Modelo in vitro para estudo da diferenciação e alterações de multiômicas em células epiteliais das vias aéreas murinas estimuladas com extrato de fumaça de cigarro

Resumo

Aqui, descrevemos um modelo in vitro para isolar e diferenciar células epiteliais das vias aéreas murinas, com foco em sua aclimatação ao extrato de fumaça de cigarro crônico (CSE). O modelo pode ser utilizado para caracterizar de forma abrangente o impacto multi-ômico do CSE, o que possivelmente fornece informações sobre as respostas celulares sob exposição crônica à fumaça.

Resumo

A doença pulmonar obstrutiva crônica (DPOC) é amplamente atribuída à exposição à fumaça do tabaco. Investigar como as células epiteliais das vias aéreas se adaptam funcionalmente à fumaça do tabaco é crucial para entender a patogênese da DPOC. O presente estudo foi estabelecer um modelo in vitro usando células epiteliais primárias das vias aéreas murinas para imitar o impacto da fumaça do tabaco na vida real. Ao contrário das linhagens celulares estabelecidas, as células primárias retêm mais propriedades semelhantes às in vivo, incluindo padrões de crescimento, envelhecimento e diferenciação. Essas células exibem uma resposta inflamatória sensível e diferenciação eficiente, representando de perto as condições fisiológicas. Nesse modelo, células epiteliais primárias das vias aéreas murinas foram cultivadas por 28 dias sob uma interface ar-líquido com uma concentração ótima de extrato de fumaça de cigarro (CSE), o que levou à transformação de uma monocamada de células indiferenciadas em um epitélio colunar pseudoestratificado, indicativo de aclimatação ao CSE. Análises multiômicas abrangentes foram então aplicadas para elucidar os mecanismos pelos quais o CSE influencia a diferenciação das células basais das vias aéreas. Esses insights fornecem uma compreensão mais profunda dos processos celulares que sustentam a progressão da DPOC em resposta à exposição à fumaça do tabaco.

Introdução

A doença pulmonar obstrutiva crônica (DPOC) é uma condição pulmonar heterogênea com características complexas, enquanto os pacientes com DPOC tendem gradualmente a ser mais jovens¹. O tabagismo, um fator de risco primário para DPOC², tem um impacto profundo nas células epiteliais das vias aéreas, que servem como barreira inicial contra a fumaça do tabaco. Apesar dessa associação conhecida, os mecanismos detalhados pelos quais a fumaça do tabaco induz alterações nas células epiteliais das vias aéreas permanecem inadequadamente explorados. Uma compreensão completa dessas alterações moleculares é essencial para identificar marcadores diagnósticos precoces e alvos terapêuticos para a DPOC.

Para resolver essa lacuna, desenvolvemos um novo modelo in vitro usando células epiteliais das vias aéreas murinas. Essas células foram submetidas a estimulação de longo prazo com extrato de fumaça de cigarro (CSE), permitindo-nos monitorar as mudanças celulares dinâmicas e explorar as mudanças nas células epiteliais das vias aéreas sob estimulação de tabaco de longo prazo e o mecanismo subjacente. Nesse modelo, o transwell foi usado para fornecer a interface ar-líquido das células epiteliais das vias aéreas, e o extrato de fumaça de cigarro foi estimulado no estágio inicial da diferenciação das células epiteliais até o final da diferenciação aos 28 dias. Estudos anteriores investigaram apenas a diferenciação e estimulação de curto prazo das células epiteliais das vias aéreas (dominância da linha celular). Eles foram limitados a uma única via regulatória 3,4,5,6. No entanto, o protocolo apresentado aqui usa células epiteliais primárias das vias aéreas de camundongos e otimiza o processo de extração celular para uma melhor atividade celular do que os métodos anteriores de cultura de células epiteliais das vias aéreas. Este modelo se concentra em alterações na diferenciação celular juntamente com análises transcriptômicas, proteômicas, metabolômicas e epigenômicas abrangentes. Empregando imunofluorescência e técnicas multiômicas avançadas, nosso objetivo foi elucidar as respostas celulares das células epiteliais das vias aéreas à exposição crônica à fumaça do tabaco, contribuindo assim para uma compreensão mais profunda da patogênese da DPOC. Este modelo pode ser usado para explorar as mudanças no padrão de diferenciação das células epiteliais das vias aéreas e seu mecanismo causado pela estimulação de longo prazo de vários poluentes.

