciformes Mucin5AC, respectivement6 (rouge ;

Discussion

La BPCO est une maladie inflammatoire chronique courante des voies respiratoires. L’exposition à la fumée de tabac entraîne une inflammation chronique des voies respiratoires, un remodelage des voies respiratoires et une destruction structurelle des poumons, qui est le résultat de l’interaction de diverses cellules structurelles et cellules immunitaires¹⁰. En tant que première ligne du système immunitaire inné dans les poumons, les cellules épithéliales des voies respiratoires jouent ...

matériels

Name	Company	Catalog Number	Comments
100x Penicillin/Streptomycin solution	Gibco	15140122
24 mm Transwell with 0.4 µm Pore Polyester Membrane Insert, Sterile	BIOFIL	TCS016012
40 µm Cell Strainer	Falcon	352340
500x Gentamicin/Amphotericin Solution	Gibco	R01510
acetylated α-Tubulin	CST	#5335
Acetyl-α-Tubulin (Lys40) (D20G3)XP Rabbit mAb	cellsignal	#5335
Animal Component Free Cell Dissociation Kit	Stemcell	05426
Anti-pan Cytokeratin antibody	abcam	ab7753
Cigarette	Marlboro
Claudin3	immunoway	YT0949
Deoxyribonuclase I from bovine pancreas	Sigma-Aldrich	DN25
Deoxyribonuclase I from bovine pancreas	Sigma	DN25
Ham’s F-12	Sigma-Aldrich	N6658
Heparin Solution	Stemcell	07980
Hydrocortisone Stock Solution	Stemcell	07925
Mucin 5AC	abcam	ab212636
Occludin	proteintech	27260-1-AP
PBS	Cytosci	CBS004S-BR500
Penicillin-Streptomycin Solution	Gibco	15140122
PneumaCult-ALI Basal Medium	Stemcell	05002
PneumaCult-ALI 10x Supplement	Stemcell	05003
PneumaCult-ALI Maintenance Supplement	Stemcell	05006
PneumaCult-Ex Plus 50x Supplement	Stemcell	05042
PneumaCult-Ex Plus Basal Medium	Stemcell	05041
Pronase E	Sigma-Aldrich	P5147
Rat tail collagen	Corning	354236
Trypan Blue	Stemcell	07050