Modello in vitro per lo studio del differenziamento e dei cambiamenti di multi-omiche su cellule epiteliali delle vie aeree murine stimolate con estratto di fumo di sigaretta

Riepilogo

Qui, descriviamo un modello in vitro per isolare e differenziare le cellule epiteliali delle vie aeree murine, concentrandosi sulla loro acclimatazione all'estratto di fumo di sigaretta cronico (CSE). Il modello potrebbe essere utilizzato per caratterizzare in modo completo l'impatto multi-omico della CSE, che potrebbe fornire informazioni sulle risposte cellulari in condizioni di esposizione cronica al fumo.

Abstract

La broncopneumopatia cronica ostruttiva (BPCO) è in gran parte attribuita all'esposizione al fumo di tabacco. Studiare come le cellule epiteliali delle vie aeree si adattano funzionalmente al fumo di tabacco è fondamentale per comprendere la patogenesi della BPCO. Il presente studio consisteva nella creazione di un modello in vitro utilizzando cellule epiteliali primarie delle vie aeree murine per imitare l'impatto del fumo di tabacco nella vita reale. A differenza delle linee cellulari consolidate, le cellule primarie conservano proprietà più simili a quelle in vivo, tra cui i modelli di crescita, l'invecchiamento e la differenziazione. Queste cellule mostrano una risposta infiammatoria sensibile e una differenziazione efficiente, rappresentando così da vicino le condizioni fisiologiche. In questo modello, le cellule epiteliali primarie delle vie aeree murine sono state coltivate per 28 giorni sotto un'interfaccia aria-liquido con una concentrazione ottimale di estratto di fumo di sigaretta (CSE), che ha portato alla trasformazione di un monostrato di cellule indifferenziate in un epitelio colonnare pseudostratificato, indicativo dell'acclimatazione al CSE. Sono state quindi applicate analisi multi-omiche complete per chiarire i meccanismi con cui la CSE influenza la differenziazione delle cellule delle vie aeree basali. Queste intuizioni forniscono una comprensione più profonda dei processi cellulari alla base della progressione della BPCO in risposta all'esposizione al fumo di tabacco.

Introduzione

La broncopneumopatia cronica ostruttiva (BPCO) è una condizione polmonare eterogenea con caratteristiche complesse, mentre i pazienti con BPCO tendono gradualmente ad essere più giovani¹. Il fumo, un fattore di rischio primario per la BPCO², ha un profondo impatto sulle cellule epiteliali delle vie aeree, che fungono da barriera iniziale contro il fumo di tabacco. Nonostante questa associazione nota, i meccanismi dettagliati attraverso i quali il fumo di tabacco induce cambiamenti nelle cellule epiteliali delle vie aeree rimangono inadeguatamente esplorati. Una comprensione approfondita di queste alterazioni molecolari è....

Protocollo

Il protocollo complessivo richiede 44 giorni, di cui 1 giorno per la preparazione delle cellule epiteliali delle vie aeree isolate da trachee murine, 15 giorni per la proliferazione cellulare e 28 giorni per la stimolazione CSE all'interfaccia aria-liquido. Tutti gli animali da esperimento sono ospitati nella SPF Barrier Animal Room dell'Animal Experiment Center della Capital Medical University e sono stati esaminati e approvati dall'Animal Experiment and Laboratory Animal Ethics Committee della Capital Medical University (AEEI-2020-100) per soddisfare i requisiti delle linee guida ARRIVE⁷.

1. Isolamento di cel....

Discussione

La BPCO è una comune malattia infiammatoria cronica delle vie aeree. L'esposizione al fumo di tabacco porta all'infiammazione cronica delle vie aeree, al rimodellamento delle vie aeree e alla distruzione strutturale dei polmoni, che è il risultato dell'interazione di varie cellule strutturali e cellule immunitarie¹⁰. In quanto prima linea del sistema immunitario innato nel polmone, le cellule epiteliali delle vie aeree svolgono un ruolo molto importante durante lo sviluppo della malattia

Materiali

Name	Company	Catalog Number	Comments
100x Penicillin/Streptomycin solution	Gibco	15140122
24 mm Transwell with 0.4 µm Pore Polyester Membrane Insert, Sterile	BIOFIL	TCS016012
40 µm Cell Strainer	Falcon	352340
500x Gentamicin/Amphotericin Solution	Gibco	R01510
acetylated α-Tubulin	CST	#5335
Acetyl-α-Tubulin (Lys40) (D20G3)XP Rabbit mAb	cellsignal	#5335
Animal Component Free Cell Dissociation Kit	Stemcell	05426
Anti-pan Cytokeratin antibody	abcam	ab7753
Cigarette	Marlboro
Claudin3	immunoway	YT0949
Deoxyribonuclase I from bovine pancreas	Sigma-Aldrich	DN25
Deoxyribonuclase I from bovine pancreas	Sigma	DN25
Ham’s F-12	Sigma-Aldrich	N6658
Heparin Solution	Stemcell	07980
Hydrocortisone Stock Solution	Stemcell	07925
Mucin 5AC	abcam	ab212636
Occludin	proteintech	27260-1-AP
PBS	Cytosci	CBS004S-BR500
Penicillin-Streptomycin Solution	Gibco	15140122
PneumaCult-ALI Basal Medium	Stemcell	05002
PneumaCult-ALI 10x Supplement	Stemcell	05003
PneumaCult-ALI Maintenance Supplement	Stemcell	05006
PneumaCult-Ex Plus 50x Supplement	Stemcell	05042
PneumaCult-Ex Plus Basal Medium	Stemcell	05041
Pronase E	Sigma-Aldrich	P5147
Rat tail collagen	Corning	354236
Trypan Blue	Stemcell	07050