Protocolo

O protocolo geral requer 44 dias, incluindo 1 dia para preparação de células epiteliais das vias aéreas isoladas de traqueias murinas, 15 dias para proliferação celular e 28 dias para estimulação de CSE na interface ar-líquido. Todos os animais experimentais estão alojados na Sala de Animais de Barreira SPF do Centro de Experimentos Animais da Capital Medical University e foram revisados e aprovados pelo Comitê de Ética em Animais de Laboratório e Experimentos Animais da Capital Medical University (AEEI-2020-100) para atender aos requisitos das diretrizes ARRIVE⁷.

1. Isolamento de células epiteliais primárias das vias aéreas murinas das traqueias murinas

1. Preparação
   1. Prepare o meio de expansão completo combinando 1 mL de suplemento 50x e 0,05 mL de estoque de hidrocortisona com 48,95 mL de meio basal de expansão. Conservar a 4 °C e utilizar no prazo de 4 semanas.
   2. Dissolva 7,5 mg de proteinase e 5 mg de desoxirribonuclease I em 5 mL de F-12 de Ham para preparar uma solução de proteinase. Filtre-o para esterilizar e armazenar a 4 °C e use dentro de 4 semanas.
   3. Prepare soluções antibióticas adicionando 0,05 mL de penicilina/estreptomicina 100x e 0,01 mL de gentamicina/anfotericina 500x a 5 mL de meio de expansão completo, PBS e solução de proteinase (penicilina 100 U/mL, estreptomicina 100 U/mL, gentamicina 10 μg/mL e 0,25 μg/mL de anfotericina B). Conservar a 4 °C e utilizar no prazo de 4 semanas.
   4. Esterilize os instrumentos cirúrgicos e prepare a cabine de segurança biológica para o isolamento celular. Simultaneamente, certifique-se de que o equipamento padrão de cultura de células esteja pronto para uso.
   5. Prepare pratos revestidos com colágeno de cauda de rato adicionando colágeno de cauda de rato (100 μg / mL em ácido acético 0,02 N) em placas de cultura de 100 mm e transwells de 24 mm (0,05 mL / cm²). Deixe aberto durante a noite sob luz ultravioleta para esterilização.
2. Isolamento de células epiteliais primárias das vias aéreas murinas
   1. Use camundongos C57BL / 6 (6-8 semanas de idade, machos, levantados com FPS) para isolamento de células epiteliais traqueais. Eutanasiar com overdose de solução de pentobarbital sódico a 1% (cerca de 200 mg/kg). Use cinco camundongos para obter rendimento celular suficiente.
   2. Esterilize o camundongo por imersão em solução de etanol a 75%, não mergulhando o nariz e a boca em álcool para evitar que o álcool flua para a traqueia.
   3. Disseque o mouse.
      1. Use lâminas cirúrgicas e fórceps, um conjunto de dispositivos para cortar e abrir a epiderme da mandíbula inferior até a cavidade abdominal do camundongo.
      2. Use outro conjunto de instrumentos cirúrgicos para separar as glândulas tireoides de ambos os lados e remover as conexões entre a traqueia, o tecido muscular circundante e o esôfago.
      3. Depois disso, corte cuidadosamente o peito, use uma pinça para mergulhar mais fundo na cavidade torácica, retire todo o pulmão e encontre o final da traqueia.
   4. Processe a traqueia.
      1. Corte a traqueia da cartilagem tireóide até o ramo traqueobrônquico e coloque-a em um meio de expansão pré-frio contendo quatro antibióticos.
      2. Agite o tubo para enxaguar o máximo de sangue possível da superfície da traqueia, mantenha-o no gelo e inicie a cirurgia para o próximo camundongo.
   5. Transfira todas as traqueias coletadas para o tampão PBS pré-resfriado contendo quatro antibióticos (200 U / mL de penicilina, 200 U / mL de estreptomicina, 20 μg / mL de gentamicina e 0,5 μg / mL de anfotericina B) para pré-tratamento antes da digestão.
   6. Use um conjunto de instrumentos cirúrgicos para remover coágulos e outros tecidos das superfícies da traqueia e, em seguida, corte-os no tamanho 1 cm² .
   7. Incubar o tecido traqueal em solução de proteinase a 37 °C durante 40 min.
   8. Após 40 min, balance o tubo várias vezes e use um filtro de células de 40 μm para remover os tecidos restantes. Lave as traqueias picadas em uma peneira com 5 mL de meio de expansão, centrifugue a suspensão celular a 400 x g por 5 min a 4 ° C e descarte o sobrenadante.
   9. Ressuspenda as células obtidas em 8 mL de meio de expansão.
   10. Conte as células viáveis usando azul de tripano e um hemocitômetro.
   11. Suspensão de células da placa P0 em placas de 100 mm (1 x 10⁴ células vivas/cm²) pré-revestidas com colágeno de cauda de rato e cultivar as células em uma incubadora a 37 ° C, 5% CO₂.

