Modelo in vitro para el estudio de la diferenciación y los cambios de las células epiteliales de las vías respiratorias murinas estimuladas con extracto de humo de cigarrillo

Resumen

En este trabajo describimos un modelo in vitro para aislar y diferenciar células epiteliales murinas de las vías respiratorias, centrándonos en su aclimatación al extracto crónico de humo de cigarrillo (CSE). El modelo podría utilizarse para caracterizar de forma exhaustiva el impacto multiómico de la CSE, lo que posiblemente proporcione información sobre las respuestas celulares bajo una exposición crónica al humo.

Resumen

La enfermedad pulmonar obstructiva crónica (EPOC) se atribuye en gran medida a la exposición al humo del tabaco. Investigar cómo las células epiteliales de las vías respiratorias se adaptan funcionalmente al humo del tabaco es crucial para comprender la patogénesis de la EPOC. El presente estudio consistió en establecer un modelo in vitro utilizando células epiteliales murinos primarias de las vías respiratorias para imitar el impacto del humo del tabaco en la vida real. A diferencia de las líneas celulares establecidas, las células primarias conservan más propiedades similares a las de in vivo, incluidos los patrones de crecimiento, el envejecimiento y la diferenciación. Estas células exhiben una respuesta inflamatoria sensible y una diferenciación eficiente, por lo que representan de cerca las condiciones fisiológicas. En este modelo, las células epiteliales murinos primarias de las vías respiratorias se cultivaron durante 28 días bajo una interfaz aire-líquido con una concentración óptima de extracto de humo de cigarrillo (CSE), lo que condujo a la transformación de una monocapa de células indiferenciadas en un epitelio cilíndrico pseudoestratificado, indicativo de aclimatación a la CSE. A continuación, se aplicaron análisis multiómicos exhaustivos para dilucidar los mecanismos por los que la EIS influye en la diferenciación de las células basales de las vías respiratorias. Estos conocimientos proporcionan una comprensión más profunda de los procesos celulares que sustentan la progresión de la EPOC en respuesta a la exposición al humo del tabaco.

Introducción

La enfermedad pulmonar obstructiva crónica (EPOC) es una enfermedad pulmonar heterogénea con características complejas, mientras que los pacientes con EPOC tienden gradualmente a ser más jóvenes¹. El tabaquismo, un factor de riesgo primario para la EPOC², tiene un profundo impacto en las células epiteliales de las vías respiratorias, que sirven como barrera inicial contra el humo del tabaco. A pesar de esta asociación conocida, los mecanismos detallados a través de los cuales el humo del tabaco induce cambios en las células epiteliales de las vías respiratorias siguen siendo inadecuadamente explorados. El conocimiento profundo de estas alteraciones moleculares es esencial para identificar marcadores de diagnóstico precoz y dianas terapéuticas para la EPOC.

Para abordar esta brecha, desarrollamos un nuevo modelo in vitro utilizando células epiteliales murinas de las vías respiratorias. Estas células se sometieron a una estimulación a largo plazo con extracto de humo de cigarrillo (CSE), lo que nos permitió monitorear los cambios celulares dinámicos y explorar los cambios en las células epiteliales de las vías respiratorias bajo la estimulación a largo plazo del tabaco y el mecanismo subyacente. En este modelo, se utilizó transwell para proporcionar la interfaz aire-líquido de las células epiteliales de las vías respiratorias, y el extracto de humo de cigarrillo se estimuló en la etapa temprana de la diferenciación de las células epiteliales hasta el final de la diferenciación a los 28 días. Los estudios anteriores investigaron solo la diferenciación y la estimulación a corto plazo de las células epiteliales de las vías respiratorias (dominancia de la línea celular). Se limitaron a una sola vía regulatoria 3,4,5,6. Sin embargo, el protocolo presentado aquí utiliza células epiteliales primarias de las vías respiratorias de ratón y optimiza el proceso de extracción celular para una mejor actividad celular que los métodos anteriores de cultivo de células epiteliales de las vías respiratorias. Este modelo se centra en las alteraciones en la diferenciación celular junto con análisis transcriptómicos, proteómicos, metabolómicos y epigenómicos exhaustivos. Empleando inmunofluorescencia y técnicas multiómicas avanzadas, nuestro objetivo fue dilucidar las respuestas celulares de las células epiteliales de las vías respiratorias a la exposición crónica al humo del tabaco, contribuyendo así a una comprensión más profunda de la patogénesis de la EPOC. Este modelo se puede utilizar para explorar los cambios en el patrón de diferenciación de las células epiteliales de las vías respiratorias y su mecanismo causado por la estimulación a largo plazo de diversos contaminantes.

