Modelo in vitro para el estudio de la diferenciación y los cambios de las células epiteliales de las vías respiratorias murinas estimuladas con extracto de humo de cigarrillo

Resumen

En este trabajo describimos un modelo in vitro para aislar y diferenciar células epiteliales murinas de las vías respiratorias, centrándonos en su aclimatación al extracto crónico de humo de cigarrillo (CSE). El modelo podría utilizarse para caracterizar de forma exhaustiva el impacto multiómico de la CSE, lo que posiblemente proporcione información sobre las respuestas celulares bajo una exposición crónica al humo.

Resumen

La enfermedad pulmonar obstructiva crónica (EPOC) se atribuye en gran medida a la exposición al humo del tabaco. Investigar cómo las células epiteliales de las vías respiratorias se adaptan funcionalmente al humo del tabaco es crucial para comprender la patogénesis de la EPOC. El presente estudio consistió en establecer un modelo in vitro utilizando células epiteliales murinos primarias de las vías respiratorias para imitar el impacto del humo del tabaco en la vida real. A diferencia de las líneas celulares establecidas, las células primarias conservan más propiedades similares a las de in vivo, incluidos los patrones de crecimiento, el envejecimiento y la diferenciación. Estas células exhiben una respuesta inflamatoria sensible y una diferenciación eficiente, por lo que representan de cerca las condiciones fisiológicas. En este modelo, las células epiteliales murinos primarias de las vías respiratorias se cultivaron durante 28 días bajo una interfaz aire-líquido con una concentración óptima de extracto de humo de cigarrillo (CSE), lo que condujo a la transformación de una monocapa de células indiferenciadas en un epitelio cilíndrico pseudoestratificado, indicativo de aclimatación a la CSE. A continuación, se aplicaron análisis multiómicos exhaustivos para dilucidar los mecanismos por los que la EIS influye en la diferenciación de las células basales de las vías respiratorias. Estos conocimientos proporcionan una comprensión más profunda de los procesos celulares que sustentan la progresión de la EPOC en respuesta a la exposición al humo del tabaco.

Introducción

La enfermedad pulmonar obstructiva crónica (EPOC) es una enfermedad pulmonar heterogénea con características complejas, mientras que los pacientes con EPOC tienden gradualmente a ser más jóvenes¹. El tabaquismo, un factor de riesgo primario para la EPOC², tiene un profundo impacto en las células epiteliales de las vías respiratorias, que sirven como barrera inicial contra el humo del tabaco. A pesar de esta asociación conocida, los mecanismos detallados a través de los cuales el humo del tabaco induce cambios en las células epiteliales de las vías respiratorias siguen siendo inadecuadamente explorados. El conocimiento pr....

Protocolo

El protocolo general requiere 44 días, incluyendo 1 día para la preparación de células epiteliales de las vías respiratorias aisladas de tráqueas murinas, 15 días para la proliferación celular y 28 días para la estimulación de CSE en la interfaz aire-líquido. Todos los animales de experimentación se alojan en la Sala de Animales de Barrera SPF del Centro de Experimentos Animales de la Universidad Médica de Capital y han sido revisados y aprobados por el Comité de Ética de Animales de Laboratorio y Experimentos con Animales de la Universidad Médica de Capital (AEEI-2020-100) para cumplir con los requisitos de las pautas ARRIVE⁷.

Discusión

La EPOC es una enfermedad inflamatoria crónica común de las vías respiratorias. La exposición al humo del tabaco conduce a la inflamación crónica de las vías respiratorias, la remodelación de las vías respiratorias y la destrucción estructural de los pulmones, que es el resultado de la interacción de varias células estructurales y células inmunitarias¹⁰. Como primera línea del sistema inmune innato en el pulmón, las células epiteliales de las vías respiratorias juegan un papel muy.......

Materiales

Name	Company	Catalog Number	Comments
100x Penicillin/Streptomycin solution	Gibco	15140122
24 mm Transwell with 0.4 µm Pore Polyester Membrane Insert, Sterile	BIOFIL	TCS016012
40 µm Cell Strainer	Falcon	352340
500x Gentamicin/Amphotericin Solution	Gibco	R01510
acetylated α-Tubulin	CST	#5335
Acetyl-α-Tubulin (Lys40) (D20G3)XP Rabbit mAb	cellsignal	#5335
Animal Component Free Cell Dissociation Kit	Stemcell	05426
Anti-pan Cytokeratin antibody	abcam	ab7753
Cigarette	Marlboro
Claudin3	immunoway	YT0949
Deoxyribonuclase I from bovine pancreas	Sigma-Aldrich	DN25
Deoxyribonuclase I from bovine pancreas	Sigma	DN25
Ham’s F-12	Sigma-Aldrich	N6658
Heparin Solution	Stemcell	07980
Hydrocortisone Stock Solution	Stemcell	07925
Mucin 5AC	abcam	ab212636
Occludin	proteintech	27260-1-AP
PBS	Cytosci	CBS004S-BR500
Penicillin-Streptomycin Solution	Gibco	15140122
PneumaCult-ALI Basal Medium	Stemcell	05002
PneumaCult-ALI 10x Supplement	Stemcell	05003
PneumaCult-ALI Maintenance Supplement	Stemcell	05006
PneumaCult-Ex Plus 50x Supplement	Stemcell	05042
PneumaCult-Ex Plus Basal Medium	Stemcell	05041
Pronase E	Sigma-Aldrich	P5147
Rat tail collagen	Corning	354236
Trypan Blue	Stemcell	07050