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In questo articolo

  • Riepilogo
  • Abstract
  • Introduzione
  • Protocollo
  • Risultati
  • Discussione
  • Divulgazioni
  • Riconoscimenti
  • Materiali
  • Riferimenti
  • Ristampe e Autorizzazioni

Riepilogo

Qui, descriviamo un modello in vitro per isolare e differenziare le cellule epiteliali delle vie aeree murine, concentrandosi sulla loro acclimatazione all'estratto di fumo di sigaretta cronico (CSE). Il modello potrebbe essere utilizzato per caratterizzare in modo completo l'impatto multi-omico della CSE, che potrebbe fornire informazioni sulle risposte cellulari in condizioni di esposizione cronica al fumo.

Abstract

La broncopneumopatia cronica ostruttiva (BPCO) è in gran parte attribuita all'esposizione al fumo di tabacco. Studiare come le cellule epiteliali delle vie aeree si adattano funzionalmente al fumo di tabacco è fondamentale per comprendere la patogenesi della BPCO. Il presente studio consisteva nella creazione di un modello in vitro utilizzando cellule epiteliali primarie delle vie aeree murine per imitare l'impatto del fumo di tabacco nella vita reale. A differenza delle linee cellulari consolidate, le cellule primarie conservano proprietà più simili a quelle in vivo, tra cui i modelli di crescita, l'invecchiamento e la differenziazione. Queste cellule mostrano una risposta infiammatoria sensibile e una differenziazione efficiente, rappresentando così da vicino le condizioni fisiologiche. In questo modello, le cellule epiteliali primarie delle vie aeree murine sono state coltivate per 28 giorni sotto un'interfaccia aria-liquido con una concentrazione ottimale di estratto di fumo di sigaretta (CSE), che ha portato alla trasformazione di un monostrato di cellule indifferenziate in un epitelio colonnare pseudostratificato, indicativo dell'acclimatazione al CSE. Sono state quindi applicate analisi multi-omiche complete per chiarire i meccanismi con cui la CSE influenza la differenziazione delle cellule delle vie aeree basali. Queste intuizioni forniscono una comprensione più profonda dei processi cellulari alla base della progressione della BPCO in risposta all'esposizione al fumo di tabacco.

Introduzione

La broncopneumopatia cronica ostruttiva (BPCO) è una condizione polmonare eterogenea con caratteristiche complesse, mentre i pazienti con BPCO tendono gradualmente ad essere più giovani1. Il fumo, un fattore di rischio primario per la BPCO2, ha un profondo impatto sulle cellule epiteliali delle vie aeree, che fungono da barriera iniziale contro il fumo di tabacco. Nonostante questa associazione nota, i meccanismi dettagliati attraverso i quali il fumo di tabacco induce cambiamenti nelle cellule epiteliali delle vie aeree rimangono inadeguatamente esplorati. Una comprensione approfondita di queste alterazioni molecolari è essenziale per identificare i marcatori diagnostici precoci e i bersagli terapeutici per la BPCO.

Per colmare questa lacuna, abbiamo sviluppato un nuovo modello in vitro utilizzando cellule epiteliali murine delle vie aeree. Queste cellule sono state sottoposte a stimolazione a lungo termine con estratto di fumo di sigaretta (CSE), consentendoci di monitorare i cambiamenti cellulari dinamici ed esplorare i cambiamenti nelle cellule epiteliali delle vie aeree sotto stimolazione del tabacco a lungo termine e il meccanismo sottostante. In questo modello, il transwell è stato utilizzato per fornire l'interfaccia aria-liquido delle cellule epiteliali delle vie aeree e l'estratto di fumo di sigaretta è stato stimolato nella fase iniziale della differenziazione delle cellule epiteliali fino alla fine della differenziazione a 28 giorni. Studi precedenti hanno indagato solo la differenziazione e la stimolazione a breve termine delle cellule epiteliali delle vie aeree (dominanza della linea cellulare). Erano limitati a un unico percorso regolatorio 3,4,5,6. Tuttavia, il protocollo qui presentato utilizza cellule epiteliali primarie delle vie aeree di topo e ottimizza il processo di estrazione cellulare per una migliore attività cellulare rispetto ai precedenti metodi di coltura di cellule epiteliali delle vie aeree. Questo modello si concentra sulle alterazioni del differenziamento cellulare insieme ad analisi trascrittomiche, proteomiche, metabolomiche ed epigenomiche complete. Utilizzando l'immunofluorescenza e tecniche multi-omiche avanzate, abbiamo mirato a chiarire le risposte cellulari delle cellule epiteliali delle vie aeree all'esposizione cronica al fumo di tabacco, contribuendo così a una comprensione più profonda della patogenesi della BPCO. Questo modello può essere utilizzato per esplorare i cambiamenti nel modello di differenziazione delle cellule epiteliali delle vie aeree e il suo meccanismo causato dalla stimolazione a lungo termine di vari inquinanti.