Protocolo

El protocolo general requiere 44 días, incluyendo 1 día para la preparación de células epiteliales de las vías respiratorias aisladas de tráqueas murinas, 15 días para la proliferación celular y 28 días para la estimulación de CSE en la interfaz aire-líquido. Todos los animales de experimentación se alojan en la Sala de Animales de Barrera SPF del Centro de Experimentos Animales de la Universidad Médica de Capital y han sido revisados y aprobados por el Comité de Ética de Animales de Laboratorio y Experimentos con Animales de la Universidad Médica de Capital (AEEI-2020-100) para cumplir con los requisitos de las pautas ARRIVE⁷.

1. Aislamiento de células epiteliales primarias de las vías respiratorias murinas a partir de tráqueas murinos

1. Preparación
   1. Prepare el medio de expansión completo combinando 1 mL de suplemento 50x y 0,05 mL de caldo de hidrocortisona con 48,95 mL de medio basal de expansión. Conservar a 4 °C y utilizar durante 4 semanas.
   2. Disuelva 7,5 mg de proteinasa y 5 mg de desoxirribonucleasa I en 5 mL de Ham's F-12 para preparar una solución de proteinasa. Filtrar para esterilizar y almacenar a 4 °C y utilizar en un plazo de 4 semanas.
   3. Prepare soluciones antibióticas añadiendo 0,05 mL de 100x penicilina/estreptomicina y 0,01 mL de gentamicina/anfotericina 500x a 5 mL de medio de expansión completo, PBS, y solución de proteinasa (100 U/mL de penicilina, 100 U/mL de estreptomicina, 10 μg/mL de gentamicina y 0,25 μg/mL de anfotericina B). Conservar a 4 °C y utilizar durante 4 semanas.
   4. Esterilizar el instrumental quirúrgico y preparar el gabinete de seguridad biológica para el aislamiento celular. Al mismo tiempo, asegúrese de que el equipo de cultivo celular estándar esté listo para su uso.
   5. Prepare platos recubiertos de colágeno de cola de rata añadiendo colágeno de cola de rata (100 μg/mL en ácido acético 0,02 N) en platos de cultivo de 100 mm y transpocillos de 24 mm (0,05 mL/^cm2). Dejar abierto toda la noche bajo luz ultravioleta para su esterilización.
2. Aislamiento de células epiteliales primarias de la vía aérea murina
   1. Utilice ratones C57BL/6 (de 6 a 8 semanas de edad, machos, criados con SPF) para el aislamiento de células epiteliales traqueales. Eutanasia con sobredosis de solución de pentobarbital sódico al 1% (aproximadamente 200 mg/kg). Utilice cinco ratones para obtener un rendimiento celular suficiente.
   2. Esterilice el ratón por inmersión en una solución de etanol al 75%, sin sumergir la nariz y la boca en alcohol para evitar que el alcohol fluya hacia la tráquea.
   3. Disecciona el ratón.
      1. Use cuchillas quirúrgicas y fórceps, un conjunto de dispositivos para cortar y abrir la epidermis desde la mandíbula inferior hasta la cavidad abdominal del ratón.
      2. Use otro conjunto de instrumentos quirúrgicos para desgarrar las glándulas tiroides de ambos lados y eliminar las conexiones entre la tráquea, el tejido muscular circundante y el esófago.
      3. Después de eso, corte con cuidado en el tórax, use fórceps para profundizar en la cavidad torácica, extraiga todo el pulmón y encuentre el final de la tráquea.
   4. Procesa la tráquea.
      1. Cortar la tráquea desde el cartílago tiroideo hasta la rama traqueobronquial y ponerla en un medio de expansión pre-frío que contenga cuatro antibióticos.
      2. Agite el tubo para enjuagar la mayor cantidad de sangre posible de la superficie de la tráquea, manténgalo en hielo y luego comience la cirugía para el próximo ratón.
   5. Transfiera todas las tráqueas recolectadas a un tampón PBS prefrío que contiene cuatro antibióticos (200 U/mL de penicilina, 200 U/mL de estreptomicina, 20 μg/mL de gentamicina y 0,5 μg/mL de anfotericina B) para el pretratamiento antes de la digestión.
   6. Use un conjunto de instrumentos quirúrgicos para eliminar los coágulos y otros tejidos de las superficies de la tráquea, y luego córtelos en un tamaño de 1 cm² .
   7. Incubar el tejido traqueal en solución de proteinasa a 37 °C durante 40 min.
   8. Después de 40 minutos, agite el tubo varias veces y use un filtro de células de 40 μm para eliminar los tejidos restantes. Enjuagar las tráqueas picadas en un colador con 5 mL de medio de expansión, centrifugar la suspensión celular a 400 x g durante 5 min a 4 °C y desechar el sobrenadante.
   9. Resuspender las células obtenidas en 8 mL de medio de expansión.
   10. Cuente las células viables usando azul de tripán y un hemocitómetro.
   11. Suspensión celular en placa P0 en placas de 100 mm (1 x 10⁴ células vivas/^cm2) prerecubiertas con colágeno de cola de rata, y cultivo de las células en una incubadora a 37 °C, 5% CO₂.