2. Cultura de expansão e passagem de células epiteliais primárias das vias aéreas murinas

1. Substitua o meio para a cultura de células P0 a cada 3 dias até que as células atinjam 70%-80% de confluência, geralmente dentro de 6 dias. Nesse ponto, as células epiteliais traqueais murinas podem formar uma monocamada intacta com aparência de paralelepípedo (Figura 1A-D).
2. Pré-aqueça volumes suficientes de PBS, meio de expansão completo e kit de dissociação celular sem componentes animais (ACF) a 37 °C.
3. Enxágue suavemente as células com 3 mL de PBS.
4. Realize a dissociação enzimática.
   1. Adicione 3 ml de solução de dissociação enzimática ACF à cápsula e incube a 37 °C durante 5 min. Após a pipetagem, desalojar as células suavemente e transferir a suspensão celular para 3 ml de solução de inibição enzimática ACF.
   2. Repita a adição de 3 mL de solução de dissociação enzimática ACF e incube novamente por 5 min para garantir o descolamento máximo das células.
5. Girar a suspensão celular a 400 x g durante 5 min a 4 °C. Descarte o sobrenadante.
6. Ressuspenda as células em 1 mL de meio de expansão.
7. Conte as células viáveis usando azul de tripano e um hemocitômetro.
8. Suspensão de células da placa P1 em vários pratos de 100 mm (5 x 10⁴ células vivas/cm²) pré-revestidos com colagénio de cauda de rato e cultura das células numa incubadora a 37 °C, 5% de CO₂.

3. Diferenciação e estimulação de CSE de células epiteliais primárias das vias aéreas murinas na interface ar-líquido

1. Confirme o tipo de célula.
   1. Verificar a origem epitelial das células isoladas usando um ensaio de imunofluorescência (IFA) com anticorpos contra citoqueratinas. As células da semente em lâminas de vidro revestidas por colágeno de cauda de rato usam paraformaldeído para fixá-las por pelo menos 12 h após as células atingirem 80% de confluência.
   2. Lave as lâminas 3 vezes com solução de PBS por 5 min e incube-as com 3% de BSA e 0,1% de triton X-100 em solução de PBS em temperatura ambiente (RT) por 1 h.
   3. Incubar as lâminas durante a noite a 4 °C com anticorpo anticitoqueratina anti-pan comercial a uma diluição de 1:500.
   4. No dia seguinte, lavar as lâminas 3 vezes com solução de PBS durante 5 min e incubá-las com tampão de anticorpos secundários a uma diluição de 1:1000 em RT durante 2 h no escuro.
   5. Após a incubação, lave as lâminas 3 vezes com PBS (5 min por lavagem) e adicione DAPI a uma diluição de 1:1000. Após incubação em RT por 15 min, lave as lâminas uma vez com PBS por 5 min.
   6. Observe as lâminas sob um microscópio de fluorescência e compare os padrões de expressão com um controle positivo (linha celular A549) e um controle negativo (linha celular Raw264.7) (Figura 2).
2. Semeie as células para diferenciação.
   1. Separar e centrifugar as células P2 conforme descrito anteriormente e ressuspender o sedimento celular em um volume apropriado de meio de expansão para facilitar o plaqueamento de 1 x 10⁴ células vivas/cm².
   2. Pipete 1 mL de suspensão celular na câmara apical da inserção da membrana de policarbonato transwell. No compartimento basal do transpoço, adicione 1,5 mL de meio de proliferação.
3. Incubar as células a 37 °C e mudar completamente todo o meio nas câmaras basal e apical a cada 3 dias usando meio de expansão até atingir a confluência. Isso normalmente leva de 3 a 6 dias.
4. Prepare 50 mL de meio de diferenciação completo adicionando 5 mL de suplemento ALI 10x, 500 μL de suplemento de manutenção ALI, 100 μL de solução de heparina e 250 μL de solução estoque de hidrocortisona a 44,15 mL de meio basal ALI.
5. Prepare CSE.
   1. Borbulhe um cigarro através de 12,5 mL de meio de diferenciação e, em seguida, filtre-o através de um filtro de poros de 0,22 μm para preparar o CSE. Para garantir a padronização entre experimentos e lotes de CSE, medir a absorbância a 320 nm em um espectrofotômetro e definir a densidade óptica (DO) de 1 como 100%⁸.
6. Utilizar o meio de diferenciação que contém uma concentração adequada de CSE para estimular as células epiteliais primárias das vias aéreas murinas a fim de detectar efeitos na diferenciação das células.
7. Permitir que as células se diferenciem durante 28 dias, durante os quais o meio da câmara basal é mudado e o lado apical é lavado duas vezes por semana, removendo o meio da câmara apical e substituindo o meio da câmara basal pelo meio de diferenciação que contém a concentração adequada de CSE.
8. Analise as células pós-exposição.
   1. Após a exposição ao meio de diferenciação contendo CSE, colher as células e os sobrenadantes da cultura a qualquer momento (ou seja, 0-28 dias) para detectar alterações morfológicas (ou seja, ensaio de imunofluorescência (IFA) ou coloração de hematoxilina-eosina (HE) ou para procedimentos analíticos de bioinformática (ou seja, transcriptômica, proteômica, metabolômica, etc.).