Protocollo

Il protocollo complessivo richiede 44 giorni, di cui 1 giorno per la preparazione delle cellule epiteliali delle vie aeree isolate da trachee murine, 15 giorni per la proliferazione cellulare e 28 giorni per la stimolazione CSE all'interfaccia aria-liquido. Tutti gli animali da esperimento sono ospitati nella SPF Barrier Animal Room dell'Animal Experiment Center della Capital Medical University e sono stati esaminati e approvati dall'Animal Experiment and Laboratory Animal Ethics Committee della Capital Medical University (AEEI-2020-100) per soddisfare i requisiti delle linee guida ARRIVE7.

1. Isolamento di cellule epiteliali primarie delle vie aeree murine da trachee murine

  1. Preparazione
    1. Preparare il terreno di espansione completo combinando 1 mL di integratore 50x e 0,05 mL di brodo di idrocortisone con 48,95 mL di terreno basale di espansione. Conservare a 4 °C e consumare entro 4 settimane.
    2. Sciogliere 7,5 mg di proteinasi e 5 mg di desossiribonucleasi I in 5 mL di F-12 di Ham per preparare una soluzione di proteinasi. Filtrarlo per sterilizzarlo e conservarlo a 4 °C e utilizzarlo entro 4 settimane.
    3. Preparare soluzioni antibiotiche aggiungendo 0,05 mL di 100x penicillina/streptomicina e 0,01 mL di 500x gentamicina/amfotericina a 5 mL di mezzo di espansione completo, PBS e soluzione di proteinasi (100 U/mL di penicillina, 100 U/mL di streptomicina, 10 μg/mL di gentamicina e 0,25 μg/mL di amfotericina B). Conservare a 4 °C e consumare entro 4 settimane.
    4. Sterilizzare gli strumenti chirurgici e preparare la cabina di sicurezza biologica per l'isolamento cellulare. Allo stesso tempo, assicurarsi che l'attrezzatura standard per la coltura cellulare sia pronta per l'uso.
    5. Preparare piastre rivestite di collagene con coda di ratto aggiungendo collagene di coda di ratto (100 μg/mL in acido acetico 0,02 N) in piastre di coltura da 100 mm e pozzetti da 24 mm (0,05 mL/cm2). Lasciare aperto per una notte sotto la luce UV per la sterilizzazione.
  2. Isolamento delle cellule epiteliali primarie delle vie aeree murine
    1. Utilizzare topi C57BL/6 (6-8 settimane, maschi, con SPF rialzato) per l'isolamento delle cellule epiteliali tracheali. Eutanasia con sovradosaggio di soluzione di pentobarbital sodico all'1% (circa 200 mg/kg). Usa cinque topi per una resa cellulare sufficiente.
    2. Sterilizzare il topo immergendolo in una soluzione di etanolo al 75%, non immergendo il naso e la bocca nell'alcol per evitare che l'alcol fluisca nella trachea.
    3. Seziona il mouse.
      1. Utilizzare lame e pinze chirurgiche, una serie di dispositivi per tagliare e aprire l'epidermide dalla mascella inferiore alla cavità addominale del topo.
      2. Usa un altro set di strumenti chirurgici per strappare le ghiandole tiroidee su entrambi i lati e rimuovere le connessioni tra la trachea, il tessuto muscolare circostante e l'esofago.
      3. Dopodiché, taglia con cura il torace, usa il forcipe per scavare più a fondo nella cavità toracica, estrai l'intero polmone e trova la fine della trachea.
    4. Elabora la trachea.
      1. Tagliare la trachea dalla cartilagine tiroidea al ramo tracheo-bronchiale e metterla in un terreno di espansione pre-freddo contenente quattro antibiotici.
      2. Agitare il tubo per sciacquare quanto più sangue possibile dalla superficie della trachea, tenerlo in ghiaccio e quindi iniziare l'intervento chirurgico per il topo successivo.
    5. Trasferire tutte le trachee raccolte in un tampone PBS pre-freddo contenente quattro antibiotici (200 U/mL di penicillina, 200 U/mL di streptomicina, 20 μg/mL di gentamicina e 0,5 μg/mL di amfotericina B) per il pretrattamento prima della digestione.
    6. Utilizzare una serie di strumenti chirurgici per rimuovere coaguli e altri tessuti dalle superfici della trachea, quindi tagliarli in una dimensione di 1 cm2 .
    7. Incubare il tessuto tracheale in soluzione di proteinasi a 37 °C per 40 min.
    8. Dopo 40 minuti, agitare più volte la provetta e utilizzare un colino cellulare da 40 μm per rimuovere i tessuti rimanenti. Sciacquare le trachee tritate su un colino con 5 ml di terreno di espansione, centrifugare la sospensione cellulare a 400 x g per 5 minuti a 4 °C ed eliminare il surnatante.
    9. Risospendere le cellule ottenute in 8 mL di terreno di espansione.
    10. Contare le cellule vitali utilizzando il blu di tripano e un emocitometro.
    11. Sospensione cellulare su piastra P0 su piastre da 100 mm (1 x 104 cellule vive/cm2) prerivestite con collagene di coda di ratto e coltura delle cellule in un incubatore a 37 °C, 5% CO2.