2. Cultivo de expansión y paso de células epiteliales primarias de la vía aérea murina

1. Reemplace el medio para el cultivo de células P0 cada 3 días hasta que las células alcancen el 70%-80% de confluencia, generalmente dentro de los 6 días. En este punto, las células epiteliales tráqueales murinas pueden formar una monocapa intacta con apariencia de adoquín (Figura 1A-D).
2. Precaliente volúmenes suficientes de PBS, medio de expansión completo y kit de disociación celular sin componentes animales (ACF) a 37 °C.
3. Enjuague suavemente las células con 3 ml de PBS.
4. Realizar la disociación enzimática.
   1. Añadir 3 mL de solución de disociación enzimática ACF a la placa e incubar a 37 °C durante 5 min. Después del pipeteo, desaloje las células suavemente y transfiera la suspensión celular a 3 ml de solución de inhibición de la enzima ACF.
   2. Repita la adición de 3 ml de solución de disociación enzimática de ACF y vuelva a incubar durante 5 minutos para garantizar el máximo desprendimiento de células.
5. Girar la suspensión de celdas a 400 x g durante 5 min a 4 °C. Deseche el sobrenadante.
6. Vuelva a suspender las células en 1 mL de medio de expansión.
7. Cuente las células viables usando azul de tripán y un hemocitómetro.
8. Suspensión celular de placa P1 en varias placas de 100 mm (5 x 10⁴ células vivas/^cm2) pre-recubiertas con colágeno de cola de rata, y cultivo de las células en una incubadora a 37 °C, 5% CO₂.

3. Diferenciación y estimulación de CSE de células epiteliales murinas primarias de la vía aérea en la interfaz aire-líquido

1. Confirme el tipo de celda.
   1. Verificar el origen epitelial de las células aisladas mediante un ensayo de inmunofluorescencia (IFA) con anticuerpos contra citoqueratinas. Las células de semilla en portaobjetos de vidrio recubiertas por colágeno de cola de rata y usan paraformaldehído para fijarlas durante al menos 12 horas después de que las células alcancen el 80% de confluencia.
   2. Lave los portaobjetos 3 veces con solución de PBS durante 5 min y descárguelos con 3% de BSA y 0,1% de tritón X-100 en solución de PBS a temperatura ambiente (RT) durante 1 h.
   3. Incubar portaobjetos durante la noche a 4 °C con anticuerpo comercial anti-citoqueratina pan, a una dilución de 1:500.
   4. Al día siguiente, lavar los portaobjetos 3 veces con solución de PBS durante 5 min e incubarlos con tampón de anticuerpos secundarios a una dilución de 1:1000 en RT durante 2 h en la oscuridad.
   5. Después de la incubación, lavar los portaobjetos 3 veces con PBS (5 min por lavado) y añadirles DAPI a una dilución de 1:1000. Después de la incubación en RT durante 15 min, lave los portaobjetos una vez con PBS durante 5 min.
   6. Observe los portaobjetos bajo un microscopio de fluorescencia y compare los patrones de expresión con un control positivo (línea celular A549) y un control negativo (línea celular Raw264.7) (Figura 2).
2. Siembra las células para la diferenciación.
   1. Separe y centrifugue las células P2 como se ha descrito anteriormente, y vuelva a suspender el pellet de la célula en un volumen adecuado de medio de expansión para facilitar la siembra de 1 x 10⁴ células vivas/^cm2.
   2. Pipetear 1 mL de suspensión celular en la cámara apical del inserto de membrana de policarbonato transwell. Al compartimento basal del transpocillo, añadir 1,5 mL de medio de proliferación.
3. Incubar las células a 37 °C y cambiar completamente todo el medio en las cámaras basales y apicales cada 3 días utilizando medio de expansión hasta alcanzar la confluencia. Esto suele tardar entre 3 y 6 días.
4. Prepare 50 mL de medio de diferenciación completo agregando 5 mL de ALI 10x Supplement, 500 μL de ALI Maintenance Supplement, 100 μL de solución de heparina y 250 μL de solución madre de hidrocortisona a 44.15 mL de ALI Basal Medium.
5. Preparar la CSE.
   1. Burbujear un cigarrillo a través de 12,5 mL de medio de diferenciación y luego filtrarlo a través de un filtro de poros de 0,22 μm para preparar CSE. Para garantizar la estandarización entre experimentos y lotes de CSE, mida la absorbancia a 320 nm en un espectrofotómetro y defina la densidad óptica (OD) de 1 como 100%⁸.
6. Utilice el medio de diferenciación que contiene una concentración adecuada de CSE para estimular las células epiteliales murinos primarias de las vías respiratorias para detectar efectos sobre la diferenciación de las células.
7. Permitir que las células se diferencien durante 28 días, durante los cuales se cambia el medio de la cámara basal y se lava el lado apical dos veces por semana retirando el medio de la cámara apical y reemplazando el medio de la cámara basal con el medio de diferenciación que contiene la concentración adecuada de CSE.
8. Analice las células después de la exposición.
   1. Después de la exposición a un medio de diferenciación que contenga CSE, recoja las células y los sobrenadantes de cultivo en cualquier momento (es decir, 0-28 días) para detectar cambios morfológicos (es decir, ensayo de inmunofluorescencia (IFA) o tinción de hematoxilina-eosina (HE) o para procedimientos analíticos bioinformáticos (es decir, transcriptómica, proteómica, metabolómica, etc.).