Resultados

Diferenciação
As células epiteliais das vias aéreas murinas se diferenciaram com sucesso após a cultura em uma interface ar-líquido com um meio de diferenciação por 28 dias. A presença de células ciliadas e caliciformes foi demonstrada pelo ensaio de imunofluorescência do marcador de cílios acetilado α-Tubulina (verde; Figura 3A) e o marcador de células caliciformes Mucin5AC, respectivamente6 (vermelho; Figura 3B).

Discussão

A DPOC é uma doença inflamatória crônica comum das vias aéreas. A exposição à fumaça do tabaco leva à inflamação crônica das vias aéreas, remodelação das vias aéreas e destruição estrutural pulmonar, que é o resultado da interação de várias células estruturais e células imunes¹⁰. Como linha de frente do sistema imunológico inato no pulmão, as células epiteliais das vias aéreas desempenham um papel muito importante durante o desenvolvimento da doença^1...

Materiais

Name	Company	Catalog Number	Comments
100x Penicillin/Streptomycin solution	Gibco	15140122
24 mm Transwell with 0.4 µm Pore Polyester Membrane Insert, Sterile	BIOFIL	TCS016012
40 µm Cell Strainer	Falcon	352340
500x Gentamicin/Amphotericin Solution	Gibco	R01510
acetylated α-Tubulin	CST	#5335
Acetyl-α-Tubulin (Lys40) (D20G3)XP Rabbit mAb	cellsignal	#5335
Animal Component Free Cell Dissociation Kit	Stemcell	05426
Anti-pan Cytokeratin antibody	abcam	ab7753
Cigarette	Marlboro
Claudin3	immunoway	YT0949
Deoxyribonuclase I from bovine pancreas	Sigma-Aldrich	DN25
Deoxyribonuclase I from bovine pancreas	Sigma	DN25
Ham’s F-12	Sigma-Aldrich	N6658
Heparin Solution	Stemcell	07980
Hydrocortisone Stock Solution	Stemcell	07925
Mucin 5AC	abcam	ab212636
Occludin	proteintech	27260-1-AP
PBS	Cytosci	CBS004S-BR500
Penicillin-Streptomycin Solution	Gibco	15140122
PneumaCult-ALI Basal Medium	Stemcell	05002
PneumaCult-ALI 10x Supplement	Stemcell	05003
PneumaCult-ALI Maintenance Supplement	Stemcell	05006
PneumaCult-Ex Plus 50x Supplement	Stemcell	05042
PneumaCult-Ex Plus Basal Medium	Stemcell	05041
Pronase E	Sigma-Aldrich	P5147
Rat tail collagen	Corning	354236
Trypan Blue	Stemcell	07050