2. Coltura di espansione e passaggio di cellule epiteliali primarie delle vie aeree murine

  1. Sostituire il terreno per la coltura cellulare P0 ogni 3 giorni fino a quando le cellule raggiungono la confluenza del 70%-80%, di solito entro 6 giorni. A questo punto, le cellule epiteliali tracheali murine possono formare un monostrato intatto con un aspetto di ciottoli (Figura 1A-D).
  2. Preriscaldare volumi sufficienti di PBS, terreno di espansione completo e kit di dissociazione cellulare privo di componenti animali (ACF) a 37 °C.
  3. Sciacquare delicatamente le cellule con 3 ml di PBS.
  4. Eseguire la dissociazione enzimatica.
    1. Aggiungere 3 mL di soluzione di dissociazione enzimatica ACF alla piastra e incubare a 37 °C per 5 minuti. Dopo il pipettaggio, rimuovere delicatamente le cellule e trasferire la sospensione cellulare in 3 mL di soluzione di inibizione dell'enzima ACF.
    2. Ripetere l'aggiunta di 3 mL di soluzione di dissociazione enzimatica ACF e incubare nuovamente per 5 minuti per garantire il massimo distacco cellulare.
  5. Far girare la sospensione cellulare a 400 x g per 5 min a 4 °C. Scartare il surnatante.
  6. Risospendere le cellule in 1 mL di terreno di espansione.
  7. Contare le cellule vitali utilizzando il blu di tripano e un emocitometro.
  8. Sospensione cellulare su piastra P1 su diverse piastre da 100 mm (5 x 104 cellule vive/cm2) pre-rivestite con collagene di coda di ratto e coltura delle cellule in un incubatore a 37 °C, 5% CO2.

3. Differenziamento e stimolazione CSE di cellule epiteliali primarie murine delle vie aeree all'interfaccia aria-liquido

  1. Confermare il tipo di cella.
    1. Verificare l'origine epiteliale delle cellule isolate utilizzando un test di immunofluorescenza (IFA) con anticorpi contro le citocheratine. Seminare le cellule su vetrini rivestiti di collagene a coda di ratto e utilizzare la paraformaldeide per fissarle per almeno 12 ore dopo che le cellule hanno raggiunto l'80% di confluenza.
    2. Lavare i vetrini 3 volte con la soluzione di PBS per 5 minuti e incubarli con il 3% di BSA e lo 0,1% di tritone X-100 in soluzione PBS a temperatura ambiente (RT) per 1 ora.
    3. Incubare i vetrini per una notte a 4 °C con anticorpo commerciale anti-pan citocheratina alla diluizione di 1:500.
    4. Il giorno successivo, lavare i vetrini 3 volte con la soluzione di PBS per 5 minuti e incubarli con tampone anticorpale secondario a una diluizione di 1:1000 a RT per 2 ore al buio.
    5. Dopo l'incubazione, lavare i vetrini 3 volte con PBS (5 minuti per lavaggio) e aggiungere DAPI a una diluizione di 1:1000. Dopo l'incubazione in RT per 15 minuti, lavare una volta i vetrini con PBS per 5 minuti.
    6. Osservare i vetrini al microscopio a fluorescenza e confrontare i pattern di espressione con un controllo positivo (linea cellulare A549) e un controllo negativo (linea cellulare Raw264.7) (Figura 2).
  2. Semina le cellule per la differenziazione.
    1. Staccare e centrifugare le celle P2 come descritto in precedenza e risospendere il pellet della cella in un volume appropriato di mezzo di espansione per facilitare la placcatura di 1 x 104 cellule vive/cm2.
    2. Pipettare 1 mL di sospensione cellulare sulla camera apicale dell'inserto della membrana in policarbonato transwell. Al compartimento basale del pozzetto trans, aggiungere 1,5 mL di terreno di proliferazione.
  3. Incubare le cellule a 37 °C e cambiare completamente tutto il terreno nelle camere basale e apicale ogni 3 giorni utilizzando il terreno di espansione fino a raggiungere la confluenza. Questo richiede in genere 3-6 giorni.
  4. Preparare 50 mL di terreno di differenziazione completo aggiungendo 5 mL di ALI 10x Supplement, 500 μL di ALI Maintenance Supplement, 100 μL di soluzione di eparina e 250 μL di soluzione madre di idrocortisone a 44,15 mL di ALI Basal Medium.
  5. Prepara CSE.
    1. Far bollire una sigaretta attraverso 12,5 ml di terreno di differenziazione e poi filtrarla attraverso un filtro per pori da 0,22 μm per preparare il CSE. Per garantire la standardizzazione tra esperimenti e lotti di CSE, misurare l'assorbanza a 320 nm su uno spettrofotometro e definire la densità ottica (OD) di 1 come 100%8.
  6. Utilizzare il mezzo di differenziazione contenente un'adeguata concentrazione di CSE per stimolare le cellule epiteliali primarie delle vie aeree murine a rilevare gli effetti sulla differenziazione delle cellule.
  7. Lasciare che le cellule si differenzino per 28 giorni, durante i quali il mezzo della camera basale viene cambiato e il lato apicale viene lavato due volte a settimana rimuovendo il mezzo della camera apicale e sostituendo il mezzo della camera basale con il mezzo di differenziazione contenente la concentrazione appropriata di CSE.
  8. Analizza le cellule dopo l'esposizione.
    1. Dopo l'esposizione a un terreno di differenziazione contenente CSE, raccogliere le cellule e i surnatanti di coltura in qualsiasi momento (ad esempio, 0-28 giorni) per rilevare cambiamenti morfologici (ad esempio, saggio di immunofluorescenza (IFA) o colorazione con ematossilina-eosina (HE) o per procedure analitiche bioinformatiche (ad esempio, trascrittomica, proteomica, metabolomica, ecc.).