Resultados

Diferenciación
Las células epiteliales murinas de las vías respiratorias se diferenciaron con éxito después de cultivarlas en una interfaz aire-líquido con un medio de diferenciación durante 28 días. La presencia de células ciliadas y caliciformes se demostró mediante el ensayo de inmunofluorescencia del marcador de cilios α-tubulina acetilada (verde; Figura 3A) y el marcador de células caliciformes Mucin5AC, respectivamente6 (rojo; Figura...

Discusión

La EPOC es una enfermedad inflamatoria crónica común de las vías respiratorias. La exposición al humo del tabaco conduce a la inflamación crónica de las vías respiratorias, la remodelación de las vías respiratorias y la destrucción estructural de los pulmones, que es el resultado de la interacción de varias células estructurales y células inmunitarias¹⁰. Como primera línea del sistema inmune innato en el pulmón, las células epiteliales de las vías respiratorias juegan un papel muy...

Materiales

Name	Company	Catalog Number	Comments
100x Penicillin/Streptomycin solution	Gibco	15140122
24 mm Transwell with 0.4 µm Pore Polyester Membrane Insert, Sterile	BIOFIL	TCS016012
40 µm Cell Strainer	Falcon	352340
500x Gentamicin/Amphotericin Solution	Gibco	R01510
acetylated α-Tubulin	CST	#5335
Acetyl-α-Tubulin (Lys40) (D20G3)XP Rabbit mAb	cellsignal	#5335
Animal Component Free Cell Dissociation Kit	Stemcell	05426
Anti-pan Cytokeratin antibody	abcam	ab7753
Cigarette	Marlboro
Claudin3	immunoway	YT0949
Deoxyribonuclase I from bovine pancreas	Sigma-Aldrich	DN25
Deoxyribonuclase I from bovine pancreas	Sigma	DN25
Ham’s F-12	Sigma-Aldrich	N6658
Heparin Solution	Stemcell	07980
Hydrocortisone Stock Solution	Stemcell	07925
Mucin 5AC	abcam	ab212636
Occludin	proteintech	27260-1-AP
PBS	Cytosci	CBS004S-BR500
Penicillin-Streptomycin Solution	Gibco	15140122
PneumaCult-ALI Basal Medium	Stemcell	05002
PneumaCult-ALI 10x Supplement	Stemcell	05003
PneumaCult-ALI Maintenance Supplement	Stemcell	05006
PneumaCult-Ex Plus 50x Supplement	Stemcell	05042
PneumaCult-Ex Plus Basal Medium	Stemcell	05041
Pronase E	Sigma-Aldrich	P5147
Rat tail collagen	Corning	354236
Trypan Blue	Stemcell	07050