Risultati

Differenziazione
Le cellule epiteliali delle vie aeree murine si sono differenziate con successo dopo la coltura in un'interfaccia aria-liquido con un mezzo di differenziazione per 28 giorni. La presenza di cellule ciliate e caliciformi è stata dimostrata mediante saggio di immunofluorescenza del marcatore ciliale acetilato α-Tubulina (verde; Figura 3A) e il marcatore calicenico Mucin5AC, rispettivamente6 (rosso; Figura 3B).

Discussione

La BPCO è una comune malattia infiammatoria cronica delle vie aeree. L'esposizione al fumo di tabacco porta all'infiammazione cronica delle vie aeree, al rimodellamento delle vie aeree e alla distruzione strutturale dei polmoni, che è il risultato dell'interazione di varie cellule strutturali e cellule immunitarie10. In quanto prima linea del sistema immunitario innato nel polmone, le cellule epiteliali delle vie aeree svolgono un ruolo molto importante durante lo sviluppo della malattia

Divulgazioni

Gli autori non hanno nulla da rivelare.

Riconoscimenti

Questo studio è stato sostenuto dalla National Natural Science Foundation of China (82090013).

Materiali

NameCompanyCatalog NumberComments
100x Penicillin/Streptomycin solutionGibco15140122
24 mm Transwell with 0.4 µm Pore Polyester Membrane Insert, SterileBIOFILTCS016012
40 µm Cell StrainerFalcon352340
500x Gentamicin/Amphotericin SolutionGibcoR01510
acetylated α-TubulinCST#5335
Acetyl-α-Tubulin (Lys40) (D20G3)XP Rabbit mAb cellsignal#5335
Animal Component Free Cell Dissociation KitStemcell05426
Anti-pan Cytokeratin antibodyabcamab7753
CigaretteMarlboro
Claudin3immunowayYT0949
Deoxyribonuclase I from bovine pancreasSigma-AldrichDN25
Deoxyribonuclase I from bovine pancreasSigmaDN25
Ham’s F-12Sigma-AldrichN6658
Heparin Solution Stemcell07980
Hydrocortisone Stock SolutionStemcell07925
Mucin 5ACabcamab212636
Occludinproteintech27260-1-AP
PBSCytosciCBS004S-BR500
Penicillin-Streptomycin SolutionGibco15140122
PneumaCult-ALI
Basal Medium		Stemcell05002 
PneumaCult-ALI 10x SupplementStemcell05003 
PneumaCult-ALI Maintenance SupplementStemcell05006
PneumaCult-Ex Plus 50x SupplementStemcell05042
PneumaCult-Ex Plus Basal MediumStemcell05041
Pronase ESigma-AldrichP5147
Rat tail collagenCorning354236
Trypan BlueStemcell07050 

Riferimenti

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